מיקרוטנסיומטר למיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה של ממשקים דינמיים

Summary

כתב יד זה מתאר את התכנון וההפעלה של מיקרוטנציומטר/מיקרוסקופ קונפוקלי לביצוע מדידות בו-זמניות של מתח בין-פאזי וריאולוגיה של הרחבת פני השטח תוך הדמיית המורפולוגיה הבין-פאזית. זה מספק את הבנייה בזמן אמת של יחסי מבנה-תכונה של ממשקים חשובים בטכנולוגיה ובפיזיולוגיה.

Abstract

ספיחה של מולקולות פעילות על פני השטח לממשקי נוזל-נוזל נמצאת בכל מקום בטבע. אפיון ממשקים אלה דורש מדידת שיעורי ספיגה של חומרים פעילי שטח, הערכת מתחי פנים של שיווי משקל כפונקציה של ריכוז פעילי שטח בתפזורת, והתייחסות לאופן שבו מתח הפנים משתנה עם שינויים באזור הבין-חלקיקי לאחר שיווי המשקל. הדמיה סימולטנית של הממשק באמצעות הדמיה פלואורסצנטית עם מיקרוסקופ קונפוקלי במהירות גבוהה מאפשרת הערכה ישירה של יחסי מבנה-תפקוד. במיקרוטנסיומטר הלחץ הנימי (CPM), בועת אוויר המיספרית מוצמדת בקצה הנימים במאגר נוזלי בנפח 1 מ"ל. הלחץ הנימי על פני ממשק הבועה נשלט באמצעות בקר זרימה מיקרופלואידי מסחרי המאפשר לחץ מבוסס מודל, עקמומיות בועות או שליטה בשטח הבועה בהתבסס על משוואת לפלס. בהשוואה לטכניקות קודמות כגון שוקת Langmuir וירידת התליון, דיוק המדידה והבקרה וזמן התגובה משופרים מאוד; ניתן ליישם וריאציות לחץ נימיות ולשלוט בהן באלפיות השנייה. התגובה הדינמית של ממשק הבועה מוצגת באמצעות עדשה אופטית שנייה כאשר הבועה מתרחבת ומתכווצת. קו המתאר של הבועה מתאים לפרופיל מעגלי כדי לקבוע את רדיוס עקמומיות הבועה, R, וכן את כל הסטיות מהמעגליות שיבטלו את התוצאות. משוואת לפלס משמשת לקביעת מתח הפנים הדינמי של הממשק. לאחר שיווי המשקל, תנודות לחץ קטנות יכולות להיות מוטלות על ידי המשאבה המיקרופלואידית הנשלטת על ידי מחשב כדי לתנוד את רדיוס הבועה (תדרים של 0.001-100 מחזורים לדקה) כדי לקבוע את המודולוס המתרחב הממדים הכוללים של המערכת קטנים מספיק כדי שהמיקרוטנציומטר יתאים מתחת לעדשה של מיקרוסקופ קונפוקלי במהירות גבוהה המאפשר מעקב אחר מינים כימיים המתויגים באופן פלואורסצנטי באופן כמותי ברזולוציה צידית תת-מיקרונית.

Introduction

ממשקי אוויר-מים המכוסים על ידי סרטים פעילי שטח נמצאים בכל מקום בחיי היומיום. הזרקות מים פעילי שטח משמשות לשיפור התאוששות הנפט משדות מדולדלים ומשמשות כפתרונות שבירת הידראוליים לגז פצלי שמן ונפט. קצף גז-נוזלי ותחליב נוזלי-נוזלי נפוצים בתהליכים תעשייתיים ומדעיים רבים כחומרי סיכה וחומרי ניקוי והם נפוצים במזון. חומרים פעילי שטח וחלבונים בממשקים מייצבים את הקונפורמציות של נוגדנים במהלך^האריזה, האחסון והניהול 1,2,3,4,5, יציבות סרט הדמעות בעין ^6,7,8, ומכניקה ריאתית ^{9,10,11,12,13,14}, ¹⁵.

לחקר חומרים פעילים על פני השטח או חומרים פעילי שטח הסופחים לממשקים ולתכונותיהם יש היסטוריה ארוכה עם טכניקות ניסיוניות רבות ושונות 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . התפתחות אחרונה היא מיקרוטנסומטר לחץ נימי (CPM), המאפשר בחינה של תכונות בין-פרצופיות בממשקים מעוקלים מאוד, בסקאלות אורך קטנות בהרבה, תוך שימוש בחומרים נמוכים משמעותית משיטות נפוצות אחרות 9,23,24,25. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית (CFM) יכולה לשמש לחקר המורפולוגיה של שומנים וחלבונים בממשקי האוויר-מים ב-CPM²² או ב-Langmuir troughs 20,26,27,28,29. כאן שולבו CPM ו- CFM כדי לחבר תופעות מורפולוגיות לתכונות בין-תחומיות דינמיות ושיווי משקל כדי לפתח יחסי מבנה-פונקציה עבור ממשקים ביולוגיים וטכנולוגיים.

