מאמר שיטה

הפרדת תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בדגימות דם היקפיות מילדים עם מונונוקלאוזיס זיהומית

DOI:

10.3791/64212

⸱

7 בספטמבר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי הרג טבעיים). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר ולנתח תאים מגנטיים ובעלי תווית פלואורסצנטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מונונוקלאוזיס זיהומית (IM) היא תסמונת חריפה הקשורה בעיקר לזיהום ראשוני בנגיף אפשטיין-בר (EBV). הסימפטומים הקליניים העיקריים כוללים חום לא סדיר, לימפדנופתיה, ועלייה משמעותית בלימפוציטים בדם היקפי. המנגנון הפתוגני של IM עדיין לא ברור; אין שיטה טיפולית יעילה עבורו, כאשר קיימים בעיקר טיפולים סימפטומטיים. השאלה העיקרית ב- EBV אימונוביולוגיה היא מדוע רק תת-קבוצה קטנה של אנשים נגועים מראה תסמינים קליניים חמורים ואף לפתח ממאירויות הקשורות ל- EBV, בעוד שרוב האנשים הם אסימפטומטיים לכל החיים עם הנגיף.

תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. תאי הרג טבעי (NK) הם לימפוציטים מולדים ציטוטוקסיים החשובים להריגת תאים נגועים ב-EBV. חלקם של תאי CD4+ T פוחת בעוד זה של תאי CD8+ T מתרחב באופן דרמטי במהלך זיהום EBV חריף, וההתמדה של תאי CD8+ T חשובה לשליטה לכל החיים ב- IM. תאי מערכת החיסון האלה ממלאים תפקידים חשובים בהודעות מיידיות, ויש לזהות את תפקודם בנפרד. לשם כך, מונוציטים מופרדים תחילה מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) של אנשים עם הודעות מיידיות באמצעות מיקרובי CD14, עמודה ומפריד מגנטי.

יתר ה-PBMCs מוכתמים בחלבון פרידינין-כלורופיל (PerCP)/ציאנין 5.5 אנטי-CD3, אלופיקוציאנין (APC)/ציאנין 7 אנטי-CD4, פיקואריתרין (PE) אנטי-CD8, פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) אנטי-CD19, APC אנטי-CD56 ונוגדנים APC נגד CD16 למיון תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK באמצעות ציטומטר זרימה. יתר על כן, ריצוף תעתיק של חמש תת-אוכלוסיות בוצע כדי לחקור את תפקידיהן ואת המנגנונים הפתוגניים שלהן ב- IM.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נגיף אפשטיין-בר (EBV), נגיף γ-הרפס הידוע גם בשם נגיף הרפס אנושי מסוג 4, נמצא בכל מקום באוכלוסייה האנושית ויוצר זיהום סמוי לכל החיים ביותר מ-90% מהאוכלוסייה הבוגרת1. רוב ההדבקות הראשוניות ב-EBV מתרחשות במהלך הילדות וההתבגרות, כאשר חלק קטן מהחולים מתבטאים במונונוקלאוזיס זיהומי (IM)2, ומראים אימונופתולוגיה אופיינית, כולל תגובה חיסונית פעילה עם תאי CD8+ T בדם והתפשטות חולפת של תאי B נגועים ב-EBV בלוע3. מהלך ה- IM עשוי להימשך 2-6 שבועות ורוב החולים מחלימים היטב4. עם זאת, אנשים מסוימים מפתחים תסמינים מתמשכים או חוזרים דמויי IM עם תחלואה ותמותה גבוהות, המסווגות כזיהום EBV פעיל כרוני (CAEBV)5. בנוסף, EBV הוא נגיף אונקוגני חשוב, הקשור קשר הדוק למגוון ממאירויות, כולל ממאירות אפיתליואידית ולימפואידית כגון קרצינומה של הלוע, לימפומה של בורקיט, לימפומה של הודג'קין (HL) ולימפומה של תאי T/NK6. למרות ש- EBV נחקר במשך למעלה מ -50 שנה, הפתוגנזה שלו והמנגנון שבאמצעותו הוא גורם להתפשטות הלימפוציטים לא הובהרו במלואם.

