מאמר שיטה

תרביות צמחי רשתית אורגנוטיפיים מקופי מקוק

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64178

⸱

24 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yunnan Eye Institute & Key Laboratory of Yunnan Province, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center, Affiliated Hospital of Yunnan University, Yunnan University, 2Institute for Ophthalmic Research, Eberhard-Karls-Universität Tübingen

במאמר זה

סיכום

צמחי רשתית שהתקבלו מקופי מקוק מסוג בר תורבתו במבחנה. ניוון הרשתית ומסלול האיתות cGMP-PKG הושרו באמצעות מעכב PDE6 zaprinast. הצטברות cGMP בצמחים בריכוזי זפרינזט שונים אומתה באמצעות אימונופלואורסנציה.

תקציר

ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור. הפעלת יתר של מסלול החלבון המחזורי גואנוזין מונופוספט (cGMP) התלוי בקינאז (PKG) בתאי פוטורצפטור גורמת למוות של תאים קולטי אור, במיוחד במודלים המכילים מוטציות פוספודיאסטראז 6b (PDE6b). מחקרים קודמים על RD השתמשו בעיקר במודלים מורינים כגון עכברי rd1 או rd10 . בהתחשב בהבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים בין עכברים לבני אדם, חשוב להבין באיזו מידה ניתן להשוות את הרשתיות של פרימטים ומכרסמים. קופי מקוק חולקים רמה גבוהה של דמיון גנטי עם בני אדם. לכן, קופי מקוק מסוג בר (בגילאי 1-3 שנים) נבחרו לתרבית במבחנה של צמחי רשתית שכללה את קומפלקס אפיתל פיגמנט רשתית (RPE)-כורואידים. צמחים אלה טופלו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG ולדמות פתוגנזה של RD. הצטברות cGMP ומוות תאים בצמחי רשתית של פרימטים אומתו לאחר מכן באמצעות immunofluorescence ובדיקת TUNEL. מודל רשתית הפרימטים שנקבע במחקר זה עשוי לשמש למחקרים רלוונטיים ויעילים על המנגנונים של RD תלוי cGMP-PKG, כמו גם לפיתוח גישות טיפול עתידיות.

מבוא

ניוון רשתית תורשתי (RD) מאופיין במוות מתקדם של תאי קולטני אור ונגרם על ידי מוטציות במגוון רחב של גנים פתוגניים1. התוצאה הסופית של RD היא אובדן ראייה וברוב המכריע של המקרים המחלה נותרה בלתי ניתנת לטיפול עד עצם היום הזה. לכן, חשוב לחקור את המנגנונים התאיים המובילים למוות של קולטני אור באמצעות מודלים המייצגים נאמנה את מצב המחלה האנושי. כאן, מודלים מבוססי פרימטים מעניינים במיוחד בשל קרבתם לבני אדם. יש לציין כי מודלים כאלה עשויים לקדם את הפיתוח של התערבויות טיפוליות מתאימות שיכולות לעצור או לעכב מוות של תאים קולטי אור.

מחקרים קודמים על מנגנוני מוות תאי ב- RD הוכיחו כי ירידה או אובדן של פעילות פוספודיאסטראז 6 (PDE6) הנגרמת על ידי מוטציות בגן מפעיל RD מובילה להידרוליזה מופחתת של מונופוספט גואנוזין מחזורי (cGMP)2,3. cGMP הוא אגוניסט ספציפי של תעלות היונים המגודרות בנוקלאוטידים מחזוריים (CNGCs) במקטעים החיצוניים של המוט (ROSs) והוא גם מולקולת מפתח האחראית להמרת אותות אור לאותות חשמליים בתאי קולטני אור בעלי חוליות4. הידרוליזה מופחתת של cGMP גורמת להצטברות של cGMP ב-ROSs, מה שמוביל לפתיחת CNGCs 5. כתוצאה מכך, מסלולי פוטוטרנסדוקציה מופעלים, וכתוצאה מכך עלייה בריכוזי קטיון בתאים קולטי אור. תהליך זה מטיל עומס מטבולי על פוטורצפפטורים, אשר כאשר מופעלים יתר על המידה, למשל, על ידי מוטציות ב- PDE6, עלולים לגרום למוות תאי.