ישנם פרמטרים רבים בעלי חשיבות במערכות פעילי שטח בין-תחומיים הנגישות ל- CPM-CFM. ב- CPM, בועת אוויר בקוטר 30-200 מיקרומטר מוצמדת לקצה צינור נימי זכוכית. בגרסאות מוקדמות יותר של ה-CPM, הפרש הלחץ הנימי בין החלק הפנימי והחיצוני של הבועה נשלט באמצעות עמוד מים ומשאבת מזרק מתנד ^9,30 ; הגרסה החדשה המתוארת כאן מחליפה אותם במשאבה מיקרופלואידית מדויקת יותר, הנשלטת על ידי מחשב. מתח הפנים (γ) נקבע באמצעות משוואת לפלס, ΔP = 2γ/R, מירידת הלחץ על פני הממשק שנקבע על ידי המשאבה, ΔP, וניתוח אופטי של רדיוס העקמומיות של הבועה, R. ניתן לקבוע את מתח הפנים הדינמי של הממשק ברזולוציית זמן של 10 אלפיות השנייה לאחר יצירת בועה חדשה במגע עם נוזל בתפזורת המכיל חומר פעילי שטח מסיס. ניתן לתאר את דינמיקת הספיחה של פעילי השטח על ידי משוואת וורד-טורדאי הקלאסית^10,31 כדי לקבוע תכונות חיוניות של חומר פעילי השטח, כולל הדפיזור, כיסוי פני השטח והקשר בין ריכוז בתפזורת למתח פני השטח של שיווי המשקל. ברגע שמושג מתח פנים של שיווי משקל, ניתן לתנוד את האזור הבין-צדדי כדי למדוד את המודולוס המתרחב, על ידי רישום השינויים במתח הפנים, המושרים על ידי שינויים קטנים בשטח הפנים של הבועה, A³². עבור ממשקים מורכבים יותר המפתחים מבנים פנימיים משלהם כגון פולימרים או חלבונים סבוכים, מתח הפנים, , מוחלף על ידי מתח פני השטח הכללי יותר ^4,33, .

יציבות הריאות במהלך הנשימה עשויה להיות קשורה ישירות לשמירה הן על מתח פנים נמוך והן על מודולוס מתרחב גבוה בממשק האוויר-נוזל הנאדי ^9,10. כל משטחי הריאה הפנימיים מרופדים בסרט רציף בעובי מיקרון של נוזל רירית אפיתל כדי לשמור על הידרציה של הרקמות³⁴. נוזל רירית אפיתל זה הוא בעיקר מים, עם מלחים וחלבונים שונים אחרים, אנזימים, סוכרים וחומרים פעילי שטח של הריאות. כמו בכל ממשק מעוקל של אדי נוזל, לחץ נימי מושרה עם הלחץ הגבוה יותר בחלק הפנימי של הנאדיות (או הבועה). עם זאת, אם מתח הפנים היה קבוע בכל מקום בתוך הריאות, משוואת לפלס, ΔP = 2γ/R, מראה כי נאדיות קטנות יותר היו בעלות לחץ פנימי גבוה יותר ביחס לנאדיות גדולות יותר, מה שמאלץ את תכולת הגז של הנאדיות הקטנות יותר לזרום לנאדיות גדולות יותר בלחץ נמוך יותר. זה ידוע בשם "חוסר יציבות לפלס"^9,35. התוצאה נטו היא שהנאדיות הקטנות ביותר יתמוטטו ויתמלאו בנוזל ויתקשו לנפח אותן מחדש ולגרום לחלק מהריאה להתמוטט, וחלקים אחרים יתנפחו יתר על המידה, שניהם תסמינים אופייניים לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS). עם זאת, בריאה המתפקדת כראוי, מתח הפנים משתנה באופן דינמי כאשר ממשק נוזל האוויר-אפיתל באזור הבין-פאזי של הנאדיות מתרחב ומתכווץ במהלך הנשימה. אם , או , לחץ לפלס יורד עם ירידה ברדיוס ועולה עם הגדלת הרדיוס כדי לחסל את חוסר היציבות של לפלס, ובכך לייצב את הריאה⁹. לפיכך, , וכיצד זה תלוי בתדירות, מורפולוגיה והרכב חד שכבתי יותר, והרכב נוזל נאדי עשוי להיות חיוני ליציבות הריאות. ה- CPM-CFM סיפק גם את ההדגמות הראשונות של ההשפעות של עקמומיות בין-אישית על^{ספיחה פעילי שטח 25}, מורפולוגיה חד-שכבתית²² ומודולוס⁹ מרחיב. הנפח הקטן (כ-1 מ"ל) של המאגר ב-CPM מאפשר הקדמה, הסרה או החלפה מהירה של השלב הנוזלי וממזער את הכמות הנדרשת של חלבונים יקרים או חומרים פעילי שטח¹⁰.

