הפרדת תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בדגימות דם היקפיות מילדים עם מונונוקלאוזיס זיהומית

נגיף אפשטיין-בר (EBV), נגיף γ-הרפס הידוע גם בשם נגיף הרפס אנושי מסוג 4, נמצא בכל מקום באוכלוסייה האנושית ויוצר זיהום סמוי לכל החיים ביותר מ-90% מהאוכלוסייה הבוגרת¹. רוב ההדבקות הראשוניות ב-EBV מתרחשות במהלך הילדות וההתבגרות, כאשר חלק קטן מהחולים מתבטאים במונונוקלאוזיס זיהומי (IM)², ומראים אימונופתולוגיה אופיינית, כולל תגובה חיסונית פעילה עם תאי CD8⁺ T בדם והתפשטות חולפת של תאי B נגועים ב-EBV בלוע³. מהלך ה- IM עשוי להימשך 2-6 שבועות ורוב החולים מחלימים היטב⁴. עם זאת, אנשים מסוימים מפתחים תסמינים מתמשכים או חוזרים דמויי IM עם תחלואה ותמותה גבוהות, המסווגות כזיהום EBV פעיל כרוני (CAEBV)⁵. בנוסף, EBV הוא נגיף אונקוגני חשוב, הקשור קשר הדוק למגוון ממאירויות, כולל ממאירות אפיתליואידית ולימפואידית כגון קרצינומה של הלוע, לימפומה של בורקיט, לימפומה של הודג'קין (HL) ולימפומה של תאי T/NK⁶. למרות ש- EBV נחקר במשך למעלה מ -50 שנה, הפתוגנזה שלו והמנגנון שבאמצעותו הוא גורם להתפשטות הלימפוציטים לא הובהרו במלואם.

מספר מחקרים חקרו את החתימות המולקולריות לאימונופתולוגיה של זיהום EBV על ידי ריצוף תעתיק. Zhong et al. ניתחו פרופילים של תעתיק שלם של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מילדים סינים עם IM או CAEBV כדי למצוא שהרחבת תאי T ^CD8+ נמצאה בעיקר בקבוצת IM⁷, מה שמרמז על כך שתאי CD8⁺ T עשויים למלא תפקיד מרכזי ב-IM. באופן דומה, מחקר אחר מצא שיעורים נמוכים יותר של תאי T ו-CD19+ B ציטוטוקסיים ספציפיים ל-EBV ואחוזים גבוהים יותר של תאי CD8⁺ T בחולים עם IM שנגרם על ידי זיהום EBV ראשוני מאשר בחולים עם IM שנגרם הן על ידי הפעלה מחדש של EBV והן על ידי סוכנים אחרים⁸. תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. Al Tabaa et al. מצאו שתאי B היו אינטופלסמבלסטים פעילים ומתמיינים באופן פוליקלונלי (CD19+, CD27+ ו-CD20⁻, ו-CD138− תאים) ותאי פלזמה (CD19+, CD27+ ו-CD20⁻ ו-CD138⁺) במהלך IM⁹. יתר על כן, Zhong et al. מצאו כי סמני מונוציטים CD14 ו- CD64 היו מווסתים ב- CAEBV, מה שמרמז על כך שמונוציטים עשויים למלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית התאית של CAEBV באמצעות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) ופאגוציטוזה היפראקטיבית⁷. Alka et al. אפיינו את התעתיק של MACS מיון CD56 dim^CD16+ NK תאים מארבעה חולים של IM או HL ומצאו כי תאי NK הן IM והן HL היו בעלי חסינות מולדת מווסתת וגנים לאיתות כימוקין, אשר יכול להיות אחראי על תגובתיות נמוכה של תאי NK¹⁰. בנוסף, Greenough et al. ניתחו ביטוי גנים של תאי CD8⁺ T ממוינים מ-10 PBMCs של אנשים עם IM. הם דיווחו כי חלק גדול מתאי ה-CD8⁺ T בהודעות מיידיות היו ספציפיים לנגיף, הופעלו, התחלקו והתכוננו להפעיל פעילויות השפעה¹¹. הן תגובות בתיווך תאי T, ספציפיות ל-EBV, והן תגובות לא ספציפיות בתיווך תאי NK, ממלאות תפקידים חיוניים במהלך זיהום EBV ראשוני. עם זאת, מחקרים אלה חקרו רק את תוצאות השעתוק של תערובת מגוונת של תאי חיסון או רק תת-אוכלוסייה מסוימת של לימפוציטים, שאינה מספיקה להשוואה מקיפה של המאפיינים המולקולריים והתפקודים של תת-אוכלוסיות שונות של תאי חיסון אצל ילדים עם IM באותו מצב מחלה.

