מאמר שיטה

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

DOI:

10.3791/64187

⸱

6 ביולי 2022

 ,  ,  , 
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP) הוא חלבון קושר mRNA המווסת את תרגום החלבון המקומי. אובדן FMRP או תפקוד לקוי מוביל לפעילות עצבית וסינפטית חריגה בתסמונת X שביר (FXS), המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות ובעיות תקשורת חברתית. מחקרים על תפקוד FMRP ופתוגנזה של FXS נערכו בעיקר עם Fmr1 (הנוקאאוט של FMRP המקודד גנים בבעלי חיים מהונדסים. כאן אנו מדווחים על שיטת in vivo לקביעת התפקוד האוטונומי של FMRP במהלך תקופת הרכבת המעגלים והיווצרות סינפטית באמצעות עוברי עוף. שיטה זו משתמשת באלקטרופורציה ספציפית לשלב, לאתר ולכיוון של מערכת וקטורית הניתנת להשראה לתרופות המכילה Fmr1 RNA קטן של סיכות שיער (shRNA) וכתב EGFP. בשיטה זו, השגנו נוק-דאון סלקטיבי של FMRP בגנגליון השמיעתי (AG) ובאחת ממטרות גזע המוח שלו, הגרעין מגנוצלולריס (NM), ובכך סיפקנו מניפולציה ספציפית לרכיב בתוך מעגל AG-NM. בנוסף, תבנית הפסיפס של ההעברה מאפשרת בקרות בתוך בעלי חיים והשוואות נוירונים/סיבים שכנים לאמינות ורגישות משופרות בניתוח נתונים. מערכת הווקטורים האינדוקטיביים מספקת בקרה זמנית על הופעת עריכת גנים כדי למזער את ההשפעות ההתפתחותיות המצטברות. השילוב של אסטרטגיות אלה מספק כלי חדשני לנתח את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP בפיתוח סינפטי ומעגלים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסמונת X שביר (FXS) היא הפרעה נוירו-התפתחותית המאופיינת על ידי מוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות והתנהגויות אוטיסטיות. ברוב המקרים, FXS נגרמת על ידי אובדן גלובלי של חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP; מקודד על ידי הגן Fmr1) החל משלבים עובריים מוקדמים1. FMRP הוא חלבון קושר RNA המתבטא בדרך כלל ברוב תאי העצב ותאי הגליה במוח, כמו גם באיברי החישה 2,3,4. במוחות של יונקים, FMRP קשור ככל הנראה למאות mRNA המקודדים חלבונים החשובים לפעילויות עצביות שונות5. מחקרים על חיות נוקאאוט Fmr1 קונבנציונליות הראו כי ביטוי FMRP חשוב במיוחד להרכבה ולפלסטיות של העברה עצבית סינפטית6. מספר מודלים של נוקאאוט מותנה ופסיפס הראו עוד כי פעולות ואותות FMRP משתנים בין אזורי מוח, סוגי תאים ואתרים סינפטיים במהלך מספר אירועים התפתחותיים, כולל הקרנה אקסונלית, דפוס דנדריטי ופלסטיות סינפטית 7,8,9,10,11,12,13,14 . תפקוד חריף של FMRP בוויסות ההעברה הסינפטית נחקר על ידי העברה תוך תאית של נוגדני FMRP מעכבים או FMRP עצמו בפרוסות מוח או נוירונים בתרבית15,16,17,18. עם זאת, שיטות אלה אינן מציעות את היכולת לעקוב אחר ההשלכות הנגרמות על ידי ביטוי שגוי של FMRP במהלך הפיתוח. לפיכך, פיתוח שיטות in vivo כדי לחקור את הפונקציות התאיות-אוטונומיות של FMRP הוא נחוץ מאוד, וצפוי לעזור לקבוע אם האנומליות המדווחות בחולי FXS הן השלכות ישירות של אובדן FMRP בנוירונים ובמעגלים הקשורים, או השלכות משניות הנגזרות משינויים ברחבי הרשת במהלך הפיתוח19.