הניגודיות בתמונת CPM-CFM נובעת מהתפלגות של שברים קטנים של שומנים או חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי בממשק^16,27. מונו-שכבות דו-ממדיות של פעילי שטח מפגינות לעתים קרובות הפרדת פאזה רוחבית כפונקציה של מתח פני השטח או לחץ פני השטח, π הוא ההבדל בין מתח הפנים של ממשק נוזל-נוזל נקי, γ₀, לבין ממשק מכוסה פעילי שטח, γ. ניתן לחשוב על π כ"לחץ " הדו-ממדי הנגרם על ידי אינטראקציות של מולקולות פעילי שטח בממשק הפועל להורדת מתח פני השטח הנוזלי הטהור. בלחצים נמוכים על פני השטח, חד-שכבתיים של שומנים נמצאים במצב לא מאורגן דמוי נוזל; זה ידוע כשלב הנוזל המורחב (LE). ככל שהלחץ על פני השטח עולה והשטח למולקולת השומנים פוחת, השומנים מכוונים זה עם זה ויכולים לעבור מעבר פאזה מסדר ראשון לשלב ^16,20,27 של נוזל מסודר לטווח ארוך (LC) שלב 16,20,27. שלבי LE ו- LC יכולים להתקיים יחד בלחצים שונים על פני השטח וניתן לדמיין אותם כאשר שומנים המתויגים באופן פלואורסצנטי אינם נכללים בשלב ה- LC ומופרדים לשלב LE. לפיכך, שלב LE בהיר ופאזת ה- LC כהה כאשר היא מצולמת עם CFM¹⁶.

מטרתו של כתב יד זה היא לתאר את הצעדים הדרושים לבנייה ולתפעול של המיקרוטנסומטר המשולב של המיקרוסקופ הקונפוקלי. זה יאפשר לקורא לבצע מחקרי ספיחה, למדוד מתח פנים, התנהגות ריאולוגית, ולבחון מורפולוגיה בין-פאזית בו-זמנית בממשק אוויר/מים או שמן/מים בקנה מידה זעיר. זה כולל דיון כיצד למשוך, לחתוך ולהידריפוביזציה של הנימים הנדרשים, הוראות לשימוש במצבי לחץ, עקמומיות ובקרת שטח פנים, והעברה בין-אישית של חומר פעילי שטח בלתי מסיסים לממשק המעוקל של מיקרוטנציומטר.

Protocol

1. הכנת צינורות נימיים

1. מקם את הנימים במשיכה נימית והפעל את תוכנית המשיכה הרצויה כדי ליצור שני נימים מחודדים בקוטר חיצוני (OD) של ~ 1 מיקרומטר בקצה.
   הערה: ה- OD של הנימים לפני המשיכה חייב להיות ה- OD שצוין כך שיתאים למחזיק הנימים בתא המיקרוטנציומטר. הקוטר הפנימי (ID) של הנימים יכול להשתנות, אך ישפיע על הרדיוס הקריטי של הנימים לאחר המשיכה. תוכנית משיכה נבחרת כך שהמחדד המתקבל מפחית בתחילה את ה- OD וה- ID הנימיים במהירות, לאחר מכן מגיע לרדיוס ליד ה- OD וה- ID הנימי הרצויים, ולאחר מכן מקטין את קוטרו לאט יותר. פעולה זו תיצור אורך נימי גדול יותר שניתן להבקיע כדי להניב נימים שמישים של 30-100 מיקרומטר במזהה.
2. הבקיע את קצה הנימים בנקודה הרצויה כדי לקבל מזהה של 30-100 מיקרומטר ולנתק את הקצה. לנימי יהיה כעת OD ו-ID של הרדיוס הרצוי בקצה (איור 1A). ניתן לאחסן את הנימים עד שלב 2.
   הערה: הקצה החתוך של הנימים חייב להיות הפסקה נקייה של 90°. כל פגם בקצה החתוך יוביל להצמדה גרועה של הבועה לנימיים ולמדידות שטח גרועות. קצוות נימי מחודדים עדינים מאוד. הם ייהרסו אם הם יבואו במגע עם כל דבר אחר מלבד הפתרונות (למשל, קירות בקבוקון, זרבובית אוויר).