מחקרים רבים הראו כי הצטברות יתר משמעותית של cGMP בפוטורצפטורים של מודלים עכבריים עם מוטציות שונות בגן RD עלולה לגרום להפעלה של חלבון קינאז תלוי cGMP (PKG)3,6. זה מוביל לעלייה משמעותית בתאים גוססים, חיוביים TUNEL ודילול הדרגתי של שכבת התא photoreceptor. מחקרים קודמים מצביעים על כך שהפעלת יתר של PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות היא תנאי הכרחי ומספיק להשראת מוות תאי קולטני אור 2,5. מחקרים על מודלים שונים של RD בעכברים הראו גם כי הפעלת PKG הנגרמת על ידי רמות cGMP גבוהות בפוטורצפטורים, מובילה להפעלת יתר של גורמים משפיעים במורד הזרם, כגון פולי-ADP-ריבוז פולימראז 1 (PARP1), היסטון דאצטילאז (HDAC) וקלפין 2,7,8,9. זה מרמז על קשרים סיבתיים בין חלבוני מטרה שונים אלה לבין מוות של תאים קולטי אור.

עם זאת, מחקרים קודמים על פתולוגיה, טוקסיקופרקולוגיה וטיפול ב- RD התבססו בעיקר על מודלים של עכברים עבור RD10,11,12. עם זאת, נותרו קשיים עצומים בתרגום הקליני של תוצאות אלה. זאת בשל ההבדלים הגנטיים והפיזיולוגיים הניכרים בין עכברים לבני אדם, במיוחד בכל הנוגע למבנה הרשתית. לעומת זאת, פרימטים לא אנושיים (NHPs) חולקים גם רמה גבוהה של דמיון עם בני אדם ביחס למאפיינים גנטיים, דפוסים פיזיולוגיים וויסות גורמים סביבתיים. לדוגמה, טיפול אופטוגנטי נחקר כאמצעי לשחזור פעילות הרשתית במודלNHP 13. לינגאם ועמיתיו הדגימו כי ייצור טוב של תאים מקדימים של קולטני אור ברשתית שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עשוי להציל נזק לקולטני אור חרוט ב- NHP14. לכן, מודלים NHP חשובים לחקר פתוגנזה RD ופיתוח שיטות טיפול יעילות. בפרט, מודלים NHP של RD, המציגים מנגנונים פתוגניים דומים לאלה בבני אדם, יכולים לשחק תפקיד קריטי במחקרים על פיתוח וניתוח טוקסיקו-פרמקולוגיה in vivo של תרופות חדשות.

לאור מחזור החיים הארוך, הקשיים הטכניים הגבוהים והעלות הגבוהה הכרוכה בביסוס מודלים של פרימטים in vivo , הקמנו מודל של פרימטים לא אנושיים במבחנה (NHP) תוך שימוש בתרביות של רשתית מקוק מושתלת. ראשית, קופי מקוק מסוג בר בגילאי 1-3 שנים נבחרו לתרבית חוץ גופית של צמחי רשתית, שכללה את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואידים. לאחר מכן טופלו צמחים בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM) כדי לגרום למסלול האיתות cGMP-PKG. מוות תאי קולטני אור כומת ונותח באמצעות בדיקת TUNEL, והצטברות cGMP בצמחים אומתה באמצעות immunofluorescence. בהתחשב ברמת הדמיון הגבוהה ביחס לפיזור התאים ולמורפולוגיה, עובי שכבת הרשתית ומאפיינים פיזיולוגיים אחרים של הרשתית בין קופים לבני אדם, הקמת מסלול איתות cGMP-PKG במודל הרשתית במבחנה עשויה להקל על מחקר עתידי על הפתוגנזה של RD, כמו גם מחקרים על פיתוח וטוקסיקו-פרמקולוגיה של תרופות חדשות לטיפול ב- RD.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר בבעלי חיים נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (IACUC-PE-2022-06-002), וסקירת אתיקה של בעלי חיים ופרוטוקול בעלי חיים של אוניברסיטת יונאן (YNU20220149).

