מאמר שיטה

העברה מיטוכונדריאלית מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן עכבר לביציות עכברים מזדקנות

DOI:

10.3791/64217

⸱

6 בינואר 2023

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, the Third Affiliated Hospital, Soochow University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 3Center for Reproductive Medicine and Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את בידוד המיטוכונדריה מתאי גזע מזנכימליים שמקורם בעכברים, ולאחר מכן מעבירים את המיטוכונדריה לביציות עכברים מזדקנות כדי לשפר את איכות הביציות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשל הירידה בכמות ובאיכות הביציות הקשורות לגיל, הפוריות של נשים מעל גיל 35 ירדה בחדות. המנגנונים המולקולריים השומרים על איכות הביציות נותרו לא ברורים, ולכן קשה להגדיל את שיעור הילודה של נשים מעל גיל 35 כיום. ביציות מכילות יותר מיטוכונדריה מכל סוג של תא בגוף, וכל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה עלול להוביל לירידה באיכות הביציות. בשנות ה-90 של המאה ה-20, העברה ציטופלזמית של ביציות הביאה להצלחה רבה ברבייה אנושית אך לוותה במחלוקות אתיות. השתלה מיטוכונדריאלית אוטולוגית צפויה להיות טכניקה שימושית להגברת איכות הביציות שירדו עקב הגיל. במחקר הנוכחי, השתמשנו בתאי גזע שמקורם בשומן מעכברים מזדקנים כתורם מיטוכונדריה כדי להגביר את איכות הביציות של עכברים מזדקנים. פיתוח נוסף של טכנולוגיית העברה מיטוכונדריאלית אוטולוגית יספק טיפול חדש ויעיל לאי פוריות אצל נשים מבוגרות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד הגורמים החשובים המשפיעים על פוריות האישה הוא הזדקנות הביציות; ירידה באיכות הביציות היא הגורם העיקרי לאי פוריות אצל נשים מבוגרות. עם זאת, הגורם העיקרי להזדקנות הביציות והמנגנון המולקולרי המווסת את איכות הביציות עדיין אינם ברורים. מחקרים קודמים הצביעו על כך שגם מספר וגם איכות המיטוכונדריה מעורבים בבקרת האיכות של הביציות ובהתפתחות העובר 1,2,3. הירידה בכמות ובאיכות המיטוכונדריה קשורה קשר הדוק להזדקנות3.

נעשו ניסיונות רבים לשפר את תפקוד המיטוכונדריה בביציות מזדקנות, כולל תוסף התזונה של מיטוכונדריה והעברת מיטוכונדריה. בין תוספי התזונה הידועים והיעילים של מיטוכונדריה קו-אנזים Q10 (CoQ10), חומצה אלפא-ליפואית (α-LA) ורסברטרול (RSV)4. מחקרים הראו כי תוסף CoQ10 יכול לא רק לשפר את הירידה הקשורה לגיל בכמות ובאיכות הביציות, אלא גם לקדם התפתחות תקינה וביצוץ של ביציות5. α-LA מאט את הירידה באיכות הביציות הקשורה להזדקנות ולפנוטיפ המטבולי של חולים עם תסמונת השחלות הפוליציסטיות (PCOS)6,7. רזברטרול יכול להפחית את מספר הביציות עם צירים לא תקינים ויישור כרומוזומים לא תקין מוגבר בעכברים מזדקנים, תוך השפעה על ההתפתחות העוברית באופן תלוי מינון8. עם זאת, מכיוון שההשפעה הקלינית של תוספי תזונה של מיטוכונדריה לא הגיעה לרמות הצפויות, יש לחקור טיפולים יעילים אחרים.

הניסיון הראשון להעברת מיטוכונדריה בוצע בשנת 1997. העברת ציטופלזמה של ביציות מתורם צעיר לביציות מושתלות מבוגרות שיפרה את איכות הביציות של החולים הקשישים, שילדו תינוקות בריאים בהצלחה9, וזה היה הרציונל מאחורי השימוש בטכניקה זו. עם זאת, לא ניתן ליישם העברה ציטופלזמית של ביציות אלוגניות בפרקטיקה הקלינית משתי סיבות עיקריות - בעיית ההטרוגניות הגנטית ובעיות רגולטוריות הנגרמות על ידי השתלת מיטוכונדריה מתורם. מחקר קודם הראה כי השתלת מיטוכונדריה של תאים אוטולוגיים יכולה לשפר את איכות הביציות, התפתחות העובר והפוריות של עכברים מזדקנים10, שלא היו להם בעיות אתיות או הטרוגניות גנטית ופתרו כמה בעיות הנגרמות מהעברת ציטופלזמה של ביצית תורם לביציות מקבלות 10,11.