2. הידרופוביזציה של נימים

1. לאסוף נימי זכוכית משוכים, תמיסת ניקוי חומצה, פינצטה מפלסטיק, מים שעברו דה-יוניזציה (DI), תמיסת הידרופוביזציה (2% סילאן באתנול), משאבת ואקום ותמיסת אתנול. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים.
   אזהרה: תמיסת ניקוי חומצה רעילה מאוד, גורמת לקורוזיה/גירוי בעור ובעיניים, מחמצנת. תמיסת הידרופוביזציה היא מגרה את העור/העין/הנשימה. לבשו מגן עיניים, מעילי מעבדה וכפפות ועבדו עם פתרונות במכסה אדים.
2. ניקוי חומצה את הנימים
   הערה: ניקוי חומצה של הנימים מסיר את כל השאריות האורגניות בתוך הנימים ומכין את משטח הזכוכית לתגובת הסילאניזציה שהופכת את הנימי להידרופובי.
   1. תפוס נימי בחוזקה ליד הקצה הרחב שלו עם הפינצטה.
   2. טובלים את הקצה המחודד בתמיסת הניקוי החומצית תוך חיבור הצינור ממשאבת הוואקום לקצה הרחב של הנימים. זה ישאב את הפתרון לתוך הנימים.
      הערה: ניתן לחבר קצה פיפטה לקצה הצינור הנימי כדי לאפשר התאמה טובה יותר עם הקצה הנימי.
   3. יש להפסיק כאשר תמיסת ניקוי החומצה מילאה כמחצית מהנימים.
      הערה: לאחר הסרת קצה הנימים מתמיסת ניקוי החומצה, התמיסה בחלק החיצוני של הנימים יוצרת לעתים קרובות חרוז ליד קצה הנימים. יש לגעת בעדינות בנימי הצוואר בצוואר בקבוקון התמיסה כדי להסיר עודפי תמיסה.
   4. אפשרו לתמיסת ניקוי החומצה להישאר בנימים לפחות 30 דקות, מה שמבטיח כי תקע הנוזל יישאר בקצה המחודד של הנימים.
   5. הסר את תמיסת ניקוי החומצה מהנימי על ידי החזקה חזקה של הנימים עם הפינצטה ושימוש בצינור הוואקום כדי למשוך את הנוזל מהקצה הגדול של הנימים.
3. לשטוף את הנימים
   1. הטביעו את הקצה המחודד של הנימים לתוך מי DI כדי להבטיח שהוא שקוע עמוק מספיק כדי לכסות את כל החלק החיצוני שהיה שקוע בתמיסת הניקוי החומצית. בזמן שהקצה שקוע, השתמשו בצינור הוואקום כדי למשוך מי DI דרך הנימים. הסר את הנימים מהמים והסר את המים הנותרים עם צינור הוואקום.
   2. חזור על השלב הנ"ל לפחות 4x.
4. בצע את שלב 2.3 נגד החלפת אתנול במי DI.
5. יש למרוח את היניקה ברציפות עד שהאתנול מתאדה לחלוטין מהפנים של הנימים. הנימים יהפכו לעכורים וקרירים למגע כאשר האתנול יתחיל להתאדות אך יתבהר לאחר 30 עד 45 שניות.
6. מצפים את הנימים בתמיסת ההידרופוביזציה
   1. לטבול בקצרה את הקצה הרחב של הנימים לתוך ~2% סילאן בתמיסת האתנול. פעולה נימית תגרום לתמיסת הציפוי לעלות בתוך הנימים. הסר את הנימים מהתמיסה לאחר שתקע בגודל של כ-1 ס"מ עלה בתוך הנימים.
   2. כיוון את הנימים כך שהקצה המחודד פונה כלפי מטה, ומאפשר לתמיסת הציפוי ליפול בכוח הכבידה לכיוון הקצה המחודד.
   3. אפשרו לתמיסת הציפוי להישאר בנימים לפחות 3 דקות.
      הערה: אסור שיהיו בועות אוויר בתקע של תמיסת הציפוי שנמצאת במגע עם פנים הקצה המחודד. אם יש בועת אוויר, סביר להניח שהפנים הנימיים לא התייבשו מספיק בשלב 2.5. כדי לתקן זאת, חזור על שלבים 2.4-2.6 לפי הצורך.
7. יש לשטוף את הנימים באתנול 1x באותו אופן כמו שלב 2.3.
8. הגדר את הציפוי ההידרופובי על הנימים
   1. מכניסים בקבוקוני נצנוץ נקיים ויבשים לתנור ואקום בטמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס. מניחים נימים מצופים לתוך הבקבוקונים (באופן אידיאלי נימי אחד לכל בקבוקון) עם קצוות רחבים המונחים על בסיס הבקבוקון. אפשר לנימים להישאר בתנור לפחות 6 שעות (עדיף לילה) כדי להשיג הדבקה קבועה של שכבת הסילאן ההידרופובית לנימים. ניתן לאחסן את הנימים עד שלב 4.