גזע המוח השמיעתי של עוברי עוף מציע מודל בעל יתרון ייחודי לניתוחים תפקודיים מעמיקים של ויסות FMRP בהתפתחות מעגלים וסינפסות. הגישה הקלה למוחות של תרנגולות עובריות והטכניקה המבוססת היטב של אלקטרופורציה של אובו למניפולציה גנטית תרמו רבות להבנתנו את התפתחות המוח בשלבים עובריים מוקדמים. במחקר שפורסם לאחרונה, טכניקה זו שולבה עם כלים מולקולריים מתקדמים המאפשרים שליטה זמנית של ביטוי שגוי של FMRP20,21. כאן, המתודולוגיה מתקדמת כדי לגרום למניפולציות סלקטיביות של נוירונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים בנפרד. שיטה זו פותחה במעגל גזע המוח השמיעתי. אות אקוסטי מזוהה על ידי תאי שערה באוזן הפנימית השמיעתית ולאחר מכן מועבר לגנגליון השמיעתי (AG; נקרא גם גנגליון ספירלי ביונקים). נוירונים דו-קוטביים ב-AG innervates את תאי השערה עם התהליכים ההיקפיים שלהם, ובתורם שולחים הקרנה מרכזית (עצב השמיעה) לגזע המוח, שם הם מסתיימים בשני גרעיני שבלול עיקריים, הגרעין מגנוצלולריס (NM) והגרעין הזוויתי (NA). תאי עצב ב-NM דומים מבחינה מבנית ותפקודית לתאי השיח הכדוריים של גרעין השבלול האנטרו-בנטרלי של היונקים. בתוך ה-NM, סיבי עצב השמיעה (ANFs) סינפסה על הסומטה של נוירוני NM דרך הקצה הגדול של הדקים22. במהלך ההתפתחות, נוירונים NM נובעים מרומבומרים 5 ו -6 (r5/6) במוח האחורי23, בעוד נוירונים AG נגזרים נוירובלסטים השוכנים באוטוציסט24. כאן אנו מתארים את הפרוצדורה לדיכוי סלקטיבי של ביטוי FMRP בנוירוני AG הקדם-סינפטיים ובנוירוני NM הפוסט-סינפטיים בנפרד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביציות ועוברי תרנגולות טופלו בזהירות ובכבוד בהתאם לפרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ינאן.

1. הכנת ביצים ופלסמידים

  1. הכנת ביצים
    1. השיגו ביצי עוף מופרות טריות (Gallus gallus) מהאוניברסיטה החקלאית של דרום סין ואחסנו בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס לפני הדגירה. לקבלת כדאיות אופטימלית, קבעו את כל הביצים לדגירה תוך שבוע מהגעתן.
    2. מניחים ביצים בצורה אופקית ודוגרים בטמפרטורה של 38 מעלות צלזיוס למשך 46-48 שעות עד שלב המבורגר והמילטון (HH) 1225 להעברת התעלה העצבית, או למשך 54-56 שעות עד HH13 להעברת אוטוציזם. מכיוון שהקוטב החייתי של הביצה קל יותר מהקוטב הצמחי, מיקום אופקי ממקם את העובר על החלק העליון של הביצית למניפולציה קלה. היזהר כדי לשמור על הביצה אופקית זה ובכל השלבים הבאים.
    3. מיקום העובר מופיע כאזור כהה על קליפת הביצה בעת הטלת אור מתחתית הביצה באמצעות פנס. בשלבי HH הרצויים, השתמש בשיטת פנס זו כדי לסמן את מיקום העובר על קליפת הביצה בעיפרון.
    4. נגבו את הביצים בגזה המכילה 75% אתנול. קודחים חור בקצה המחודד של הביצים באמצעות קצה המספריים ומסירים 2 מ"ל אלבומין עם מזרק מחט 18 גרם. ודא שהחור גדול מספיק כדי לאפשר החדרת מחט. נגבו כל אלבומין דולף עם גזה וסתום את החור בנייר דבק שקוף.
    5. כדי למזער סדקים ולמנוע נפילת פסולת קליפה במהלך החלון, כסו את החלק העליון של הביצים בנייר דבק שקוף, ובמרכזו האזור הכהה המסומן בעיפרון.
  2. מיצוי דנ"א פלסמיד
    1. שיבוט עוף Fmr1 shRNA באמצעות מערכת Tet-on מבוססת טרנספוזון כפי שתואר קודםלכן 20. מערכת זו מכילה שלושה פלסמידים: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2, ו-pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, המספקים מערכת וקטורית הניתנת להשראה לתרופות שבאמצעותה הביטוי של Fmr1 shRNA ו-EGFP מושתק לאחר הטרנספקציה וניתן להפעיל אותו על ידי אינדוקציה של דוקסיציקלין (Dox).
      הערה: פלסמידים אלה אינם זמינים כעת במאגר. המחברים מסכימים לספק את הפלסמידים על פי בקשה סבירה.
    2. חלץ DNAs פלסמידים באמצעות ערכת הכנה ללא אנדוטוקסין על פי הוראות היצרן וזרז על ידי הוספת 1/15 נפח של 7.5 M נתרן אצטט ונפח אחד של 100% איזופרופנול.
    3. מזרזים פלסמידים בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה וצנטריפוגות בטמפרטורה של 13,000 x g למשך 10 דקות. ממיסים את הכדור עם חיץ Tris-EDTA המסופק בערכה לריכוז סופי של 4-5 מיקרוגרם/μL. ניתן לאחסן פלסמידים בטמפרטורה של -20°C למשך 12 חודשים ללא יעילות העברה מופחתת.
    4. ביום האלקטרופורציה, מערבבים היטב 2 μL מכל פלסמיד בצינור צנטריפוגה סטרילי באמצעות קצה פיפטה. הנפח המתקבל של 6 μL של תערובת הפלסמיד מספיק כדי לחשמל שלושה תריסר ביצים. כדי לעזור לדמיין את הפלסמיד במהלך האלקטרופורציה, הוסף 1 μL של 0.1% ירוק מהיר (מוכן ב ddH2O סטרילי) עבור כל 6 μL של תערובת DNA26, אשר הופך את תערובת פלסמיד כחול.