מספר מחקרים חקרו את החתימות המולקולריות לאימונופתולוגיה של זיהום EBV על ידי ריצוף תעתיק. Zhong et al. ניתחו פרופילים של תעתיק שלם של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מילדים סינים עם IM או CAEBV כדי למצוא שהרחבת תאי T CD8+ נמצאה בעיקר בקבוצת IM7, מה שמרמז על כך שתאי CD8+ T עשויים למלא תפקיד מרכזי ב-IM. באופן דומה, מחקר אחר מצא שיעורים נמוכים יותר של תאי T ו-CD19+ B ציטוטוקסיים ספציפיים ל-EBV ואחוזים גבוהים יותר של תאי CD8+ T בחולים עם IM שנגרם על ידי זיהום EBV ראשוני מאשר בחולים עם IM שנגרם הן על ידי הפעלה מחדש של EBV והן על ידי סוכנים אחרים8. תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. Al Tabaa et al. מצאו שתאי B היו אינטופלסמבלסטים פעילים ומתמיינים באופן פוליקלונלי (CD19+, CD27+ ו-CD20−, ו-CD138− תאים) ותאי פלזמה (CD19+, CD27+ ו-CD20− ו-CD138+) במהלך IM9. יתר על כן, Zhong et al. מצאו כי סמני מונוציטים CD14 ו- CD64 היו מווסתים ב- CAEBV, מה שמרמז על כך שמונוציטים עשויים למלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית התאית של CAEBV באמצעות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) ופאגוציטוזה היפראקטיבית7. Alka et al. אפיינו את התעתיק של MACS מיון CD56 dimCD16+ NK תאים מארבעה חולים של IM או HL ומצאו כי תאי NK הן IM והן HL היו בעלי חסינות מולדת מווסתת וגנים לאיתות כימוקין, אשר יכול להיות אחראי על תגובתיות נמוכה של תאי NK10. בנוסף, Greenough et al. ניתחו ביטוי גנים של תאי CD8+ T ממוינים מ-10 PBMCs של אנשים עם IM. הם דיווחו כי חלק גדול מתאי ה-CD8+ T בהודעות מיידיות היו ספציפיים לנגיף, הופעלו, התחלקו והתכוננו להפעיל פעילויות השפעה11. הן תגובות בתיווך תאי T, ספציפיות ל-EBV, והן תגובות לא ספציפיות בתיווך תאי NK, ממלאות תפקידים חיוניים במהלך זיהום EBV ראשוני. עם זאת, מחקרים אלה חקרו רק את תוצאות השעתוק של תערובת מגוונת של תאי חיסון או רק תת-אוכלוסייה מסוימת של לימפוציטים, שאינה מספיקה להשוואה מקיפה של המאפיינים המולקולריים והתפקודים של תת-אוכלוסיות שונות של תאי חיסון אצל ילדים עם IM באותו מצב מחלה.

מאמר זה מתאר שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של PBMCs (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר תאים מגנטיים ומסומנים פלואורסצנטיים באמצעות מפריד מגנטי ו- FACS או לנתח אותם על ידי ציטומטריה של זרימה. ניתן להפיק RNA מהתאים המטוהרים לצורך ריצוף תעתיק. שיטה זו תאפשר אפיון וביטוי גנים של תאי חיסון שונים באותם מצבי מחלה של אנשים עם IM, מה שירחיב את הבנתנו לגבי האימונופתולוגיה של זיהום EBV.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות דם התקבלו מחולים עם IM (n = 3), נשאים בריאים של EBV (n = 3) וילדים לא נגועים ב- EBV (n = 3). מתנדבים גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, אוניברסיטת קפיטל מדיקל, וכל המחקרים אושרו אתית. אישור אתי הושג על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: [2021]-E-056-Y). הסכמה מדעת של המטופלים ויתרה מכיוון שהמחקר השתמש רק בדגימות הנותרות לבדיקה קלינית. כל הנתונים הוסרו באופן מלא והפכו לאנונימיים כדי להגן על פרטיות המטופלים.

1. בידוד של PBMCs מדם היקפי

  1. לאסוף דם היקפי טרי (2 מ"ל) מחולים עם IM לתוך צינורות K3EDTA על ידי venipuncture סטנדרטי.
    הערה: התהליך צריך להיות מהיר כדי לשמור על כדאיות התא.
  2. יש לדלל את הדם ההיקפי לנפח כפול באמצעות תמיסת מלח עם מאגרי פוספט (PBS) ולהניח אותו על גבי מדיום הפרדת לימפוציטים אנושי (צפיפות: 1.077 ± 0.001 גרם/מ"ל) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    הערה: יחס הנפח של דם, PBS ומדיום הפרדה היה 1:1:1. הוסיפו את הדם באיטיות למדיום ההפרדה, וצנטריפוגה מיד כדי למנוע מהדם לשקוע במדיום ההפרדה.
  3. צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את השכבה האמצעית (PBMCs מועשרים) לצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, בתחתית הצינור נמצאים אריתרוציטים, השכבה האמצעית היא מדיום ההפרדה, השכבה העליונה היא פלזמה, ובין שכבת הפלזמה לשכבת נוזל ההפרדה היו PBMCs (כולל לימפוציטים ומונוציטים).
  4. לשטוף את PBMCs עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר; השליכו את הסופר-נטנט בזהירות.
  5. חזור על הכביסה והצנטריפוגה (שלב 1.4) 2 x. השהה את ה- PBMCs עם 1 מ"ל של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וספור את התאים באמצעות מונה אוטומטי מבוסס טריפאן כחול.