1. הכנת חצילים ברשתית

  1. השיגו גלגלי עיניים של פרימטים מקופי מקוק פראיים, בני שנה עד 3 שנים, אחסנו בתמיסת אחסון רקמות, והעבירו אותם על קרח תוך 3 שעות מרגע ההקרבה של הקופים או לאחר מוות טבעי.
  2. להכנת תמיסת פרוטאינאז K, ממיסים 25 מ"ג של פרוטאינאז K ב 250 מיקרוליטר של מים מזוקקים, ולאחר מכן מוסיפים 225 מיקרוליטר של התמיסה ל 18.5 מ"ל של מדיום בסיסי (R16).
  3. שטפו את גלגלי העיניים ב-10 מ"ל של 5% פובידון-יוד (פובידון-יוד: מים = 1:19) במשך 30 שניות וטבלו אותם במי מלח 5% פניצילין/סטרפטומיצין (PEN/STREP):p hosphate-buffered מלוחים = 1:19 למשך דקה אחת כדי למנוע זיהום חיידקי. לאחר מכן, לדגור את גלגלי העיניים ב 10 מ"ל של R16 בינוני במשך 5 דקות.
  4. מחממים מראש את תמיסת פרוטאינאז K באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לטבול את גלגלי העיניים ב 10 מ"ל של תמיסת proteinase K ולדגור במשך 2 דקות. לטבול את גלגלי העיניים בתמיסת 10 מ"ל של R16 + סרום בקר עוברי (1:1), לדגור במשך 5 דקות, ולאחר מכן להעביר את גלגלי העיניים ל 10 מ"ל של R16 טרי לשטיפה סופית.
  5. הפרידו את הסקלרה, הקרנית, הקשתית, העדשה וגוף הזגוגית, וחתכו את הרשתית מ-4 צדדים בעזרת פינצטה ומספריים (איור 1A-L).
  6. חותכים חצילי רשתית עם להבי טרפין לחמישה חלקים - להב טרפין 4 מ"מ לצד האף/טמפורלי/עליון/נחות ולהב טרפין 6 מ"מ לצד המרכזי (המכיל דיסק אופטי ומקולה; איור 1M-O). חתכו במרחק הבא מראש עצב הראייה: 1.5 מ"מ עבור האף, 4 מ"מ עבור הרקתי, ו -2 מ"מ עבור הצד העליון והתחתון.
  7. העבירו את צמחי הרשתית (המכילים רשתית וכורואיד) עם מדכא עפעפיים והניחו אותם במרכז החדרה, בצד הפוטורצפטור כלפי מעלה (איור 1P). יש להניח כ-1 מ"ל של מדיום מלא (R16 בתוספת BSA, טרנספרין, פרוגסטרון, אינסולין, T3, קורטיקוסטרון, ויטמין B1, ויטמין B12, רטינול, רטיניל אצטט, DL-טוקופרול, טוקופריל אצטט, חומצה לינולאית, L-ציסטאין הידרוכלוריד, גלוטתיון, גלוטמין, ויטמין C) מתחת לקרום על הצלחת כדי לכסות את הרשתית במלואה.

2. תרבית חציל רשתית פרימטים

  1. חציל רשתית תרבית בתווך מלא ומניחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס מאוורר עם לחות 5% CO2.
  2. יש למרוח טיפול תרופתי בריכוז מתאים על מדיום תרבית הרשתית (למשל, זפרינזט בריכוזים של 100 מיקרומטר, 200 מיקרומטר או 400 מיקרומטר). השתמש לפחות שלושה explants לכל תנאי טיפול ולהשתמש explants ללא תרופה כמו בקרה. לטפל עם התרופה במשך 4 ימים.