3. הכנה ואחסון לדוגמה

1. ערבבו ואחסנו תמיסות של חומרים פעילי שטח ופלואורופור בבקבוקונים נקיים שטופי חומצה כדי למנוע זיהום.
   הערה: שומנים זמינים מסחרית חייבים להיות בעלי הטוהר הגבוה ביותר ולאחסן אותם בין שימוש ב - 20 °C (74 °F). שומנים ישנים או מזוהמים גורמים לעיתים קרובות לתוצאות להיות קשות לשחזור.

4. הגדרת המיקרוטנסומטר

1. הרכיבו את תא ה-CPM כמתואר באיור 2.
   1. מניחים את הצד הגדול של הנימים בחלק העליון של תא ה-CPM עד שהוא נדחף אל החלק התחתון של התא.
   2. הידקו בעדינות את תקע ה-PEEK כדי לאבטח את הנימים, ולאחר מכן חברו את הצינור מהמשאבה המיקרופלואידית לצד הגדול של הנימים. היזהרו שלא לגעת בקצה הנימי המחודד.
2. לפי הצורך, חברו את צינורות חילופי המאגרים ו/או את צינורות בקרת הטמפרטורה לכניסות ולשקעים המתאימים בתא CPM (איור 2); אחרת, חבר את הכניסות והשקעים שאינם בשימוש.
3. חברו את תא ה-CPM לשלב המיקרוסקופ הקונפוקלי, ויישרו אותו בערך עם מטרת ה-CFM, מצלמת CPM ומקור האור CPM (איור 3).
4. פתח את זרימת הגז למשאבה המיקרופלואידית בלחץ ההפעלה המומלץ של המשאבה (150 mbar למשאבה המיקרופלואידית המשמשת כאן) וודא שהזרימה לנימי פתוחה.
5. התחל להפעיל את הממשק הווירטואלי של CPM (קובץ קידוד משלים 1: מיקרו-טנסיומטר Interface.vi וירטואלי) במצב בקרת לחץ כאשר תדירות תנודת הלחץ הנימית והמשרעת מוגדרות לאפס (איור 4-7). איור 4 מציג צילום מסך של הממשק הווירטואלי. עבור מי DI ורדיוס נימי של ~ 35 מיקרומטר, לחץ של ~ 20 mbar מבטיח כי שום מים לא נכנסים לנימים.
6. מלאו את תא ה-CPM במים באמצעות פיפטה.
7. התמקדו בקצה הנימי באמצעות מצלמת המיקרוטנציומטר.
8. התמקדו בקצה הנימי עם ה-CFM. אם יש קושי למצוא את הנימים, השתמש במצלמת CPM כדי למצוא את מטרת ה- CFM. זה יעזור להעריך את המרחק בין מטרת ה- CFM לבועה, תוך השגת מרחק העבודה הנכון.
9. לאחר שהאנולוס (היטל המגזר הירוק) מרוכז בבועה, כוונו את המיקוד באופן ידני כך שניתן יהיה לראות בבירור את קצה הבועה (איור 4-3).
   הערה: ניתן לכוונן את המיקום, זווית ההתחלה והסיום, והרדידי הפנימי והחיצוני של האנולוס באמצעות התפריט שמתחת לחלון התצוגה.
10. לחץ על Reset Bubble, וודא שנוצרה בועה חדשה (ניתן יהיה לשמוע את הבועה הישנה מתפוצצת, והבועה החדשה תהיה ניתנת לצפייה מחלון הצפייה בלוח הבקרה; איור 4-3). אם הבועה אינה מתפוצצת, הגדל את לחץ האיפוס או הגדל את זמן השהיית האיפוס בכרטיסיה איפוס בועות מתחת לחלון התצוגה. בדקו אם מתח הפנים הוא סביב 73 mN/m (עבור מלח או בועות מים/אוויר) (איור 4-9).
11. מוציאים את המים דרך המזרק הישיר לתא (איור 3-13), מרוקנים אותם ומחברים אותם מחדש. הדגימה מוכנה לטעינה כדי להריץ את הניסוי.