2. בידוד של CD14 + מונוציטים מ- PBMCs באמצעות CD14 microads

  1. הכינו תמיסת חיץ המכילה 0.5% סרום בקר עוברי (FBS) ו-2 mM EDTA ב-PBS (pH 7.2). שמור על המאגר קר (2−8 מעלות צלזיוס).
    הערה: הסר את המאגר לפני השימוש כבועות אוויר שעלולות לחסום את העמודה. שמור על התאים קרים כדי למנוע סגירה של הנוגדנים על פני התא ותיוג תאים לא ספציפיים.
  2. צנטריפוגה PBMCs ב 300 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו בזהירות את הסופר-נטנט. השהה את התאים עם 80 μL של המאגר. הוסף 20 μL של מיקרובי CD14 לתלויית התא.
    הערה: אם יש ≤107 PBMCs, השתמש באמצעי האחסון שצוין לעיל. אם יש >107 PBMCs, הגדל באופן יחסי את כל אמצעי האחסון של הריאגנטים ואת הנפח הכולל.
  3. מערבבים היטב את מיקרובי CD14 ואת התאים בצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ודוגרים במשך 15 דקות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטפו את ה-PBMCs עם 1 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט לחלוטין. השהה את התאים עם 500 μL של המאגר.
    הערה: אם יש ≤108 PBMCs, השתמש באמצעי האחסון שצוין לעיל. אם יש >108 PBMCs, הגדל באופן יחסי את נפח המאגר.
  4. הפרדה מגנטית עם עמודות:
    1. שים את העמודה על מפריד חרוז מגנטי, ולשטוף את העמוד עם 3 מ"ל של מאגר. הוסף את השעיית התא (משלב 2.3) לעמודה.
    2. אסוף את התאים ללא תווית העוברים דרך העמודה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ושטוף את העמוד עם 3 מ"ל של חיץ. לשטוף את העמוד עם 3 x 3 מ"ל של חיץ. לאסוף את סך הקולחים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    3. מקם את העמודה בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר לעמודה. דחפו את הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה כדי לשטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
    4. צנטריפוגה של התאים המסומנים מגנטית ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. יש להשעות את התאים ב-500 μL של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לשימוש בריצוף תעתיק עוקב.

3. הפרדת אוכלוסיות לימפוציטים מ-PBMCs על ידי צביעת נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי ו-FACS

  1. צנטריפוגה של תאים ללא תווית (שלב 2.4.2) ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. השהה את התאים ב-100 μL של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. הוסף 2 μL מכל נוגדן מסומן (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) ל-100 μL של תרחיף התא (הנפחים ומידע הפלואורופור המצומד של נוגדנים מוצגים בטבלה 1), דגירה על קרח למשך 30 דקות, והגנה מפני אור.
  3. לשטוף את התאים 2 x על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את התאים ב-500 μL של PBS בצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מערבבים את תרחיף התאים בעדינות לפני רכישת נתונים על ציטומטר מיון תאי זרימה.