3. תיקון וחתך הקפאה

  1. לדגור על חצילים ברשתית עם 1 מ"ל של פאראפורמלדהיד (PFA) במשך 45 דקות, לשטוף אותם לזמן קצר עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן לדגור עם 10% סוכרוז במשך 10 דקות, 20% סוכרוז במשך 20 דקות, ו 30% סוכרוז במשך 30 דקות (1 מ"ל עבור כל חציל רשתית).
  2. חתכו צמחי רשתית באמצעות להבי טרפין כדי להבטיח עקביות בגודל הצמחים המתקבלים מאתרים שונים בעלי המאפיינים הבאים: ארבעה רבעים בפריפריה, 6 מ"מ במרכז. לאחר מכן, מעבירים את החצילים ברשתית לתוך קופסת פח (בערך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ) עם מדיום הטבעה של O.C.T כדי לכסות את הרקמה. מיד, להקפיא את קטעי הרקמה בחנקן נוזלי ומניחים במקרר -20 מעלות צלזיוס לאחסון.
  3. השתמשו בלהב חד כדי לחתוך את האגר לגוש קטן המכיל את דגימת הרקמה, חתכו את גושי הדגימה למקטעים של 10 מיקרומטר, והניחו אותם על שקופיות מיקרוסקופ הידבקות באמצעות מברשת רכה. לאחר מכן, יבש במשך 45 דקות ב 40 ° C ואחסן ב -20 ° C עד לשימוש.

4. אימונוהיסטוכימיה (איור 2)

  1. צביעת cGMP (תנאי ייצור נאותים)
    1. יבשו את המגלשות וציירו טבעת הידרופובית סביב חלקי הרשתית בעזרת עט חוסם נוזלים לכיסוי הדגימות.
    2. יש לטבול שקופיות ב-200 מיקרוליטר של מי מלח במאגר פוספט 0.3% ו-Triton X-100 לכל מגלשה (PBST) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בתמיסת חסימה (5% סרום חמור רגיל, 0.3% PBST, 1% BSA, 200 μL לכל מגלשה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    3. יש לדגור על הדגימות למשך הלילה עם הנוגדן הראשוני (1:250, כבשים נגד cGMP, 200 μL למגלשה) שהוכן בתמיסת החסימה בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 10 דקות (200 μL לכל שקופית) 3x.
    4. יש לדגור על הדגימות עם נוגדן משני (1:300, חמור נגד כבשים Alxea Fluor 488, 200 μL לכל מגלשה) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS במשך 10 דקות, 3x. כסו את הדגימות באמצעי הרכבה נגד דעיכה המכיל 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ואחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה.
  2. צביעת טונל
    1. יבשו את המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות וציירו טבעת מחסום דוחה מים סביב דגימות רקמת הרשתית בעזרת עט חוסם הנוזלים, ולאחר מכן דגרו עליהן ב-40 מ"ל PBS למשך 15 דקות.