מאמר זה מתאר שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של PBMCs (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8⁺, תאי B ותאי NK). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר תאים מגנטיים ומסומנים פלואורסצנטיים באמצעות מפריד מגנטי ו- FACS או לנתח אותם על ידי ציטומטריה של זרימה. ניתן להפיק RNA מהתאים המטוהרים לצורך ריצוף תעתיק. שיטה זו תאפשר אפיון וביטוי גנים של תאי חיסון שונים באותם מצבי מחלה של אנשים עם IM, מה שירחיב את הבנתנו לגבי האימונופתולוגיה של זיהום EBV.

דגימות דם התקבלו מחולים עם IM (n = 3), נשאים בריאים של EBV (n = 3) וילדים לא נגועים ב- EBV (n = 3). מתנדבים גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, אוניברסיטת קפיטל מדיקל, וכל המחקרים אושרו אתית. אישור אתי הושג על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: [2021]-E-056-Y). הסכמה מדעת של המטופלים ויתרה מכיוון שהמחקר השתמש רק בדגימות הנותרות לבדיקה קלינית. כל הנתונים הוסרו באופן מלא והפכו לאנונימיים כדי להגן על פרטיות המטופלים.

1. בידוד של PBMCs מדם היקפי

1. לאסוף דם היקפי טרי (2 מ"ל) מחולים עם IM לתוך צינורות K₃EDTA על ידי venipuncture סטנדרטי.
   הערה: התהליך צריך להיות מהיר כדי לשמור על כדאיות התא.
2. יש לדלל את הדם ההיקפי לנפח כפול באמצעות תמיסת מלח עם מאגרי פוספט (PBS) ולהניח אותו על גבי מדיום הפרדת לימפוציטים אנושי (צפיפות: 1.077 ± 0.001 גרם/מ"ל) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
   הערה: יחס הנפח של דם, PBS ומדיום הפרדה היה 1:1:1. הוסיפו את הדם באיטיות למדיום ההפרדה, וצנטריפוגה מיד כדי למנוע מהדם לשקוע במדיום ההפרדה.
3. צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את השכבה האמצעית (PBMCs מועשרים) לצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל.
   הערה: לאחר צנטריפוגה, בתחתית הצינור נמצאים אריתרוציטים, השכבה האמצעית היא מדיום ההפרדה, השכבה העליונה היא פלזמה, ובין שכבת הפלזמה לשכבת נוזל ההפרדה היו PBMCs (כולל לימפוציטים ומונוציטים).
4. לשטוף את PBMCs עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר; השליכו את הסופר-נטנט בזהירות.
5. חזור על הכביסה והצנטריפוגה (שלב 1.4) 2 x. השהה את ה- PBMCs עם 1 מ"ל של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וספור את התאים באמצעות מונה אוטומטי מבוסס טריפאן כחול.

2. בידוד של CD14 ⁺ מונוציטים מ- PBMCs באמצעות CD14 microads

1. הכינו תמיסת חיץ המכילה 0.5% סרום בקר עוברי (FBS) ו-2 mM EDTA ב-PBS (pH 7.2). שמור על המאגר קר (2−8 מעלות צלזיוס).
   הערה: הסר את המאגר לפני השימוש כבועות אוויר שעלולות לחסום את העמודה. שמור על התאים קרים כדי למנוע סגירה של הנוגדנים על פני התא ותיוג תאים לא ספציפיים.
2. צנטריפוגה PBMCs ב 300 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו בזהירות את הסופר-נטנט. השהה את התאים עם 80 μL של המאגר. הוסף 20 μL של מיקרובי CD14 לתלויית התא.
   הערה: אם יש ≤10⁷ PBMCs, השתמש באמצעי האחסון שצוין לעיל. אם יש >10⁷ PBMCs, הגדל באופן יחסי את כל אמצעי האחסון של הריאגנטים ואת הנפח הכולל.
3. מערבבים היטב את מיקרובי CD14 ואת התאים בצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ודוגרים במשך 15 דקות במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שטפו את ה-PBMCs עם 1 מ"ל של חיץ וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופר-נטנט לחלוטין. השהה את התאים עם 500 μL של המאגר.
   הערה: אם יש ≤10⁸ PBMCs, השתמש באמצעי האחסון שצוין לעיל. אם יש >10⁸ PBMCs, הגדל באופן יחסי את נפח המאגר.
4. הפרדה מגנטית עם עמודות:
   1. שים את העמודה על מפריד חרוז מגנטי, ולשטוף את העמוד עם 3 מ"ל של מאגר. הוסף את השעיית התא (משלב 2.3) לעמודה.
   2. אסוף את התאים ללא תווית העוברים דרך העמודה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ושטוף את העמוד עם 3 מ"ל של חיץ. לשטוף את העמוד עם 3 x 3 מ"ל של חיץ. לאסוף את סך הקולחים בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   3. מקם את העמודה בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר לעמודה. דחפו את הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה כדי לשטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   4. צנטריפוגה של התאים המסומנים מגנטית ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. יש להשעות את התאים ב-500 μL של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לשימוש בריצוף תעתיק עוקב.