2. באלקטרופורציה של אובו

  1. חלון ביציות וזיהוי עוברים
    1. ביום של electroporation, להסיר את הביצים מן האינקובטור, תריסר ביצים בכל פעם. הרחקת ביצים מהאינקובטור שלהן למשך יותר משעה גורמת לשינויים התפתחותיים ומפחיתה את הכדאיות.
    2. נגב את כל כלי הניתוח עם גזה המכילה 75% אתנול.
    3. מניחים כל ביצה במחזיק קצף בהתאמה אישית. נגבו את האזור המכוסה בנייר דבק ב-75% אתנול וחתכו חלון (1-2 ס"מ2) סביב היקף סימן העיפרון באמצעות זוג מספריים קטן (איור 1A). בעת החיתוך, החזיקו את המספריים שטוחים כדי למנוע פגיעה בעובר שמתחת.
    4. מניחים את ביצית החלון מתחת לסטריאומיקרוסקופ עם עינית 10x וזום 2x ומזהים את העובר. התאם את הזווית והבהירות של מקור האור לתצוגה חזותית טובה יותר.
      הערה: נדרש תרגול וניסיון כדי לדמיין את העובר ולזהות את הצינור העצבי בשלב זה.
      1. למתחילים, השתמש בהזרקת הדיו האופציונלית הבאה כדי להקל על זיהוי העובר. הכן מראש תמיסת דיו הודי של 10% בתמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) ואוטוקלאב בנפח 0.01 M. מלא מזרק של 1 מ"ל בתמיסת הדיו ולאחר מכן התאם מחט 27G. כופפו את המחט לזווית של 45° בעזרת מלקחיים.
      2. מתחת למיקרוסקופ, לתקוע בזהירות מקצה האופקה באזור ולהחדיר את המחט מתחת לעובר. להזריק ~ 50 μL של דיו, אשר יתפזר מתחת לאזור pellucida להדמיית העובר. הדיו יהווה רקע כהה להדמיה ברורה של העובר.
        הערה: יש להוציא את האוויר מהמזרק לפני ההחדרה וההזרקה. כאשר אתה מיומן בהדמיה חזותית, הימנע משלב הזרקת הדיו מכיוון שהוא מפחית את שיעור ההישרדות.
  2. הזרקת צינורות עצביים ואלקטרופורציה
    הערה: הליך זה מבוצע ב- HH12 עבור טרנספקציה של נוירוני NM בגזע המוח.
    1. משוך נימי זכוכית (~ 1 מ"מ קוטר ו 100 מ"מ אורך) לתוך פיפטות באמצעות מושך פיפטה. תחת מיקרוסקופ ניתוח, בזהירות לפתוח את קצה המחט נימי לקוטר 10-20 מיקרומטר עם מלקחיים. אחסנו את הפיפטות (בדרך כלל 5-10 בבת אחת) בקופסת אחסון עד לשימוש.
    2. מלאו פיפטה נימית עם 0.5-1 μL של תערובת פלסמיד על ידי הפעלת לחץ שלילי דרך צינור גומי בסוף הפיפטה. זה יכול להיות מושגת על ידי מזרק או משאבת אוויר.
    3. מניחים את הביצית מתחת למיקרוסקופ כך שהעובר מכוון אנכית עם הזנב קרוב אליכם (או אופקית להזרקת פיפטות נימיות באמצעות מניפולטור בעל שלושה צירים). החזיקו את הפיפטה הנימית ביד אחת או עם מניפולטור שלושת הצירים והניעו את קצה הפיפטה ל-r5/6 בכיוון זנב-אל-ראש.
      הערה: אזור המוח האחורי הקדמי ביותר הוא r1 וכל בליטה עוקבת לאורך הצינור העצבי היא רומבומרה בודדת. R5/6 נמצא באותה רמה אנטרופוסטרית כמו האוטוציסט, שהוא מבנה דמוי שניתן לזהותו בקלות (איור 1B-C).