    2. דגירה על שקופיות ב- 42 מ"ל (לכל חמש שקופיות) של TBS (0.05 M Tris-buffer) ב- 37 ° C. שאפו החוצה את ה-TBS, ודגרו על הדגימות עם 6 מיקרוליטר של פרוטאינאז K למשך 5 דקות. לאחר מכן, שטפו שקופיות 3x עם TBS במשך 5 דקות בכל פעם.
    3. חושפים את המגלשות ל-40 מ"ל של תמיסת אתנול-חומצה אצטית בשופלין, מכסים בסדין שקוף ודגרים בטמפרטורה של -20°C למשך 5 דקות. שטפו את המגלשות 3 פעמים עם TBS במשך 5 דקות בכל פעם.
    4. חשוף את המגלשות לתמיסת חסימה (1% BSA; 200-300 μL לשקופית לפי דרישה) ודגר בתא לחות למשך שעה אחת.
    5. הכינו את תמיסת ערכת TUNEL, TMR אדום, ביחס הבא: 62.50 μL של תמיסת חסימה (1% BSA), 56.25 μL של תמיסת תיוג (TMR-dUTP) ו-6.25 μL של האנזים (פרופורציה לכל שקופית). הוסף כ 130 μL של תמיסה זו לכל שקופית ודגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. לאחר מכן, שטפו את המגלשות עם PBS למשך 5 דקות (200 מיקרוליטר לכל שקופית), 2x.
    6. הניחו שקופיות כיסוי המכילות 1-2 טיפות של אמצעי הרכבה נגד דעיכה עם DAPI מעל הדגימות, ולאחר מכן דגרו על השקופיות בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות לפחות לפני ההדמיה.
  3. צביעת cGMP (תנאי ייצור נאותים) בשילוב צביעת טונל
    1. צביעת cGMP לוותה בצביעת טונל. בצע את השלבים של צביעת TUNEL משלב 4.2.1 לשלב 4.2.5, ולאחר מכן המשך את השלבים של צביעת cGMP משלב 4.1.2 לשלב 4.1.4.
  4. בצע מיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי עם פרמטרים של המצלמה באופן הבא: זמן חשיפה = 125 אלפיות השנייה, גודל החזר השקעה = 2752 x 2208, צבע = שחור-לבן. צלם תמונות באמצעות התוכנה. צייר ארבעה שדות שונים עם מצלמה דיגיטלית בהגדלה של 20x מכל קטע וקבל תמונות מייצגות מהאזורים המרכזיים של הרשתית באמצעות DAPI (465 ננומטר), EGFP (509 ננומטר), TMP (578 ננומטר), כאשר סריקת Z-Stack כוללת מרווח = 1 מיקרומטר ואופציונלי = 1.251 מיקרומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר זה, תרבית חציל רשתית של קופי מקוק בוצעה באמצעות צמחים המכילים את קומפלקס הרשתית-RPE-כורואיד (איור 1, איור משלים S1). בהשוואה לתרבית במבחנה של תאי רשתית המשתמשים ברשתית ללא RPE וכורואיד מחוברים, תרבית הצמחים שלנו מאפשרת הישרדות תאים טובה יותר ובהתאם לכך, מאריכה את הישרדותם של תאים קולטי אור.