3. הפרדת אוכלוסיות לימפוציטים מ-PBMCs על ידי צביעת נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי ו-FACS

1. צנטריפוגה של תאים ללא תווית (שלב 2.4.2) ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. השהה את התאים ב-100 μL של PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
2. הוסף 2 μL מכל נוגדן מסומן (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) ל-100 μL של תרחיף התא (הנפחים ומידע הפלואורופור המצומד של נוגדנים מוצגים בטבלה 1), דגירה על קרח למשך 30 דקות, והגנה מפני אור.
3. לשטוף את התאים 2 x על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את התאים ב-500 μL של PBS בצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מערבבים את תרחיף התאים בעדינות לפני רכישת נתונים על ציטומטר מיון תאי זרימה.

4. הגדרת פרמטר ציטומטריה של זרימה

1. קח 100 μL של מתלה התא (ראה סעיף 1) בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל לפי הצורך, והגדר דגימת בקרה שלילית, דגימת צביעה בודדת CD3, דגימת צביעה בודדת CD4, דגימת צביעה יחידה של CD8, דגימת צביעה בודדת של CD19 ודגימת צביעה של CD56/CD16.
2. הוסף 2 μL של הנוגדן הפלואורסצנטי המתאים לכל 100 μL של תרחיף התא והמערבולת. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם ולשאוף את supernatant. החזירו את הכדורים עם 500 μL של PBS ומערבולת.
3. הזמינו את זרם המיון ועיכבו את הטיפות באמצעות חרוזי הפלואורסצנט באופן הבא:
   1. פתח את מערכת מיון התאים, הפעל את תוכנית ההפעלה, התקן את הזרבובית בגודל 85 מיקרומטר ופתח את זרם המיון. הגדר את מתח המיון ל-4,500 וולט, ואת ה-Freq ל-47.
   2. התאם את הפרמטרים בעיקר על ידי התאמת נקודת השבירה של טיפות הזרימה הראשית והשהיית הטיפות בהתאם להוראות היצרן¹². הגדר את מיקום נקודת העצירה הראשון של droplet (Drop1) ל- 275, ואת ה- Gap ל- 8 בחלון Breakoff. הפעל את מצב המיון האוטומטי Sweet Spot כדי לאפשר לציטומטריה לקבוע באופן אוטומטי את ערך משרעת הטיפות כדי לייצב את הזרם.
   3. התאם את השהיית הטיפות ל-30.31 בחלון Side Stream על ידי טעינת החרוזים הפלואורסצנטיים, כדי להבטיח שהחרוזים ישיגו סטיית זרימה צדדית של >99% במצב כוונון ראשוני או עדין.
4. עיין באסטרטגיית ה-gating המוצגת באיור 1 לביצוע gating באופן הבא:
   1. באמצעות תרשים נקודה של אזור פיזור קדמי (FSC-A)/אזור פיזור צדדי (SSC-A), ציירו את שער המצולע (P1) כדי לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה .
   2. באמצעות תרשים נקודה בגובה FSC-A/FSC (FSC-H), ציירו את שער המצולע (P2) כדי לזהות את התאים הבודדים ולא לכלול כפילים (איור 1A).
   3. באמצעות תרשים נקודה מסוג CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, ציירו את השער המלבני (P3) כדי לבחור תאי CD3+ T ותאי CD19⁺ B (איור 1A,B).
   4. באמצעות תרשים נקודה CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, צייר שער מלבני כדי לבחור תאי T CD4+ ותאי T CD8⁺ (תאים עם פלואורסצנציה גבוהה עבור סמנים אלה, בהתאמה).
   5. באמצעות מתווה נקודה מסוג CD56/CD16 APC-A/SSC-A, ציירו שער מלבני כדי לבחור תאי CD56+/CD16⁺ NK (איור 1C).
5. התאם פרמטרים אינסטרומנטליים באמצעות דגימת הבקרה השלילית:
   1. התקן את צינור הבקרה השלילית על יציאת הטעינה ולחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה. בחר את הגדרות הציטומטר בתוכנה.
   2. בחלון המפקח, לחץ על הכרטיסייה פרמטרים והתאם את המתחים של FSC, SSC וצבעים פלואורסצנטיים שונים; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
6. התאם את הפיצוי באמצעות הדגימות המוכתמות¹³.
   1. טען את הצינורות המוכתמים הבודדים על הציטומטריה ברצף ובחר הגדרות ציטומטר בתוכנה. לחץ על הכרטיסייה פיצוי כדי להתאים את הפיצוי.
      הערה: ההתייחסות לפיצוי של ציטומטריה של זרימה מוצגת בטבלה 2.

