פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ליזוזומים מתקשרים לעתים קרובות עם מגוון של ביומולקולות כדי להשיג את הפירוק ותפקודים תאיים מגוונים אחרים. ליזוזומים הם קריטיים לתפקוד המוח האנושי, מכיוון שתאי עצב הם פוסט-מיטוטיים ומסתמכים במידה רבה על מסלול האוטופגיה-ליזוזום כדי לשמור על הומאוסטזיס תאי. למרות ההתקדמות בהבנה של פונקציות ליזוזומליות שונות, לכידת התקשורת הדינמית ביותר בין ליזוזומים לרכיבים תאיים אחרים היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק עבור השיטה האנדוגנית (knock-in) ליזוזום קרבה תיוג פרוטאומית שפורסמה לאחרונה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC).
הן חלבוני ממברנה ליזוזומליים והן חלבונים המקיפים ליזוזומים ברדיוס של 10-20 ננומטר ניתנים לזיהוי בטוח ולכימות מדויק בנוירונים אנושיים חיים. כל שלב בפרוטוקול מתואר בפירוט, כלומר, תרבית נוירונים hiPSC, תיוג קרבה, קציר נוירונים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, העשרת חלבונים ביוטינילציה, עיכול חלבונים, ניתוח LC-MS וניתוח נתונים. לסיכום, שיטה ייחודית זו לתיוג קרבה ליזוסומלית אנדוגנית מספקת תפוקה גבוהה וכלי אנליטי חזק לחקר הפעילויות הליזוזומיות הדינמיות ביותר בנוירונים אנושיים חיים.
מבוא
ליזוזומים הם אברונים קטבוליים המפרקים מקרומולקולות דרך המסלול הליזוזומלי-אוטופגיה1. מלבד השפלה, ליזוזומים מעורבים במגוון תפקודים תאיים כגון התמרת איתותים, חישת חומרים מזינים והפרשת 2,3,4. הפרעות בתפקוד הליזוזומלי היו מעורבות בהפרעות אחסון ליזוזומליות, סרטן, הזדקנות וניוון עצבי 3,5,6,7. עבור נוירונים פוסטמיטוטיים ומקוטבים מאוד, ליזוזומים ממלאים תפקידים קריטיים בהומאוסטזיס תאי עצבי, שחרור מוליכים עצביים והובלה למרחקים ארוכים לא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים אושרו על ידי ועדת הבטיחות והאתיקה של אוניברסיטת ג'ורג' וושינגטון. הקומפוזיציות של מדיה ומאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מסופקות בטבלה 1. פרטי המוצר המסחרי המשמשים כאן מסופקים בטבלת החומרים.
1. תרבית נוירונים אנושית שמקורה ב-iPSC
- תרבית iPSC אנושית ושילוב גשושית LAMP1-APEX (7 ימים)
- הפשרת תמיסת מלאי של מטריגל בדלי קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, aliquot 500 μL של התמיסה לתוך צינורות סטריליים קרים, ולאחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת ציפוי של 50 מ"ל על ידי הוספת 500 μL של מלאי Matrigel לתוך 49.5 מ"ל של מדיום DMEM/F12 קר.
הערה: שמור על המטריגל ....