5. מחקר ספיחה

1. מלא את התא בדגימה הרצויה באמצעות פיפטה אוטוקלאבית ששומרת על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ . ודא שמתח הפנים הראשוני הוא סביב 73 mN/m כאשר נוצר ממשק בועות חדש.
2. קבעו את הרדיוס של הבועה החדשה שנוצרה והזינו את הערך הזה לתוך פקד האזור של קו האמצע (איור 4-7) ושנו את סוג הבקרה לבקרת שטח על-ידי לחיצה על הכרטיסיה בקרת שטח (איור 4-8).
   הערה: ניתן גם להשתמש בבקרת לחץ קבועה, אך הדבר גורם לרדיוס הבועה להשתנות ברציפות כאשר מתח הפנים של הממשק משתנה. אזור משתנה זה יכול לסבך את הניתוח של שיעורי הספיחה פעילי שטח ולגרום לבועה להתפוצץ במהלך המחקר.
3. התחל להקליט את הסרטון הקונפוקלי.
4. לחצו על איפוס בועת (איור 4-5), ולחצו מיד על איסוף נתונים (איור 4-6). נורית האיתות בכפתור תהפוך לירוקה.
5. התאם את קצב הקלטת הנתונים בהתאם לריכוז הדגימה על-ידי החלקת הפס המוצג באיור 4-6. לספיחות איטיות יותר, השתמש בקצב הקלטה איטי יותר. ניתן להתאים זאת באמצע ריצה אם רצוי קצב הקלטה גבוה יותר בשלב מוקדם, אך קצב איטי יותר עדיף על מחקרים ארוכים על מנת להקטין את גודל הקובץ.
6. לאחר סיום הניסוי (כאשר הושגה רמת מתח פני השטח הסופית), שמור את הקובץ על-ידי בחירת נתיב הקובץ הנכון (איור 4-1) ולחיצה על כפתור השמירה (איור 4-2).
7. עצור ושמור את ההקלטה גם ב- CFM.

6. מחקר תנודות/הרפיה

1. מלא את התא בדגימה באמצעות פיפטה שעברה בדיקה אוטומטית, תוך שמירה על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ . ודא שמתח הפנים הוא סביב 73 mN/m בעת יצירת ממשק בועות חדש.
2. המתן עד שהמדגם יספוג במלואו לממשק. ניתן לבצע זאת ישירות לאחר מחקר ספיחה במקום להתחיל מחדש עם ממשק בועה חדש.
3. החליטו אם תנודתיות תהיה תנודת לחץ, תנודת שטח או תנודת עקמומיות על ידי בחירת הכרטיסייה המתאימה (איור 4-8) והזנת הערך הבסיסי הרצוי, אחוזי התנודה ותדירות התנודה (איור 4-7).
   הערה: תנודות שטח גלים מרובעות, מרובעות ומשולש נגישות גם מהתפריט הנפתח בכרטיסייה תנודת שטח אחר .
4. התחל את ההקלטה של הסרטון הקונפוקלי ולחץ על איסוף נתונים (איור 4-6) בתוכנת CPM.
5. התחל את התנודה. הקפד לרשום לפחות שבעה מחזורים לקבלת התוצאות הטובות ביותר. בחר קצב רכישת נתונים (איור 4-6) כדי לתת מספר מספיק של נקודות נתונים עבור כל מחזור תנודה.
6. אם רצוי אמפליטודות או תדרים אחרים של תנודות, שנה את הערכים במהלך הניסוי.
7. שמור את התוצאות כמו בשלבים 5.6 ו- 5.7.

7. מחקר חילופי ממסים

1. מלאו את התא בדגימה באמצעות פיפטה שעברה בדיקה אוטומטית, תוך שמירה על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ. ודא שמתח הפנים הוא סביב 73 mN/m, כאשר נוצר ממשק בועות חדש.
   הערה: ניתן לבצע מחקרי ספיחה ו/או תנודה לפני מחקר חילופי הממסים.
2. חברו את צינור הכניסה עם בקבוק תמיסת ההחלפה הרצויה (איור 3-11) למשאבה הפריסטלטית (איור 3-10).
3. התחל את הקלטת הסרטון בתוכנת קונפוקל ולחץ על איסוף נתונים (איור 4-6) בתוכנת CPM.
4. הגדר את מהירות המשאבה הפריסטלטית. זה ישלוט על קצב חילופי הנוזלים ויש לבחור אותו על סמך הדרישות לניסוי, כלומר כמה מהר צריך להחליף את הממס.
5. אם יש צורך להחליף מספר נוזלים, יש לעצור את המשאבה הפריסטלטית ולחבר את הכניסה לתמיסת החלפה אחרת.
6. לאחר שהחילוף הסתיים (כ-20 דקות), שמרו את התוצאות כמו בשלבים 5.6 ו-5.7.

8. ספיחת פעילי שטח בלתי מסיסה

הערה: אם חומר השטח לספיחה אינו מסיס בנוזל המאגר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעביר מונו-שכבתי ממשק האוויר/מים של התא אל פני השטח של הבועה. ליפידים רבים היוצרים דו-שכבתיים הם כמעט בלתי מסיסים בתמיסת מלח ואינם נספגים באופן ספונטני בבועה כאשר הם תלויים בתמיסת המאגר.

