הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2
במאמר זה
סיכום
תקציר
ננו-חלקיקים ביומימטיים המתקבלים מחיידקים או מווירוסים משכו עניין רב במחקר ובפיתוח חיסונים. שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) מופרשות בעיקר על ידי חיידקים גראם-שליליים במהלך גדילה ממוצעת, עם קוטר בגודל ננומטרי ופעילות אדג'ובנטית עצמית, שעשויה להיות אידיאלית להעברת חיסונים. OMVs תפקדו כמערכת אספקה רבת פנים לחלבונים, חומצות גרעין ומולקולות קטנות. כדי לנצל את מלוא המאפיינים הביולוגיים של OMVs, נעשה שימוש ב-OMVs שמקורם ב-Escherichia coli שעברו הנדסה ביולוגית כנשא ותחום קשירת קולטן SARS-CoV-2 (RBD) כאנטיגן לבניית פלטפורמת חיסון "הכנס-והצג". תחומי SpyCatcher (SC) ו- SpyTag (ST) בסטרפטוקוקוס פיוגנס יושמו כדי להצמיד OMVs ו- RBD. הגן Cytolysin A (ClyA) תורגם עם הגן SC כחלבון היתוך לאחר טרנספקציה פלסמידית, והשאיר אתר תגובתי על פני השטח של OMVs. לאחר ערבוב RBD-ST במערכת חיץ קונבנציונלית בן לילה, נוצר קשירה קוולנטית בין OMVs ו- RBD. כך הושג חיסון OMV רב-ערכי. על ידי החלפה באנטיגנים מגוונים, פלטפורמת החיסון OMVs יכולה להציג ביעילות מגוון אנטיגנים הטרוגניים, ובכך למנוע במהירות מגיפות של מחלות זיהומיות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מדויקת לבניית פלטפורמת החיסון OMV, כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.
מבוא
כפלטפורמת חיסון פוטנציאלית, שלפוחיות הממברנה החיצונית (OMVs) משכו יותר ויותר תשומת לב בשנים האחרונות 1,2. OMVs, המופרשים באופן טבעי בעיקר על ידי חיידקים גראם שליליים3, הם חלקיקים ננומטריים כדוריים המורכבים מדו-שכבת שומנים, בדרך כלל בגודל של 20-300 ננומטר4. OMVs מכילים רכיבים שונים של חיידקי הורים, כולל אנטיגנים חיידקיים ותבניות מולקולריות הקשורות לפתוגנים (PAMPs), המשמשים כפוטנציאטורים חיסוניים מוצקים5. הודות למרכיביהם הייחודיים, מבנה השלפוחית הטבעי ואתרי שינוי נהדרים בהנדסה גנטית, OMVs פותחו לשימוש בתחומים ביו-רפואיים רבים, כולל חיסונים ח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בנייה פלסמידית
- הכנס את רצף SpyCatcher המקודד DNA (קובץ משלים 1) לתוך פלסמיד pThioHisA-ClyA עמיד לאמפיצילין (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- Sal I כדי לבנות את הפלסמיד pThioHisA ClyA-SC בעקבות דו"חשפורסם בעבר 20.
- ליגייט את גן ההיתוך SpyTag-RBD-Histag המסונתז (קובץ משלים 1) לפלסמיד pcDNA3.1 (ראה טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו- EcoR I כדי לבנות את הפלסמיד pcDNA3.1 RBD-ST בעקבות דו"חשפורסם בעבר 19.
2. הכנת OMV-SC
- בצע המרה של ClyA-SC בהתאם לשלבים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תרשים הזרימה של פרוטוקול זה מוצג באיור 1. פרוטוקול זה יכול להיות גישה כללית לשימוש ב-OMVs כפלטפורמת חיסונים; צריך רק לבחור את מערכות הביטוי המתאימות על סמך סוג האנטיגנים.