בינתיים, העברת מיטוכונדריה של תאים אוטולוגיים הייתה עדיפה על ההשפעה של תוספי תזונה קודמים של מיטוכונדריה על שיפור איכות הביציות11. לכן, השתלת מיטוכונדריה של תאים אוטולוגיים היא הבחירה המתאימה ליישום הקליני של טכנולוגיה זו12. ניתן להשיג תאי גזע שמקורם בשומן (ADSCs) בטכנולוגיה זעיר פולשנית, קלים לבידוד ולתרבית, ויכולים להיות תא "זרע" אידיאלי לרפואה רגנרטיבית. המיטוכונדריה עשירה ב-ADSCs, ותפקוד המיטוכונדריה אינו יורד עם הגיל, מה שמצביע על כך ש-ADSCs הם מקור מצוין למיטוכונדריה13,14. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה להעברת המיטוכונדריה של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בשומן עכבר לביציות עכברים מיושנות כדי לשפר את איכות הביציות. זהו מודל שימושי לטכנולוגיית העברה מיטוכונדריאלית אוטולוגית של ADSC אנושי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי ועדת האתיקה למחקר בבעלי חיים של בית החולים המסונף השלישי, אוניברסיטת סוצ'ו. כל הפעולות עוקבות אחר הסוכנות המתאימה לטיפול ושימוש בבעלי חיים והנחיות לאומיות. עיין בטבלת החומרים לפרטים על כל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. בידוד ואפיון של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בעכברים מזקנים (ADSCs)

  1. הקריבו את העכברים הקשישים (בני 10 חודשים, שלושה בממוצע) על ידי פריקת צוואר הרחם תחת הרדמת נתרן פנטוברביטל והשרו אותם באלכוהול 75% למשך 5 דקות לפני בידוד רקמת השומן.
    הערה: השריית 75% אלכוהול למשך 5 דקות יכולה להפחית ביעילות את זיהום התאים הראשוניים.
  2. בצע חתך של 2 ס"מ בעור על המפשעה הדו-צדדית, חשוף את השומן התת עורי והשתמש בפינצטה כדי לבודד את השומן התת עורי. אסוף את השומן המפשעתי הדו-צדדי מהעכברים באמצעות מספריים עיניים מעוקרים (הימנע מחיתוך הרקמה התת עורית). הנח את רקמת השומן בצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל על קרח והעביר אותה מיד למעבדת תרבית התאים.
  3. העבירו את רקמת השומן לצלחת של 6 בארות, שטפו אותה פי 3 עם מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) המכיל 100 U/mL של פניצילין וסטרפטומיצין. הסר את כלי הדם, הפאשיה השומנית ורקמת החיבור מתחת לרקמת השומן וחתך אותם לחתיכות בגודל ~0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ.
    הערה: כאשר מבודדים תאי גזע של שומן, לעתים קרובות יש זיהום של תאי אנדותל בכלי הדם. הסרת כלי הדם מרקמת השומן יכולה להפחית את זיהום תאי האנדותל בכלי הדם.
  4. העבירו את רקמת השומן הגרוסה לאותו נפח של תמיסת קולגנאז מסוג I (ריכוז סופי של 0.1% קולגנאז מסוג I) ועכלו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. הוסף נפח שווה של מדיום תרבית שלם (מדיום DMEM F-12 המכיל 10% סרום בקר עוברי) כדי לנטרל את הקולגנאז מסוג I, צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 10 דקות, והשליך את רקמת הסופרנטנט והשומן.
  6. השעו מחדש את כדור התא במדיום התרבות השלם. הסר את הרקמה הלא מעוכלת על ידי סינון דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן צנטריפוגה בחום של 600 × גרם למשך 5 דקות.
  7. השעו מחדש את תרחיף התאים עם 5 מ"ל של מדיום התרבות השלם והשתמשו בפיפטה של 1 מ"ל כדי להניע בעדינות למעלה ולמטה ליצירת מתלה חד-תא. בדוק את תרחיף התאים במיקרוסקופ על ידי הנחת אליקוט על המוציטומטר כדי לאשר שיש רק תאים בודדים, ללא אגרגטים. הוסף את התרחיף החד-תאי לבקבוק תרביתתאים בגודל 25 ס"מ 2 ותרבית בחממה של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
  8. שנה את מדיום התרבות 48 שעות לאחר מכן. המשך לשנות את מדיום התרבות כל 2-3 ימים.
  9. לאחר 7-10 ימים, נתק את התאים למעבר תאים כאשר המפגש שלהם מגיע ל 80%-90%. הסר את מדיום התרבות השלם ושטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA כדי לבצע את דיסוציאציה של התא15,16.
  10. הוסף מדיום אינדוקציה אדיפוגני למשך 14 יום כדי לגרום להתמיינות של ה-ADSCs לאדיפוקטים. הוסף מדיום אינדוקציה אוסטאוגני למשך 28 יום ל-ADSCs המצופים על צלחות 24 בארות מצופות ג'לטין 2% כדי לגרום להתמיינות שלהם לאוסטאובלסטים. לצורך התמיינות עצבית, תרבית את ה-ADSCs עם מדיום אינדוקציה עצבית, ולאחר מכן זיהוי אנולאז ספציפי לנוירונים ופוליפפטיד מתווך נוירופילמנט באמצעות אימונופלואורסצנציה15.
    1. תקן את התאים ב-4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חדירות עם 0.5% טריטון X-100 ב-PBS למשך 15 דקות.
    2. לאחר חסימה עם 3% BSA ב-PBS, יש לדגור על התאים עם נוגדנים ראשוניים (ראה טבלת חומרים) מדוללים בתמיסת חסימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    3. דגרו על התאים בנוגדנים משניים למשך 45 דקות ולאחר מכן צבעו אותם ב-DAPI למשך 10 דקות. לאחר מכן, בחנו את התאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  11. אסוף את תרחיף ה-ADSC החד-תאי באמצעות 0.05% טריפסין/EDTA, צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, והשהה מחדש ב-PBS כדי להתאים את צפיפות התאים ל-1 ×-106/מ"ל. יש להכניס את תרחיף התא לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל (100 מיקרוליטר / צינור) ולהוסיף נוגדנים חד שבטיים CD29, CD90, CD34 ו- HLA-DR עם תווית FITC, עם ריכוז נוגדנים של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל. טפלו בקבוצת הביקורת באותו נפח של ארנב IgG FITC, דגרו על קרח למשך 30 דקות ושטפו עם PBS כדי להסיר את הנוגדן הלא מצומד. זהה את סמני פני השטח של ADSC על ידי ציטומטריית זרימה13.