1. מלא את התא בדגימה באמצעות פיפטה שעברה בדיקה אוטומטית, תוך שמירה על תוכנת CPM במצב בקרת לחץ . ודא שמתח הפנים הוא סביב 73 mN/m, כאשר נוצר ממשק בועות חדש.
2. להפקיד מונולאייר של חומר פעילי שטח בלתי מסיסים בממשק אוויר-מים של התא מתמיסה בתמיסה אורגנית נדיפה. באמצעות מזרק, הפקידו טיפות קטנות בממשק ואפשרו לממס להתאדות ולהשאיר את השומנים מאחור כסרט דק.
   אזהרה: כלורופורם משמש כממס לפוספוליפידים כגון פוספטידילכולינים וחומצות שומן. פתרונות התפשטות הם בדרך כלל 0.01-0.02 מ"ג של שומנים לכל מ"ל של הממס. כלורופורם הוא רעיל מאוד, יכול לגרום לגירוי בעור ובעיניים, והוא מסרטן. לבשו מגן עיניים מתאים, מעיל מעבדה וכפפות והכינו את התמיסה במכסה אדים.
3. הקטינו את שטח הפנים באמצעות בקרת הלחץ בקו האמצע (איור 4-7) של הבועה עד שהיא תהיה כמעט שטוחה. זה מונע מהבועה לצוץ לאחר שהחומר פעילי השטח נספג.
4. הסר את נוזל המאגר מהתא דרך המזרק הישיר לתא עד שממשק האוויר/מים יעבור מעבר לקצה הנימים. אמנם ניתן להשתמש במשאבת מזרק, אך ניתן להשיג שלב זה על ידי שימוש ידני במזרק.
5. הגדל את גובה נוזל המאגר לרמה הראשונית שלו.
   הערה: לאחר שהקצה יוצב מחדש, הבועה תהיה גדולה יותר בשל חומר פעילי השטח שנספג כעת בממשק. החד-שכבתי יהיה מוכן כעת לניסויים של החלפת ממסים או ממסים.

9. נקה

1. כבה את ה- CFM.
2. עבור למצב בקרת לחץ .
3. הסר את הדגימה מהתא באמצעות פיפטה. טען את התא במי DI והעלה את הלחץ ל~50 mbar כדי לגרום לבועות לברוח כל הזמן מהנימי ולנקות את קצה הנימים. חזור על תהליך זה 2x.
4. סגור את שסתום הבטיחות וכבה את ה- CPM על ידי לחיצה על הכפתור האדום בפינה השמאלית העליונה, כבה את לוח הבקרה של הלחץ באור ובכחול וסגור את מקור הלחץ.
5. הסר את התא משלב המיקרוסקופ הקונפוקלי. יש לשטוף את התא במי אתנול ו-DI. הסר את צינור הנימים מתא CPM.

10. ניקוי התא

1. לפרק את התא. מברישים את הקיר הפנימי עם מברשת שיניים תוך כדי שטיפה מתחת למי DI. הטביעו את החלקים באתנול וכתבו אותו במשך כ-30 דקות.
2. יש לשטוף את כל החלקים במי DI מספר פעמים. מייבשים את החלקים על ידי ניפוחם בגז חנקן או ייבושם בתוך תנור ואקום.

11. ניתוח תנודה

1. הפעל את קוד Dilatational_Rheology_Analysis.m (קובץ קידוד משלים 2), ובחר את הקובץ הרצוי שנשמר מהממשק הווירטואלי CPM. נתונים לדוגמה כלולים בקבצים המשלימים.
2. תרשים הלחץ לעומת הזמן יופיע כפי שמוצג באיור משלים 1. לחץ לחיצה שמאלית על הנקודה שבה התנודה מתחילה ולחץ שוב לחיצה שמאלית במקום שבו התנודה מסתיימת. אם הנתונים מכילים תנודות מרובות, חזור על תהליך זה עבור כל התנודות.
   1. כאשר כל נקודות ההתחלה והסיום נלחצו בלחיצה שמאלית, לחצו באמצעות לחצן העכבר באמצעות לחצן העכבר לחיצה ימנית בכל מקום. לדוגמה, כפי שמוצג באיור המשלים 1, ניתן ללחוץ לחיצה שמאלית בנקודות 1, 2, 3 ו-4, ולאחר מכן לחיצה ימנית.
      הערה: הקוד יחשב את המודולוס המתרחב ואת זווית הפאזה והתוצאות ייכתבו לקובץ .csv חדש במיקום הקובץ המקורי. את התוצאות עבור הנתונים לדוגמה ניתן לראות בתוצאות הקוד שניתנו בקובץ הקידוד המשלים 2. MATLAB גם תיצור מספר ייצוגים גרפיים של הנתונים כפי שמוצג באיור משלים 2.

Results

מקור עיקרי של טעות מדידה נובע מהנימים שיש להם פגמים בתהליך החיתוך (איור 5A,B) או מתהליך הציפוי (איור 5D). שני סוגי הפגמים מובילים לטעויות בקביעת הצורה והגודל של הבועה על ידי מערכת ניתוח התמונה האופטית, מה שמוביל לערכי מתח פנים לא מדויקים. חשוב לבחון בקפידה כל נימי חדש לאחר משיכתו וציפייתו תחת המיקרוסקופ האופטי לפני החדרת הנימים לתוך ה-CPM. יש להשליך נימי טעות, אך נימי מצופה בצורה גרועה יכולים להיות מנוקים בחומצה ומצופים מחדש כדי לשפר את הצמדת הב...