    4. בעדינות לדחוף את הקצה דרך קרום vitelline לתוך הצינור העצבי הגבי ולאחר מכן למשוך את פיפטה קצת כך הקצה הוא לומן של הצינור העצבי. הזריקו את תערובת הפלסמיד על ידי הפעלת לחץ אוויר עד שהפלסמיד הכהה מתפזר במלואו ל-r5/6 ומתרחב ל-r3 ו-r4.
      הערה: אין צורך לבצע חריץ על קרום vitelline להזרקה.
    5. בדקו אם יש הזרקה מוצלחת, שמושגת כאשר תמיסת הפלסמיד הכחולה מתפזרת במהירות במורד התעלה העצבית מבלי לדלוף (איור 1B-C). כאשר מתרחשת דליפה, הכחול דוהה במהירות.
    6. מיד לאחר ההזרקה, הניחו אלקטרודת פלטינה דו-קוטבית משני צדי התעלה העצבית (איור 1D). ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה באמצעות אלקטרופורטור. שימו לב לבועות אוויר בקצות האלקטרודה הדו קוטבית, עם יותר בצד השלילי.
    7. בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כהה נכנס לרקמת הצינור העצבי ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר אלקטרופורציה, להסיר בזהירות את האלקטרודה דו קוטבית.
    8. מכסים את החלון על קליפת הביצה בחתיכת סרט שקוף שנחתך מראש ל-2 ריבועים ומרוסס ב-75% אתנול. החזירו את הביצה לאינקובטור שלה.
    9. נקו את האלקטרודה הדו-קוטבית על ידי העברת 10-20 פולסים של 12 וולט ו-50 מילישניות במי מלח לפני שתמשיכו לביצה הבאה.
  3. הזרקת אוטוציסט ואלקטרופורציה
    הערה: הליך זה מבוצע ב- HH13 עבור טרנספקציה של תאי שיער ונוירוני AG באוזן הפנימית.
    1. ב- HH13 (שהוא ~יום עוברי 2.5), העובר הסתובב כך שהצד הימני של הראש פונה כלפי מעלה. מתחת למיקרוסקופ, מניחים את הביצית כך שהעובר יהיה אנכי, כשהזנב קרוב אליכם. החזיקו את הפיפטה הנימית ודחפו בעדינות את האוטוציסטה הימנית בכיוון הגבי (איור 2A).
      הערה: בשלב זה, האוטוציסט מופיע כמבנה מעגלי קטן בחלק העליון של הגוף באותה רמה אנטרופוסטרית כמו r5/6.
    2. מזריקים את תערובת הפלסמיד בלחץ אוויר עד שהאוטוציסט מתמלא בתמיסה כחולה27. בדוק אם יש הזרקה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת הפלסמיד הכחול כלואה בתוך האוטוציסט ואינה דולפת.
    3. מיד לאחר ההזרקה, הניחו את האלקטרודה הדו-קוטבית על האוטוציסט כפי שמתואר באיור 2B. מקם את הצדדים החיוביים והשליליים הקדמיים והאחוריים לאוטוציסט, בהתאמה. ספק שתי פעימות של 12 וולט ומשך 50 אלפיות השנייה עם האלקטרופורטור.
    4. בדוק אם אלקטרופורציה מוצלחת, אשר מושגת כאשר תערובת פלסמיד כחול נכנס לרקמה של otocyst ליד הצד החיובי של האלקטרודה. לאחר אלקטרופורציה, להסיר בזהירות את האלקטרודה דו קוטבית. מכסים את החלון על קליפת הביצה בסרט שקוף ומחזירים את הביצה לאינקובטור.