2. בידוד המיטוכונדריה מתאי גזע שומניים

הערה: כל פעולות בידוד המיטוכונדריה חייבות להתבצע על קרח.

  1. כאשר ה-ADSCs גדלים לצפיפות של 90%, עכל את התאים עם 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA, צנטריפוגה ב-600 × גרם למשך 5 דקות, אסוף וספור את התאים, וקח 1 ×-10-7 תאים לכל מיצוי.
  2. השעו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של מאגר מיצוי מיטוכונדריה (להכנת חיץ: 10 מ"ל של 0.1 M Tris-MOPS, 1 מ"ל של 0.1 M EGTA/Tris, ו-20 מ"ל של 1 M סוכרוז; הביאו את הנפח ל-100 מ"ל עם מים מזוקקים והתאימו את ה-pH ל-7.4) עם קוקטייל מעכב פרוטאז 1x לאחר שטיפה עם 2 מ"ל PBS סטרילי, ולאחר מכן דגירה על קרח למשך 5 דקות.
  3. הומוגניזציה של התאים 20x-30x עם הומוגנייזר זכוכית (2.0 מ"ל) ובדוק את מידת ההומוגניזציה על ידי צביעה כחולה טריפאן.
    הערה: שיעור התאים המוכתמים צריך להיות ~80%. הומוגניזציה מוגזמת תפגע במבנה המיטוכונדריה.
  4. צנטריפוגה התא הומוגנית ב-600 × גרם למשך 15 דקות, קח את הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש ומקורר מראש של 1.5 מ"ל, וחזור על הפעולה פעם אחת.
  5. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב-7,500 × גרם למשך 15 דקות והשליכו את הסופרנטנט. שטפו את המשקעים המיטוכונדריאלים והשעו אותם מחדש על ידי הוספת ~100 מיקרוליטר של מאגר הזרקה מיטוכונדריאלי מקורר מראש (225 מ"מ מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ KCl, 10 מ"מ Tris-HCl ו-5 מ"מ KH2PO4, pH 7.2), בריכוז של 1-5 מ"ג/מ"ל (ריכוז חלבון כולל). העבר את המתלה המיטוכונדריאלי על קרח.
  6. לנתח את התפקוד והטוהר של המיטוכונדריה המבודדת על ידי ניתוח ציטומטרי של זרימת JC-1 וכתם מערבי (VDAC1, β-actin ו-Lamin B)13.
    1. חלקו את המיטוכונדריה המבודדת לשלוש קבוצות: דימתיל סולפוקסיד (DMSO), מוכתם JC-1 ו-JC-1 מוכתם בטיפול מקדים של 30 דקות בקרבוניל ציאניד 3-כלורופנילהידרזון (CCCP).
    2. לאחר צנטריפוגה ב-7,500 × גרם, השליכו את הסופרנטנט והשעו את המאגר.
    3. ללכוד את עוצמת הקרינה של מונומרים JC-1 (ערוץ FITC) ואגרגטים (ערוץ PE) שנלכדו על ידי ציטומטריית זרימה. הערך את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית המבודדת על ידי מדידת היחסים בין עוצמת הקרינה הממוצעת של תעלת PE לערוץ FITC.
      הערה: בצע את השלבים לעיל בחושך.