- הפשרת תמיסת מלאי של מטריגל בדלי קרח בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, aliquot 500 μL של התמיסה לתוך צינורות סטריליים קרים, ולאחסן את aliquots ב -80 מעלות צלזיוס. הכן תמיסת ציפוי של 50 מ"ל על ידי הוספת 500 μL של מלאי Matrigel לתוך 49.5 מ"ל של מדיום DMEM/F12 קר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מחקר זה של פרוטאומיקה לתיוג קרבה ליזוזום נערך בתאי עצב שמקורם ב-iPSC אנושי כדי ללכוד את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית באתרה בתאי עצב חיים. מורפולוגיות של תאים של hiPSCs ותאי עצב שמקורם ב-hiPSC בנקודות זמן שונות מודגמות באיור 2A. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים גדלים במושבות במדיום E8. ההתמיינות מתחילה על ידי ציפוי iPSCs למדיום אינדוקציה של נוירונים המכיל דוקסיציקלין. הרחבות נויריט הופכות גלויות יותר בכל יום במהלך ההבחנה בת 3 הימים. לאחר המעבר ללוחות מצופים אש"ף בתווך נוירונים, הנוי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באמצעות בדיקה זו של LAMP1-APEX, חלבונים על הממברנה הליזוזומלית ובסמוך לה עוברים ביוטינילציה ומועשרים. בהתחשב בקוטר הליזוזום הטיפוסי של 100-1,200 ננומטר, שיטה זו מספקת רזולוציה תוך-תאית מצוינת עם רדיוס תיוג של 10-20 ננומטר. LAMP1 הוא חלבון ממברנה ליזוזומלי בשפע וסמן קלאסי לליזוזומים, המשמש כחלבון פיתיון מצוין לתיוג APEX ליזוזומלי ברמת הביטוי האנדוגנית. עם זאת, מגבלות קיימות גם בעת שימוש ב-LAMP1 כדי להתמקד בליזוזומים, שכן LAMP1 קיים גם באנדוזומים מאוחרים וליזוזומים לא מתכלים35. רוב הסמנים הליזוזומלי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R01NS121608). A.M.F. מכיר במלגת פרק ARCS-Metro Washington ובמלגת קרן בורבון פ. סקריבנר. אנו מודים למעבדת מייקל וורד במכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) על התמיכה בביולוגיה מולקולרית ולפיתוח טכנולוגיית i3Neuron.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 10% (w/v) תמיסת ספונין | Acros Organics | 419231000 | מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| Accutase | Life | Technologies A1110501 תמיסת ניתוק תאים, תוסף תרבית תאים | |
| B27 | Fisher Scientific | 17504044 תרבית תאים, מדיום נוירון קליפת המוח | |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | תרבית תאים, מדיום נוירונים קליפת המוח |
| חומצה בורית | Sigma-Aldrich | B6768 | תרבית תאים, חוצץ בוראט |
| סרום בקר אלבומין | Millipore Sigma | A8806 | לייצור פתרונות סטנדרטיים למדידת ריכוזי החלבון הכוללים |
| מדיום עצבי Brainphys | STEMCELL Technologies | 5790 | תרבית תאים, נוירון קליפת המוח בינוני |
| CD45R (B220) נוגדן Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | מעכב מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| Chroman1 ROCK | Tocris | 716310 | מעכב תרבית תאים |
| cOmplete מיני פרוטאז | מעכב קוקטייל | Roche | 4693123001 |
| בדיקת חלבון DC Buffer Lysis II | Bio-Rad | 5000112 | לקביעת ריכוזי החלבון הכוללים של ליזאט תאים |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' | D8418 | תגובת תיוג |
| קרבה DMEM/F12 בינוני | פישר 11320082 | תרבית תאים, ציפוי צלחת | |
| DMEM/F12 מדיום עם HEPES | תרמו פישר תרבית תאים מדעית | 11330057 | , אינדוקציה בינונית |
| סרום חמור | סיגמא-אולדריץ' | D9663 | מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| דוקסיציקלין היקלט, ≥ 98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | תרבית תאים, אינדוקציה בינונית |
| חיונית 8 בינונית | תרמו פישר A1517001 מדעי | תרבית תאים | |
| חיוני 8 תוסף (50x) | תרמו פישר מדעי | A1517101 | |
| מיצוי צלחת ואקום ערכת סעפת | מים | WAT097944 | להתפלת פפטידים |
| חומצה פורמית (FA) | פישר סיינטיפיק | A11750 | לניתוח LC-MS |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | תרבית תאים, נוירון קליפת המוח |
| בינוני Hoechst צבע | תרמו פישר סיינטיפיק | 62239 | מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| HPLC כיתה מתנול | פישר מדעי | A452 | עבור התפלת פפטיד |