4. הגדרת פרמטר ציטומטריה של זרימה

  1. קח 100 μL של מתלה התא (ראה סעיף 1) בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לפי הצורך, והגדר דגימת בקרה שלילית, דגימת צביעה בודדת CD3, דגימת צביעה בודדת CD4, דגימת צביעה יחידה של CD8, דגימת צביעה בודדת של CD19 ודגימת צביעה של CD56/CD16.
  2. הוסף 2 μL של הנוגדן הפלואורסצנטי המתאים לכל 100 μL של תרחיף התא והמערבולת. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם ולשאוף את supernatant. החזירו את הכדורים עם 500 μL של PBS ומערבולת.
  3. הזמינו את זרם המיון ועיכבו את הטיפות באמצעות חרוזי הפלואורסצנט באופן הבא:
    1. פתח את מערכת מיון התאים, הפעל את תוכנית ההפעלה, התקן את הזרבובית בגודל 85 מיקרומטר ופתח את זרם המיון. הגדר את מתח המיון ל-4,500 וולט, ואת ה-Freq ל-47.
    2. התאם את הפרמטרים בעיקר על ידי התאמת נקודת השבירה של טיפות הזרימה הראשית והשהיית הטיפות בהתאם להוראות היצרן12. הגדר את מיקום נקודת העצירה הראשון של droplet (Drop1) ל- 275, ואת ה- Gap ל- 8 בחלון Breakoff. הפעל את מצב המיון האוטומטי Sweet Spot כדי לאפשר לציטומטריה לקבוע באופן אוטומטי את ערך משרעת הטיפות כדי לייצב את הזרם.
    3. התאם את השהיית הטיפות ל-30.31 בחלון Side Stream על ידי טעינת החרוזים הפלואורסצנטיים, כדי להבטיח שהחרוזים ישיגו סטיית זרימה צדדית של >99% במצב כוונון ראשוני או עדין.
  4. עיין באסטרטגיית ה-gating המוצגת באיור 1 לביצוע gating באופן הבא:
    1. באמצעות תרשים נקודה של אזור פיזור קדמי (FSC-A)/אזור פיזור צדדי (SSC-A), ציירו את שער המצולע (P1) כדי לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה .
    2. באמצעות תרשים נקודה בגובה FSC-A/FSC (FSC-H), ציירו את שער המצולע (P2) כדי לזהות את התאים הבודדים ולא לכלול כפילים (איור 1A).
    3. באמצעות תרשים נקודה מסוג CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, ציירו את השער המלבני (P3) כדי לבחור תאי CD3+ T ותאי CD19+ B (איור 1A,B).
    4. באמצעות תרשים נקודה CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, צייר שער מלבני כדי לבחור תאי T CD4+ ותאי T CD8+ (תאים עם פלואורסצנציה גבוהה עבור סמנים אלה, בהתאמה).
    5. באמצעות מתווה נקודה מסוג CD56/CD16 APC-A/SSC-A, ציירו שער מלבני כדי לבחור תאי CD56+/CD16+ NK (איור 1C).
  5. התאם פרמטרים אינסטרומנטליים באמצעות דגימת הבקרה השלילית:
    1. התקן את צינור הבקרה השלילית על יציאת הטעינה ולחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה. בחר את הגדרות הציטומטר בתוכנה.
    2. בחלון המפקח, לחץ על הכרטיסייה פרמטרים והתאם את המתחים של FSC, SSC וצבעים פלואורסצנטיים שונים; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
  6. התאם את הפיצוי באמצעות הדגימות המוכתמות13.
    1. טען את הצינורות המוכתמים הבודדים על הציטומטריה ברצף ובחר הגדרות ציטומטר בתוכנה. לחץ על הכרטיסייה פיצוי כדי להתאים את הפיצוי.
      הערה: ההתייחסות לפיצוי של ציטומטריה של זרימה מוצגת בטבלה 2.