איור 2 מספק סכימת תכנון פלסמידית אפשרית. הגן SC מחובר לגן ClyA באמצעות מקשר גמיש, בעוד ST מתחבר למסוף 5' של הגן RBD עם גן תג שלו לטיהור ואימות. כתם מערבי הראה שהתגובה מסתיימת בהדרגה עם עלייה ב-OMV-SC (איור 3A). לאחר האולטרה-צנטריפוגציה, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי ליצור פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "Plug-and-Display", ClyA שהתמזגה ב-SC באה לידי ביטוי בזני BL21(DE3), שהוא אחד המודלים הנפוצים ביותר לייצור חלבונים רקומביננטיים בגלל יתרונותיו בביטוי חלבונים24, כך שיהיה מספיק מקטע SC המוצג על פני השטח של ה-OMVs במהלך תהליך התפשטות החיידקים. במקביל, אנטיגן מטרה שהתמזג ST הוכן לצימוד הכימי בין האנטיגנים ל- OMVs. היתרונות של תוכנית ניסיונית זו וסיכויי היישום העתידיים משתקפים בעיקר בשלושה היבטים. ראשית, מערכת "Plug-and-Display" של אנטיגנים שונים וננו-חלקיקים ביולו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המפתח של קרן מדעי הטבע של צ'ונגצ'ינג (לא. cstc2020jcyj-zdxmX0027) ופרויקט הקרן הלאומית הסינית למדעי הטבע (מס' 31670936, 82041045).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Ampicillin נתרן | Sangon Biotech | A610028 | |
| מונה תאים אוטומטי | Countstar | BioTech | |
| BCA ערכת כימות חלבון | cwbio | cw0014s | |
| ChemiDoc מערכת הדמיה נוגעת | ביו-ראד | ||
| אור דנאמי פיזור Malvern | Zetasizer Nano S90 | ||
| מנגנון אלקטרופורזה | Cavoy | Power BV | |
| EZ-Buffers H 10X TBST Buffer | Sangon Biotech | C520009 | |
| עז pAb לעכבר IgG1 | Abcam | ab97240 | |
| צנטריפוגה הקפאה במהירות גבוהה | Bioridge | H2500R | |
| His-Tag עכבר mAb | Cell איתות טכנולוגיה | 2366s | |
| Imidazole | Sangon Biotech | ||
| איזופרופיל בטא-D-תיוגלקטופירנוזיד | סנגון ביוטק | A600118 | |
| Ni-NTA His-Bind Superflow | Qiagen | 70691 | |
| אבקת חלב ללא שומן | סנגון ביוטק | A600669 | |
| OPM-293 מדיום תרבית תאים | Opm biosciences | 81075-001 | |
| pcDNA3.1 RBD-ST פלסמיד | ווהאן genecreat טכנולוגיה | ||
| מאגר פוספט מלח | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| פוליאתילנימין ליניארי | Polysciences | 23966-1 | |
| סולם חלבון צבוע מראש | Thermo | 26616 | |
| pThioHisA ClyA-SC פלסמיד | ווהאן genecreat טכנולוגיה ביולוגית | ||
| PVDF הממברנות המערביות | רוש | ||
| 03010040001 Quixstand מערכות שולחניות (עמוד סיבים חלולים 100 kD) | SDS-PAGE של GE healthcare | ||
| (5x) | Beyotime | P0015 | |
| נתרן כלורי | סנגון ביוטק | A100241 | |
| Supersignal west pico PLUS (פתרון כימילומינסנציה משופר) | Thermo | 34577 | |
| מכשיר מתלה | Life | Technology Hula מיקסר | |
| שידור מיקרוסקופ אלקטרונים | היטאצ'י | HT7800 | |
| טריפטון | אוקסואיד | LP0042B | |
| אולטרה צנטריפוגה | בקמן קולטר | XPN-100 | |
| ספקטרופוטומטר אולטרה סגול | היטאצ'י | U-3900 | |
| תמצית שמרים | סנגון ביוטק | A610961 |
מקורות
- Li, M., et al. Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update. Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).
- Micoli, F., MacLennan, C. A. Outer membrane vesicle vaccines. Seminars in Immunology. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