השתמשנו בריכוזים שונים של מעכב PDE6 zaprinast (100 μM, 200 μM ו-400 μM; איור משלים S2) כדי לגרום להצטברות של cGMP בפוטורצפטורים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פוטוטרנסדוקציה חזותית מתייחסת לתהליך הביולוגי שבו אותות אור מומרים לאותות חשמליים על ידי תאים קולטי אור בתוך רשתית העין. תאים קולטי אור הם תאי עצב מקוטבים המסוגלים לבצע פוטוטרנסדוקציה, וישנם שני סוגים שונים של פוטורצפטורים המכונים מוטות ומדוכים על שם צורות המקטעים החיצוניים שלהם. מוטות אחראים על הראייה הסקוטופית ומדוכים אחראים על ראייה פוטופיקית וחדות גבוהה. RD תורשתי מתייחס למחלות נוירודגנרטיביות המאופיינות במוות מתקדם של תאי קולטני רשתית15.

המחקר הנוכחי על RD התבסס בע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81960180), קרן מורשת זינקה וקרן שרלוט וטיסטו קרסטן, המרכז הרפואי הקליני למחלות עיניים יונאן (ZX2019-02-01). אנו מודים לפרופ' לונגבאו לב (המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, קונמינג, סין) על שיתוף גלגלי העיניים של הקופים ששימשו במחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר אלבומין (BSA)SigmaB2064תמיסת חסימת
קורטיקוסטרוןסיגמאC2505תוספי תוספי
DL-טוקופרולסיגמאT1539שלם תוספי
חמור בינוני שלם נגד כבשים, Alxea Fluor 488Life technologies CorporationA11015נוגדן משני של cGMP (תנאי ייצור נאותים)
תמיסת אתנול-חומצה אצטיתShyuanyeR20492תיקון נוזלי
סרום בקר עוברימזל תאומים900-108תמיסת חסימה
מיקרוסקופ פלואורסצנטיCarl ZeissAxio Imager.M2הדמיה אימונופלואורסצנטית
גלוטמיןסיגמאG8540תוספי
גלוטתיוןשלם סיגמאG6013תוספים של
ערכת גילוי מוות תאים בינונית שלמה, בדיקת TMR אדומהRoche12156792910TUNEL
אינסוליןSigma16634תוספי
L-ציסטאין HClSigmaC7477תוספי
חומצה לינולאיתמלאה SigmaL1012MACS בינוני שלם
פתרוןMiltenyi130-100-008אחסון אופטימלי של דגימות איברים ורקמות טריות
סרום חמור רגילSolarbioSL050תמיסת חסימה
Paraformaldehyde (PFA)BiosharpBL539Aחומר קיבוע
PEN. / STREP. 100& פעמים;MilliporeTMS-AB2-Cפניצילין / סטרפטומיצין אנטיביוטיקה
מאגר פוספט מלח (PBS)SolarbioP1010תמיסת חיץ
פובידון-יודשנגחאי 310411חומר חיטוי
פרוגסטרוןסיגמאP8783תוספי
חלבוןK Millpore539480פירוק חלבון
R16 בינוניLife Technologies Corporation074-90743Aרטינול בינוני בסיסי
סיגמאR7632אצטט בינוני שלם
סיגמאR7882תוספי
כבשים בינוניות מלאות נגד cGMPיאן דה ונטה, אוניברסיטת מאסטריכט, הולנדנוגדן ראשוני של
סוכרוזcGMPGHTECH57-50-1חומר ייבוש
T3SigmaT6397תוספי תזונה של
מדיום רקמה-טק שלם (תרכובת O.C.T)SAKURA4583הטמעת מדיום
טוקופריל אצטטסיגמאT1157תוספי
טרנספריןסיגמאT1283מדיום מלא תוספי מדיום
מלאTranswellCorning Incorporated3412תרבית תאים / רקמות
Tris-buffer (TBS)SolarbioT1080מאגר חוסם
Triton X-100Solarbio9002-93-1חומר פעיל פני השטח
VECTASHIELD מדיום עם DAPIוקטורH-1200מדיום הרכבה
ויטמין B1SigmaT1270תוספי תזונה של מדיום שלם
ויטמין B12SigmaV6629תוספי ויטמין C בינוני מלא
סיגמאA4034תוספי תזונה של
ZaprinastSigmaZ0878PDE6
מלא Zeiss Imager M2 מיקרוסקופ  Zeiss, Oberkochen, גרמניהמיקרוסקופ זקוף
LSM 900 Airyscanמיקרוסקופ סריקת לייזר ברזולוציה גבוהה
Zeiss Axiocam  Zeiss, Oberkochen, גרמניהמצלמה דיגיטלית
Zeiss Axiovision4.7
Adobe
Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, סן חוזה, קליפורניה)
גלגלי עיניים של פרימטים מקוק מסוג ברמכון קונמינג לזואולוגיהSYXK (figure-materials-1) K2017 -0008
עט עט סופר פאפ (חוסם נוזלים, דיאדו, 0010, יפן
פתרון ערכת TUNEL (REF12156792910, רוש, גרמניה),
בינוני בינוני בינוני שלם בינונית תוספי אחסון רקמות בינוני שלם תוספי רטיניל מעכב בינוני

מקורות

  1. O'Neal, T. B., Luther, E. E. StatPearls. , StatPearls Publishing. Copyright 2022, StatPearls Publishing LLC (2022).
  2. Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration - Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772(2020).
  3. Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
  4. Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453(2019).
  5. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142(2014).
  6. Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
  7. Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
  8. Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24(2010).
  9. Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
  10. Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
  11. Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
  12. Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
  13. McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
  14. Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464(2021).
  15. Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
  16. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  17. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880(2021).
  18. Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
  19. Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440(2021).
  20. Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

cGMP PKGPDE6TUNEL

מאמרים קשורים