Discussion

ה-CPM/CFM המשולב הוא כלי רב עוצמה לבחינת דינמיקה בין-פאזית, שיווי משקל ומורפולוגיה. פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים לקבלת נתונים באמצעות CPM/CFM.

איור 2 מראה את עיצוב התא עם תעלות עבור הנימים, הממסים וחילופי החום שצוינו. הכניסה להחלפת ממסים צריכה להיות בתחתית התא בעוד שהשקע צריך להיות בחלק העליון, מה שמאפשר לתא לא לעלות על גדותיו במהלך ההחלפה. בפועל, קצבי הזרימה של הכניסה והיציאה עשויים להיות שונים במקצת עבור אותה משאבה פריסטלטית. אחת הבעיות הנפוצות בתכנון התא ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 O.D. צינורות טיגון	פישר מדעיים
A1RHD מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף מיקרוסקופ קונפוקלי	ניקון
		ניקוי חומצה	חומצה גופרתית ואלנוכרומיקס מדולל במים 50% בנפח, המתן עד שצלול לפני דילול
אלנוכרומיקס	אלקונוקס	2510	מעורבב עם חומצה גופרתית להוראות אריזה ומדולל להכנת תמיסת ניקוי חומצה
חותך זכוכית קרמי	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		פעילי שטח ריאות
Di Water			18.5 MΩ - ס"מ
אתנול	כל		הוכחה של 200 המשמש להידרופוביזציה, מפוגל המשמש לניקוי
Fiber-Lite דגם 190 תאורת סיבים	אופטיים דולן-ג'נר תעשיות בע"מ.	281900100	מקור אור; מקורות אור אחרים אמורים לעבוד גם כן
Flow EZ F69 mbar עם מודול Link	Fluigent	LU-FEZ-0069	משאבה מיקרופלואידית
Fluigent SDK VIs			נדרש עבור ממשק וירטואלי CPM
אטמי			מעובדים מגיליון ויטון בעובי 1 מ"מ, ראה איור 3
מסנן גז	Norgren	F07-100-A3TG	לשים בין משאבה מיקרופלואידית לווסת לחץ
ווסת גז	Norgren	10R0400R	מוריד לחץ מסקע לטווח המשאבה, מחובר לטווח מסנן גז 2-120 psi
זכוכית Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	זכוכית בורוסיליקט OD 1.5 מ"מ מזהה 0.86 מ"מ
זכוכית שקופית	כל		75 מ"מ x 25 מ"מ
מזרק זכוכית	המילטון	84878	25 μ מזרק זכוכית L
סוכן הידרופובי	סיגמא-אולדריץ'	667420	1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, ניתן להחליף טריאתוקסילן הידרופובי אחר חומר
פעילי שטח בלתי מסיס	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC בכלורופורם
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	מסנן 650 ננומטר Longpass, אורך גל חייב להסיר עירור תדירות לייזר
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S מערכת משאבת קונסול אנלוגית במהירות משתנה w/  ראש משאבה Easy-Load II	Masterflex	HV-77916-20	משאבה פריסטלטית
MATLAB	Mathworks		R2019
חולץ מיקרופיפטה P-1000	Sutter Instruments		חולץ נימי
תא מיקרוטנסיומטר ותא מחזיק			במכונה מ-PEEK, מחזיק במכונה מאלומיניום, ראה איור 3 ו-4
מיקרוטנסיומטר אובייקט	ניקון		פלואור 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 מ"מ
NI מודול פיתוח חזון	מכשירים לאומיים		נדרשים לממשק וירטואלי
CPM אביזרי אצבעות הדוקים	IDEX	F-120x	10-32 יציאות קונד
תקע	PEEK IDEX	P-551	10-31 יציאות קונד
קצות פיפטה	Eppendorf	22492225	100 μ L - 1000 μ L,
מלקחיים מפלסטיק	תרמו מדעי	6320-0010
מזרק פלסטיק	פישר סיינטיפיק	14-955-459	10 מ"ל
	שסתומים תלת כיווניים פישר סיינטיפיק וחלקי אינסטלציה אחרים לחיבור צינורות.
Research Plus ערוץ אחד 100 μ L– 1000 μ L	Eppendorf	3123000063	מיקרו פיפטר
חומצה גופרתית	כל		משמש לתמיסת ניקוי חומצה
T תוכנית SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 מ"מ	מיקרוסקופ קונפוקלי ניקון		אובייקטיבי
טקסס אדום DHPE מלח טריאתילאמונים	תרמו פישר מדעי	1395MP	פלואורופור
משאבת ואקום	Gast	DOA-P704-AA