5. מיון ואיסוף נתונים באמצעות ציטומטריה של זרימה

  1. מערבבים את תרחיף התאים (PBMCs מופרדים על פי סעיפים 1-3) לזמן קצר כדי להשעות את התאים לפני טעינת הצינור לתוך הציטומטר. שמור את הצינורות הנותרים על קרח.
  2. הוסף 200 μL של FBS לארבעה צינורות זרימת איסוף כדי למנוע הידבקות של התאים הממוינים לדופן הצינור והנח אותם בתא איסוף הציטומטר.
  3. אסוף תאי CD3+CD4+ T, תאי CD3+CD8+ T, תאי CD3−CD19+ B ותאי CD3− CD56+/CD16+ NK בנפרד מהדגימה של מטופל עם IM בארבעת צינורות הזרימה (איור 2A).
  4. צנטריפוגה של התאים המופרדים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μL של מגיב בידוד RNA לתאים לריצוף שעתוק.
  5. הפרד את תת-האוכלוסיות של תאי מערכת החיסון של דגימות מנשאי EBV בריאים ומילדים שאינם נגועים ב-EBV בהתאם לשלבים שלעיל (איור 2B, C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התייחסות לאסטרטגיית הגטינג
אסטרטגיית המיון המשמשת למיון ארבע תת-אוכלוסיות הלימפוציטים מוצגת באיור 1. בקצרה, לימפוציטים נבחרים (P1) על תרשים נקודה המציג את הגרנולוסיות (SSC-A) לעומת הגודל (FSC-A). לאחר מכן, תאים בודדים נבחרים (P2) בהתוויית נקודה המציגה את הגודל (FSC-A) לעומת פיזור קדימה (FSC-H), בעוד שתאים כפולים אינם נכללים. תאי CD3+ T (P3) ותאי CD19+ B (איור 1B) נבחרים בנפרד בתרשים נקודה המציג את CD3 PerCP-Cy5.5-A לעומת CD19 FITC-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מייצג דרך יעילה למיין תת-אוכלוסיות של תאי חיסון היקפיים בדם. במחקר זה, דגימות דם ורידי מחולים עם IM, נשאים בריאים של EBV וילדים לא נגועים ב- EBV נבחרו כמטרת המחקר. עבודה זו באמצעות הדם ההיקפי של חולים של IM מתמקדת בעיקר בניתוח וקביעת הפרופורציות של תת-קבוצות תאים שונות באמצעות ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים. ריצוף תעתיק משמש בעיקר לזיהוי וניתוח של תת-אוכלוסייה מסוימת של לימפוציטים שלא הספיקה להשוואות מקיפות וספציפיות של המאפיינים המולקולריים והתפקודים של תת-אוכלוסיות שונות של תאי חיסון בילדים עם IM באותו מצב ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82002130), קרן בייג'ינג למדעי הטבע (7222059) וקרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
APC אנטי אנושי CD16Biolegend302012נוגדן פלואורסצנטי 
נוגדן פלואורסצנטי אנטי אנושי CD56 (NCAM) Biolegend362504נוגדן פלואורסצנטי 
APC/Cyanine7 אנטי-אנושי CD4Biolegend344616נוגדן פלואורסצנטי 
מונה תאים אוטומטיBIO RADTC20ספירת תאים
BD FACSריה מופעלת פלואורסצנטית  זרימה  סלולרי  מיון ציטומטר (BD FACSAria II)בקטון, דיקינסון ושות'644832מיון תאים
CD14 מיקרו-חרוזים, אנושיMiltenyi Biotec130-050-201מיקרו-חרוזים
שקופיות ctng תאיםBIO RAD1450016ספירת
תאים צינורות צנטריפוגהפלקון35209715צינור צנטריפוגה 15 מ"ל
EDTA (≥ 99%, BioPremium)BeyotimeST1303EDTA
אתילן דיאמין טטרה חומצה אצטית (EDTA) שפופרות נוגדות קרישהBecton, Dickinson and Company  367862 שפופרות נוגדות קרישה EDTA
FITC אנטי אנושי CD19Biolegend302206נוגדן פלואורסצנטי 
סרום בקר עוברי GibcoThermo Fisher Scientific16000-044סרום בקר עוברי
  מהירות גבוהה  צנטריפוגהסיגמא  צנטריפוגה תאית 3K15 לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל
  מהירות גבוהה  צנטריפוגהEppendorf5424Rצנטריפוגה תאית לצינור 1.5 מ"ל Eppendorf (EP)
מדיום הפרדת לימפוציטים אנושיDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque
LS  הפרדה  עמודותMiltenyi Biotec130-042-401הפרדה  עמודות
צינורות מיקרוצנטריפוגהAxygenMCT-150-C1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה
MidiMACS מפרידMiltenyi Biotec130-042-302מפריד חרוזים מגנטי
PE אנטי אנושי CD8Biolegend344706נוגדן פלואורסצנטי 
PerCP/Cyanine5.5 אנטי-אנושי CD3Biolegend344808נוגדן פלואורסצנטי 
פוספט חוצץ מלח (PBS)BI02-024-1ACSPBS
פוליסטירן צינורות תחתונים עגוליםפלקון3522355 מ"ל ציטומטר ציטומטר זרימה
TRIzol מגיבאמביון15596024תאי ליז למיצוי RNA
ערכת בדיקת כדאיות תא מכתים כחולים טריפאןBeyotimeC0011צביעה כחולה טריפן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60(2016).
  2. Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
  3. Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
  4. Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
  5. Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
  6. Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270(2017).
  7. Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775(2017).
  8. Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
  9. Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
  10. M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907(2020).
  11. Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
  12. Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961(2019).
  13. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  14. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).
  15. Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
  16. Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836(2021).
  17. Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110(2018).
  18. Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753(2020).
  19. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416(2018).
  20. Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T CD4T CD8NK

מאמרים קשורים