3. ניהול דוקס ליזום ולתחזק תמלול פלסמיד

  1. הכנת תמיסת דוקס
    1. מדוד 100 מ"ג של אבקת Dox מתחת למכסה מנוע כימי והמיס אותה ב-100 מ"ל של PBS סטרילי כדי ליצור תמיסת עבודה של 1 מ"ג/מ"ל. סנן את התמיסה עם מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C. הגנה מפני אור20,28.
  2. המינהל של דוקס
    1. לעריכת גנים בעוצמה מלאה, 24 שעות לפני הגיל הרצוי, הפשירו אליקוט דוקס על קרח. זרוק 50 μL של דוקס ישירות על הקרום chorioallantoic של הביצה באמצעות מזרק חודר את הסרט שקוף. אטמו את חור המחט עם סרט שקוף או סרט לאחר ההזרקה.
    2. כדי לשמור על אפקט ההדחה, יש לתת את Dox אחת ליומיים עד לקצירת הרקמות בשלב ההתפתחותי הרצוי.

4. דיסקציה וחתך רקמות

  1. גזע המוח
    1. עבור עוברים בשלב עוברי 3 (E3) ו- E6, לפתוח את קליפת הביצה לחתוך את הקרום הקשור עם מספריים. הוציאו את העובר החוצה וטבלו אותו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במאגר פוספט של 0.1 M.
    2. עבור עוברי E9, פתחו את קליפת הביצה, ערפו את העובר במספריים והעבירו את הראש לצלחת עם תחתית סיליקון מלאה ב-PBS. מצמידים את הראש למטה דרך המסלולים וחותכים את החלק העליון של הגולגולת לגזרים. מניחים בזהירות את המלקחיים מתחת למוח משני הצדדים ומרימים את המוח כולו מהגולגולת עם כתפי המלקחיים. לטבול את המוח ב-4% PFA.
    3. עבור עוברי E15 ו-E19, פתחו את קליפת הביצה, ערפו את העובר במספריים והניחו את הראש על צלחת עם תחתית סיליקון מלאה ב-PBS. חותכים לפתוח את העור על גבי הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
    4. חותכים דרך הגולגולת אנכית עם סכין גילוח כדי להפריד בין המוח הקדמי לבין המוח הקאודאלי. לטבול את הבלוק caudal ב PBS, להסיר את החלק העליון של הגולגולת, ולאחר מכן לקחת את המוח מן הגולגולת.
    5. הצמד את המוח למטה דרך האונה האופטית והפרד את המוח הקטן ואת גזע המוח. היזהר לא לפגוע בגזע המוח השמיעתי, אשר ממוקם ממש מתחת למוח הקטן. הסר כמה שיותר דורה מגזע המוח ולאחר מכן טבל אותו ב-4% PFA.
    6. שמור על עוברים ורקמות מוח ב-4% PFA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, למעט גזעי מוח E19, אותם יש לשמור באותו מצב במשך 24 שעות.
    7. לאחר קיבוע, לייבש את הרקמה ב- PBS המכילה 30% סוכרוז עד שהיא שוקעת, מה שבדרך כלל לוקח 1-3 ימים, תלוי בגיל.
    8. חתכו את גזע המוח (E15 ו-E19) ב-30 מיקרומטר במישור הקורונלי באמצעות מיקרוטום מחליק. לאסוף חלקים ב- PBS ולאחסן ב 4 °C לפני immunostaining.
    9. עבור עוברי E3 ו- E6 וגזעי מוח E9, חתך ב 50 מיקרומטר רוחבי. לאסוף חלקים PBS ולאחסן ב 4 °C (64 °F). הרכיבו את החלקים על גבי שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין לפני החיסון. איסוף חתכים עבים יותר לגילאים אלה מקל על הטיפול ברקמות.