5. מיון ואיסוף נתונים באמצעות ציטומטריה של זרימה

1. מערבבים את תרחיף התאים (PBMCs מופרדים על פי סעיפים 1-3) לזמן קצר כדי להשעות את התאים לפני טעינת הצינור לתוך הציטומטר. שמור את הצינורות הנותרים על קרח.
2. הוסף 200 μL של FBS לארבעה צינורות זרימת איסוף כדי למנוע הידבקות של התאים הממוינים לדופן הצינור והנח אותם בתא איסוף הציטומטר.
3. אסוף תאי CD3+CD4+ T, תאי CD3⁺CD8+ T, תאי CD3⁻CD19+ B ותאי CD3⁻ CD56+/CD16⁺ NK בנפרד מהדגימה של מטופל עם IM בארבעת צינורות הזרימה (איור 2A).
4. צנטריפוגה של התאים המופרדים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μL של מגיב בידוד RNA לתאים לריצוף שעתוק.
5. הפרד את תת-האוכלוסיות של תאי מערכת החיסון של דגימות מנשאי EBV בריאים ומילדים שאינם נגועים ב-EBV בהתאם לשלבים שלעיל (איור 2B, C).

התייחסות לאסטרטגיית הגטינג
אסטרטגיית המיון המשמשת למיון ארבע תת-אוכלוסיות הלימפוציטים מוצגת באיור 1. בקצרה, לימפוציטים נבחרים (P1) על תרשים נקודה המציג את הגרנולוסיות (SSC-A) לעומת הגודל (FSC-A). לאחר מכן, תאים בודדים נבחרים (P2) בהתוויית נקודה המציגה את הגודל (FSC-A) לעומת פיזור קדימה (FSC-H), בעוד שתאים כפולים אינם נכללים. תאי CD3+ T (P3) ותאי CD19+ B (איור 1B) נבחרים בנפרד בתרשים נקודה המציג את CD3 PerCP-Cy5.5-A לעומת CD19 FITC-A. תאי CD8+ T ותאי CD4+ T נבחרים בנפרד בתרשים נקודה המציג CD8 PE-A לעומת CD4 APC-Cy7-A מ-P3. תאי CD16+/CD56+ NK נבחרים במתווה נקודה המציג את CD56/CD16 APC-A לעומת SSC-A מ-P4 (איור 1C).

התוצאות המייצגות של ארבע תת-אוכלוסיות תאים הממוינות מדגימות של מטופלים עם IM בשיטה המתוארת מוצגות באיור 2A. ביצענו גם מיון תאים על דגימות מנשאי EBV בריאים וילדים לא נגועים ב-EBV כקבוצות ביקורת כדי לאשר את היתכנות הניסוי הזה. התוצאות המייצגות של תת-אוכלוסיות תאים המופרדות מדגימה בריאה של נשא EBV מוצגות באיור 2B. התוצאה המייצגת של תת-אוכלוסיות תאים הממוינות מהמדגם של ילדים לא נגועים ב-EBV מוצגת באיור 2C. כפי שניתן לראות באיור 2, P1 היה מגודר כדי לזהות לימפוציטים ותאים כפולים לא נכללו דרך P2; P3 היה מגודר לבחירת תאי CD3+ T ו-P5 היה מגודר לבחירת תאי CD19+ B; CD3+ CD8+ תאי T (P6) ותאי CD3+ CD4+ T (P7) נבחרו בנפרד מ-P3; תאי CD16+/CD56+ NK (P8) נבחרו מתוך P4. כל אחת מתת-האוכלוסיות הללו ניתנת למיון ואיסוף בנפרד לניסויים במורד הזרם. מערכת זו שימשה לניתוח ביטוי גנים באמצעות מיצוי RNA וריצוף תעתיק.