3. גירוי-על בשחלות

  1. יש להזריק לעכברים נקבות C57BL/6 נקבות בנות 10 חודשים תוך צפקית עם 10 יחב"ל של גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG) לביוץ. לאחר 48 שעות, יש להזריק 10 יחב"ל של גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) תוך צפקית.
  2. לאחר 13 שעות לאחר הזרקת hCG, קרעו את החצוצרה הנפוחה בפינצטה מיקרוסקופית. שחרר את קומפלקסי הקומולוס מהחצוצרה הנפוחה. ממיסים את תאי הקומולוס במדיום M2 עם היאלורונידאז (0.3 מ"ג/מ"ל) ב-37 מעלות צלזיוס.
    הערה: זמן הפירוק הוא פחות מ-5 דקות. צמצם את הזמן שבו קומפלקס הקומולוס נחשף להיאלורונידאז, מכיוון שחשיפה ממושכת עלולה לפגוע בפוטנציאל ההתפתחות של הביציות.

4. העברה מיטוכונדריאלית יחד עם ICSI

  1. הכניסו את הזרע ללא זנב לנוזל המיטוכונדריאלי. השג זרע ללא זנב על ידי חיתוך באמצעות אולטרסאונד17. מניחים את הזרע ללא זנב בנוזל המיטוכונדריאלי, כך שיש 100 זרע ב-50 מיקרוליטר של הנוזל המיטוכונדריאלי.
    הערה: מכיוון שהמתלה המיטוכונדריאלי מעט צמיג ואינו יציב במבחנה, השלם את ההזרקה תוך 30 דקות והחלף את מחט המיקרו-הזרקה מיד כשהיא נסתמת. הקוטר הפנימי האופטימלי של מחט המיקרו-הזרקה הוא 5 מיקרומטר.
  2. הזריק ~2 pL של מאגר נשימה מיטוכונדריאלי או תרחיף מיטוכונדריאלי עם זרע לתוך הביציות באמצעות מיקרו-מזרק תחת מיקרוסקופ הפוך (200x; ראה טבלת חומרים) תוך 30 דקות על פי הפרוטוקול של הירמוטו כפי שתואר על ידי Mehlmann ו-Kline10,18.
    הערה: התרחיף המיטוכונדריאלי המוזרק מהווה 1%-3% מהנפח הכולל של הביציות. שלוט בנפח (1%-3%) של התרחיף המיטוכונדריאלי בציטופלזמה כדי להבטיח את עקביות ההזרקה.
  3. לאחר ההזרקה, הניחו את הביציות המופרות במדיום M2 לשיווי משקל למשך 15 דקות, והעבירו את הביציות המופרות ששרדו למדיום תרבית M16.
  4. בחן את הביצים הפוריות ששרדו על ידי התבוננות במורפולוגיה החלקה, היווצרות פרו-גרעינית ושחרור הגוף הקוטבי השני19. התבוננו, צלמו וספרו את העוברים בשעות 09:00 ו-18:00 כל יום במשך 4 ימים. לבסוף, אספו והקפיאו את הבלסטוציסטים ואחסנו אותם במקרר של -80 מעלות צלזיוס לקביעת מספר עותקים של ATP ו-mtDNA כדי להעריך את המספר והשיפור של השתלת המיטוכונדריה.
    1. הכן פלסמיד סטנדרטי (פלסמיד לכימות מוחלט, כמתואר קודם לכן13), לקביעת מספר עותק מיטוכונדריאלי על פי מספר העותק של 1 × 107, 1 × 106, 1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102 ו-1 × 101. העבירו את העוברים לצינור העיקור והוסיפו 20 מיקרוליטר של מאגר ליזאט כדי לשחרר את ה-DNA המיטוכונדריאלי. לאחר מכן, השבת את הפרוטאז בליזט ב-55 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. קבע את מספר עותק ה-mtDNA על ידי PCR כמותי פלואורסצנטי באמצעות ההגדרה הבאה: 5 מיקרוליטר של תערובת PCR, 0.5 מיקרוליטר של פריימר B6 קדימה, 0.5 מיקרוליטר של פריימר-סל"ד B6, 2 מיקרוליטר של תוצר פירוליזה ו-2 מיקרוליטר של ddH2O. עקוב אחר תנאי ה-PCR: שלב 1, 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; שלב 2, 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; חזור על המחזור פי 40.