  2. צינור השמיעה
    1. לאחר הסרת גזעי המוח מעוברי E9, E15 ו- E19, צינור השמיעה, המוטבע בעצם הטמפורלית, ניתן לזיהוי בקלות שוכב מתחת לגולגולת, והעצם הטמפורלית ניתנת להפרדה בקלות מהגולגולת שמסביב. עבור עוברי E9, תקן את כל העצם הטמפורלית ב-4% PFA. עבור עוברים מבוגרים יותר, הסר את המבנה הגרמי של העצם הטמפורלית כדי לבודד את צינור השמיעה ולתקן את צינור השמיעה ב 4% PFA.
    2. יש לשמור את כל העצמות הטמפורליות וצינורות השמיעה ב-4% PFA בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לפני הטמעת הרקמות.
    3. בצע הטמעת רקמות כמתואר. הכינו את תמיסת ההטבעה באופן הבא: משרים 10% ג'לטין (מעור בקר) במים קרים עד שגרגירי הג'לטין מתנפחים ומתיישבים (כ-30 דקות). מחממים את התערובת ל~50°C כדי להמיס את הג'לטין ומוסיפים 20% סוכרוז לתמיסת הג'לטין ומערבבים עד להתמוססות. אחסנו את תמיסת הג'לטין-סוכרוז בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.
    4. לשימוש, מחממים את תמיסת הג'לטין-סוכרוז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. משרים את העצמות הטמפורליות/צינורות השמיעה בתמיסת הג'לטין-סוכרוז החמה על צלחת של 96 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהן שוקעות, בדרך כלל 30-60 דקות.
    5. מרפדים את תחתית הבארות של צלחת בת 12 בארות ברצועת סרט שקוף. מוסיפים שכבה של תמיסת ג'לטין-סוכרוז חמה ומחכים עד שהיא תתמצק. מעבירים עצם זמנית/צינור שמיעתי לכל באר.
    6. להשתיל את הרקמה עם שכבה שנייה של תמיסת ג'לטין-סוכרוז חם. התאם את מיקום הרקמה כך שהיא תהיה במרכז הג'ל וצינור השמיעה מכוון אופקית. מעבירים בזהירות את הצלחת למקרר של 4 מעלות צלזיוס ומחכים עד שהג'ל יתקשח.
    7. משכו את רצועת הסרט השקופה כדי להזיז את גוש רקמת הג'ל אל מחוץ לבאר. חותכים ג'ל נוסף לגוש מרובע וחותכים פינה של הבלוק כדי לזהות את הכיוון. עוטפים את גוש הג'לטין בנייר כסף, מקפיאים על קרח יבש, ואז מאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לחתך.
    8. חתך את הבלוק ב 20 μm לאורך קו האורך של צינור השמיעה עם cryostat. הרכיבו את החלקים ישירות על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין. יש לאחסן את המגלשות בטמפרטורה של -80°C לפני תחילת ההצבעה.
    9. לפני החיסון, טבלו את השקופיות ב-PBS שחומם מראש (45 מעלות צלזיוס) למשך 5 דקות כדי להמיס את הג'לטין, ולאחר מכן שטפו את השקופיות פי 3 עם PBS בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות ג'לטין.

5. אימונוסטינינג והדמיית מיקרוסקופ

הערה: שני סוגים של אימונוסטינינג מבוצעים בהתאם לשאלה אם חלקים מותקנים על שקופיות או צפים בחופשיות ב- PBS.