כפי שדווח בטבלה 3, נצפתה עלייה בתאי CD3+ CD8+ T בחולים עם IM בהשוואה הן לנשאי EBV בריאים והן לילדים שאינם נגועים ב- EBV (46.5 ± 4.0 לעומת 27.0 ± 0.1 ו- 46.5 ± 4.0 לעומת 24.7 ± 2.9, % CD3+ CD8+ תאי T לכל סך הלימפוציטים); שיעורים נמוכים יותר של תאי CD3+ CD4+ T ותאי CD19+ B נצפו בחולים עם IM בהשוואה לנשאי EBV בריאים וילדים לא נגועים ב- EBV (13.4 ± 1.5 לעומת 19.3 ± 1.5 ו- 13.4 ± 1.5 לעומת 23.6 ± 3.2, % CD3+ CD4+ תאי T לכל סך הלימפוציטים; 1.4 ± 0.3 לעומת 7.6 ± 0.7 ו-1.4 ± 0.3 לעומת 9.0 ± 1.5, % CD19+ תאי B לכל סך הלימפוציטים). ירידה בשיעורים של תאי CD16+/CD56+ NK נצפתה בחולים עם IM בהשוואה לילדים שאינם נגועים ב-EBV (7.5 ± 0.5 לעומת 10.7 ± 0.4, % CD16+/CD56+ תאי NK לכל סך הלימפוציטים). תוצאות אלה אימתו את היעילות של פרוטוקול מיון זה והראו כי הפרופורציות של תת-קבוצות לימפוציטים שונות בחולים עם ילדים לא נגועים ב- IM ו- EBV.

איור 1: אסטרטגיית גיתור כוללת המשמשת למיון תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון מ-PBMCs. (A) מסנן PerCP-Cy5.5 שימש להפרדת תאי CD3+ T. תאי CD8+ T ותאי T מסוג CD4+ נבחרו בנפרד בתרשים נקודה המציג CD8 PE-A לעומת CD4 APC-Cy7-A מ-P3. (B) מסנן FITC שימש לזיהוי תאי CD19+ B. (C) מסנן ה-APC שימש להפרדת תאי CD16+/CD56+ NK מ-P4. קיצורים: PBMCs = תאי דם חד-גרעיניים היקפיים; FSC-A = אזור פיזור קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור קדימה; PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תוצאות מייצגות של ארבע תת-אוכלוסיות תאים שבודדו בהצלחה בשיטה המתוארת. (A) נתוני מיון תאים מייצגים מדגימת הדם ההיקפית של חולה עם IM. (B) נתוני מיון תאים מייצגים מדגימת הדם ההיקפית של נשא EBV בריא. (C) נתוני מיון תאים מייצגים מדגימת הדם ההיקפית של ילדים לא נגועים ב-EBV. P1, שער העלילה נקודה כדי לזהות לימפוציטים; P2, שער התוויית נקודה לבחירת תאים בודדים; P3, שער התוויית נקודה לבחירת תאי CD3+ T; P4, שער העלילה נקודה לזיהוי CD3- CD19- לימפוציטים; P5, שער התוויית נקודה לבחירת תאי CD19+ B; P6, שער התוויית נקודה לבחירת CD3+ CD8+ תאי T מ-P3; P7, שער התוויית נקודה לבחירת CD3+ CD4+ תאי T מ- P3; P8, שער התוויית נקודה לבחירת תאי CD16+/CD56+ NK מ-P4. קיצורים: EBV = וירוס אפשטיין-בר; IM = מונונוקלאוזיס זיהומיות; FSC-A = אזור פיזור קדימה; SSC-A = אזור פיזור צדדי; FSC-H = גובה פיזור קדימה; PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: נוגדנים המשמשים לציטומטריה של זרימה. קיצורים: PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט.

טבלה 2: התייחסות לפיצוי של ציטומטריה של זרימה. קיצורים: PerCP = פרידינין-כרוניל-חלבון; PE = פיקואריתרין; APC = אלופיקוציאנין; FITC = פלואורסצין איזותיוציאנט.

טבלה 3: שיעור הלימפוציטים הממוינים של קבוצות שונות. קיצורים: EBV = וירוס אפשטיין-בר; IM = מונונוקלאוזיס זיהומיות; NK = רוצח טבעי.

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.