| HPLC כיתה מים | פישר מדעי | W5 | עבור פפטיד התפלה |
| תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם | מכון קוריל | GM25256 | תרבית תאים |
| מי חמצן, ACS, 29-32% w/w aq. soln., דקירה. | תרמו פישר מדעי | AA33323AD תיוג קרבה תגובה | |
| יודואצטמיד (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | לעיכול חלבון |
| למינין | פישר 23017015 | תרבית תאים מדעית, נוירון קליפת המוח בינוני | |
| LC-MS כיתה אצטוניטריל | פישר מדעי | A955 | לניתוח LC-MS |
| כיתה LC-MS | מים פישר מדעי | W64 | לניתוח LC-MS |
| L-גלוטמין | פישר סיינטיפיק | 25-030-081 | תרבית תאים, אינדוקציה בינונית |
| מטריג'ל | תרמו פישר סיינטיפיק | 08-774-552 | מטריצת קרום בסיס, תרבית תאים, ציפוי צלחת |
| עכבר אנטי אנושי LAMP1 נוגדן חד שבטי | מחקרי התפתחות בנק היברידומה | h4a3 | מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| N-2 תוסף ( 100x) | פישר סיינטיפיק | 17-502-048 | תרבית תאים, |
| קרום ניטרוצלולוזה בינוני אינדוקציה, חתוך מראש, 0.45 ומיקרו; m, 7 x 8.5 ס"מ | Bio-Rad | 1620145 | לביצוע בדיקת כתמי נקודות לטיטרציה |
| חרוזים חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | תרבית תאים, מדיום אינדוקציה |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | תרבית תאים, נוירון קליפת המוח בינוני |
| אואזיס HLB 96 בארות צלחת מיצוי שלב מוצק | מים | 186000309 | להתפלת פפטידים |
| מאגר חוסם אודיסיאה (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | לביצוע בדיקת כתמי נקודות לטיטרציה של חרוזים |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| פנול ביוטין (מלאי פי 1,000) | Adipogen | 41994-02-9 | תיוג קרבה |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום | Gibco | 10010049 | תרבית תאים, תגובת תיוג קרבה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| פירס בדיקת פפטיד קולורימטרי כמותי | תרמו פישר | 23275 | בדיקת ריכוז פפטידים |
| פולי-L-אורניתין (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | תרבית תאים, ציפוי צלחת |
| נתרן אסקורבט | סיגמא-אולדריץ' | A4034 | מאגר מרווה לתיוג קרבה, מאגר ליזה |
| נתרן azide | Sigma-Aldrich | S8032 | מאגר מרווה תיוג קרבה, מאגר ליזה, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית |
| נתרן כלורי | תרמו פישר תרבית תאים S271500 מדעית | , מאגר בוראט | |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | מאגר ליזה, מאגר בדיקת כתמי נקודות, מאגר שטיפת חרוזים |
| נתרן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | 415413 | תרבית תאים, מאגר בוראט |
| נתרן טטרבוראט | סיגמא-אולדריץ' | 221732 | תרבית תאים, מאגר בוראט |
| SpeedVac רכז | ואקום | ||
| סטרפטווידין חרוזי ספרוז מגנטיים | Cytiva (GE רשמי) | 28-9857-99 | העשרת חלבונים ביוטיניליים |
| סטרפטווידין, Alexa Fluor 680 מצומד | תרמו פישר מדעי | S32358 | לביצוע בדיקת כתמי נקודות לטיטרציה של חרוזים |
| מערבל מבוקר טמפרטורה | Thermomixer | ||
| חומצה טריפלואצטית (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | להתפלת פפטידים |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | לעיכול חלבון |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | מאגר ליזיס, מאגר בדיקת כתמי נקודות, מאגר שטיפת חרוזים |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | מאגר שטיפת חרוזים |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | מאגר מרווה לתיוג קרבה, מאגר ליזה |
| תערובת טריפסין/Lys-C, מפרט מסה | כיתה Promega | V5073 | לעיכול חלבון |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | מאגר בדיקת כתמי נקודות |
| אוריאה | תרמו פישר שטיפת BP169500 מדעית | חרוזים ומאגר עיכול על חרוזים | |
| ויטרונקטין | STEMCELL Technologies | 7180 | תרבית תאים, ציפוי צלחת |
| Y-27632 מעכב ROCK | Selleck | S1049 | תרבית תאים |
מקורות
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