  1. מכתמי חיסון בשקופיות
    1. לשטוף את השקופיות 3x במשך 10 דקות כל אחד עם PBS. הקיפו את האזור המכיל את החלקים בעט שמן כדי למנוע דליפת נוזלים במהלך הכתמים. מכסים את החלקים בתמיסת חסימה המכילה 5% סרום עיזים רגיל ב-PBS ומדגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. לדלל את הנוגדנים העיקריים (עבור הריכוז הסופי המשמש עיין טבלת החומרים) ב- PBS המכיל 0.3% TritonX-100 ו -5% סרום עיזים רגיל. הסר את תמיסת החסימה ולאחר מכן כסה את החלקים עם תמיסת הנוגדנים העיקרית. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה בקופסה המכילה שכבה של מים מזוקקים בתחתית.
    3. שטפו את השקופיות 3x למשך 10 דקות עם PBS. יש למרוח נוגדנים משניים פלואורסצנטיים המדוללים בשעה 1:500 ב-PBS המכילים 0.3% TritonX-100 על שקופיות. לדגור על המגלשות בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות, מוגן מפני אור.
    4. שטפו את השקופיות 3x עם PBS. יש להשליך בעדינות שתי טיפות של מדיום הרכבה על השקופיות ולכסות את החלקים בכיסויים. היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בין הכיסוי למגלשה.
  2. חיסון לעוברים שלמים ולחלקים צפים חופשיים
    1. שטפו את העוברים / החלקים עם PBS 3x במשך 10 דקות כל אחד בצלחת באר. יש לדלל את הנוגדנים העיקריים ב-PBS המכילים 0.3% TritonX-100 ו-5% סרום עיזים רגיל בצינורות צנטריפוגליים. מעבירים כל עובר/חתך לצינור עם וו זכוכית ודוגרים על שייקר ב-60 סל"ד למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. לשטוף עוברים / חלקים 3x עם PBS במשך 10 דקות כל אחד בצלחת באר. מעבירים כל עובר/חתך לצינור צנטריפוגלי כהה מלא בתמיסת נוגדנים משנית פלואורסצנטית ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות על השייקר.
    3. שטפו את העוברים/מקטעים פי 3 עם PBS בצלחת באר. השתמשו במברשת כדי להרכיב את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ מצופות ג'לטין בכלי בגודל 15 ס"מ המכיל PBS. לאחר שהמגלשות מתייבשות מעט (~5 דקות), יש למרוח שתי טיפות של מדיום הרכבה ולהניח כיסוי. היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בין הכיסוי למגלשה. שמור את כל רקמות ההר ב- PBS להדמיה.
  3. דימות
    1. דמיינו את כל רקמות ההרכבה ב-PBS בצלחת עם תחתית סיליקון המכילה אבקת פחמן, המספקת רקע שחור. צלם ועבד תמונות באמצעות חבילת תוכנה מסחרית לעיבוד תמונה אולימפוס, כפי שתואר קודםלכן 29.
    2. דמיינו את הקטעים בשקופיות במיקרוסקופ קונפוקלי כפי שתואר קודםלכן 20. צלם את המקטעים במישור מוקד יחיד עם מטרות של 10x, 20x ו- 63x. צלם את כל התמונות מאותה חיה באמצעות אותם פרמטרים. הקפד להתאים את רמת הלייזר ואת הגדרות רכישת ההדמיה כדי למנוע רוויית אות.
    3. בצע עיבוד תמונה באמצעות תוכנת פיג'י. לשם המחשה, התאם את הבהירות, הניגודיות והגמא של התמונה באמצעות תוכנה מקצועית לעריכת תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי ביצוע אלקטרופורציה של ovo באתרים שונים ובשלבי התפתחות שונים, השגנו נפילת FMRP סלקטיבית בפריפריה השמיעתית או בגזע המוח השמיעתי.

נוק-דאון של FMRP ב-NM
RNA סיכת שיער קטנה (shRNA) כנגד התרנגולת Fmr1 תוכנן ושוכפל למערכת הווקטורית Tet-On כפי שתואר קודםלכן 20. ההגדרה לאלקטרופורציה של אובו מוצגת באיור 1A. הדנ"א הפלסמיד הצבוע בירוק מהיר הוזרק לתעלה העצבית ברמת r5/r6 ב-HH12 (א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לקבוע את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP, יש צורך במניפולציה של הביטוי שלה בקבוצות תאים בודדות או בסוגי תאים. מכיוון שאחד התפקידים העיקריים של FMRP הוא לווסת את ההיווצרות והפלסטיות הסינפטית, מניפולציה סלקטיבית של כל רכיב סינפטי של מעגל מסוים היא תנאי מוקדם להבנה מלאה של מנגנון FMRP בתקשורת סינפטית. באמצעות אלקטרופורציה של עופות ב-ovo, הדגמנו שיטה למיקוד ביטוי FMRP במעגל AG-NM, בין אם בנוירוני AG קדם-סינפטיים או בנוירוני NM פוסט-סינפטיים. כדי להשיג זאת, בחירת שלבי התפתחות מתא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי: מענק של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32000697); תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג'ואו (202102080139); קרן גואנגדונג למדעי הטבע (2019A1515110625, 2021A1515010619); קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (11620324); מענק מחקר של מעבדת מפתח לרפואה רגנרטיבית, משרד החינוך, אוניברסיטת ג'ינאן (לא. ZSYXM202107); קרנות המחקר הבסיסיות של האוניברסיטאות המרכזיות של סין (21621054); וקרן המחקר המדעי הרפואי של מחוז גואנגדונג בסין (20191118142729581). אנו מודים למרכז הניסויים הרפואי של אוניברסיטת ג'ינאן. אנו מודים לד"ר טרה בראדלי על העריכה הקפדנית של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>דגירה של ביצים
16 & מעלות; C מקררMAGATמשמש לאחסון ביציות מופרות.
חממת ביציםSHANGHAI BOXUNGZX-9240MBE
ביצים מופרותחוות האוניברסיטהיש להשתמש בביצים תוך שבוע אחד לצורך כדאיות אופטימלית.
<תכשיר פלסמיד>חזקה
Sigma10016
Fast GreenSolarbioG1661הכינו תמיסת עבודה של 0.1% במים מזוקקים ובחיטוי.
ערכת הכנה מקסי פלסמידQIAGEN12162ממיסים DNA פלסמיד במאגר Tris-EDTA (TE); ערכת הכנה ללא אנדוטוקסין
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ'S2889הכינו תמיסת עבודה של 7.5M במים נטולי נוקלז.
<חזק>אלקטרופורציה ומתן דוקסיציקלין
אלקטרופורטורBTXECM399
מזרק 1 מ"ל / 5 מ"לגואנגג'ואו KANGFULAI
מיקרוסקופ ניתוחCNOPTECSZM-42
DoxcyclineSigma-AldrichD9891השתמש בכמויות טריות לכל מנה ואחסן ב -20 & deg;C.
נימי זכוכיתBEIBOBOMEIRD09100.9-1.1 מ"מ*100 מ"מ
פרפילם מעבדהPARAFILMPM996סרט שקוף
חולץ פיפטהצ'נגדו מפעל מכשיריםWD-2מצב משיכה: 500 & deg; C עבור 15 שניות
אלקטרודות פלטינהתוצרתקוטר 0.5 מ"מ, מרווח של 1.5 מ"מ.
צינור גומיSigma-AldrichA5177
<חיתוך וקיבוע רקמות חזק<>/חזק>
מלקחייםRWDF11020-11גודל קצה: 0.05*0.01 מ"מ
כלי ניתוח אחריםRWD
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127ניתן לאחסן תמיסת PFA טרייה של 4% במי מלח עם חוצץ פוספט ב-4 מעלות; C עד שבוע.
ערכת אלסטומר סיליקון SYLGARD 184DOW01673921עבור צלחות רקע שחורות, מורחים אבקת פחמן באיכות מזון.
<חתך חזק>
CryostatLEICACM1850
ג'לטיןסיגמא-אולדריץ'G9391מעור בקר.
מיקרוטום הזזהLEICASM2010
<חזק>צביעה חיסונית
Alexa Fluor 488 עז נגד עכברAbcamab1501131:500 דילול, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 עז אנטי-ארנבAbcamab1500781:500 דילול, RRID: AB_2722519
DAPIAbcamab2853901: 1000 דילול
Fluoromount-G בינוני הרכבהדרומי  BiotechSb-0100-01
נוגדן FMRPY. Wang, אוניברסיטת פלורידה סטייט#82631:1000 דילול, RRID: נוגדן AB_2861242
Islet-1DSHB39.3F71:100 דילול, RRID: AB_1157901
צלחת Netwellקורנינג3478
נוגדן נוירופילמנטSigma-AldrichN41421:1000 דילול, RRID: AB_477272
נוגדן ParvalbuminSigma-AldrichP3088דילול 1:10000, RRID: נוגדן
AB_477329 SNAP25Abcamab66066דילול 1:1000, RRID: AB_2192052
<חזק>הדמיה
Adobe פוטושופתוכנת עריכת תמונותADOBE
מיקרוסקופ קונפוקליLEICASP8
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיOLYMPUSMVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0OlYMPUSחבילת תוכנה לעיבוד תמונה מסחרית
החקלאית של דרום סין בית

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253(2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13(2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628(2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864(2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321(2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XFMRPRNAEGFP

מאמרים קשורים