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הזה בודדנו ואפיינו ADSCs משומן עכבר (איור 1). כדי להשיג מיטוכונדריה מבודדת, יש לשבש את קרום התא באמצעות הומוגנייזר זכוכית. (איור 2A). חשוב להשיג שבר מיטוכונדריאלי אחיד ללא גושים גדולים כדי שצינור המיקרו-הזרקה לא ייחסם. ראשית, יש להשתמש ב-200 מיקרוליטר ולאחר מכן ב-10 מיקרוליטר בקצות פיפטה כדי להשעות את ההומוגנטים בעדינות; לבסוף, יש להשתמש במחט 29G כדי לשאוב לאט פעמיים או שלוש כדי להשיג את הרכיבים המיטוכונדריאלים שיכולים לשמש להזרקה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביציות מכילות יותר מיטוכונדריה מכל סוג של תא בגוף, עם ~1-5 × 105 מספרי עותקים של mtDNA. מיטוכונדריה חיונית להבשלת הביציות, ההפריה והתפתחות העובר, ולכן כל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה עלול להוביל לירידה באיכות הביציות. ירידה בכמות ובאיכות המיטוכונדריה קשורה קשר הדוק להזדקנות פיזיולוגית. בפרוטוקול זה, הוצגה שיטה פשוטה לבידוד מיטוכונדריה מה-ADSCs של עכברים מזדקנים והעברה לביציות עכברים מיושנות כדי לנסות לשפר את איכות הביציות המזדקנות.

מאז שמדענים ערכו את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לתמיכה מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82001629 ל-X.Q.S.), פרויקט המחקר הבסיסי של לשכת המדע והטכנולוגיה של צ'אנגג'ואו תחת מענק מספר CJ20200110 (ל-Y.J.Y.), תוכנית הנוער של קרן מדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20200116 ל-X.Q.S.), ומימון מחקר פוסט-דוקטורט של מחוז ג'יאנגסו (2021K277B עד X, ש.ס.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין/EDTAגיבקו25300054תרבית תאים
  4% פרפורמלדהידביוטייםP0099אימונופלואורסצנציה
40 μ מסננת תאיםm Corning352340ADSC בידוד
אינדוקציה אדיפוגניתCyagenHUXXC-90031התמיינות רב כיוונית
תמיסת צביעה אדומה אליזריןSigmaA5533התמיינות רב כיוונית
נוגדן נגד CD29BD Biosciencesניתוח זרימה
558741 נוגדן נגד CD34BD Biosciencesניתוח זרימה560942
נוגדנים נגד CD90BD Biosciencesניתוח זרימה553016
נוגדנים נגד HLA-DRBD Biosciences555560ניתוח זרימה
β-actinAbcamab-8226בדיקת תפקוד מיטוכונדריאלי
BSASigmaV900933אימונופלואורסצנטי
CCCPSolarbioC6700מיטוכונדריה JC-1 ניתוח זרימה
ChamQ אוניברסלי SYBR qPCR Master MixVazymeQ711qPCR
קולגנאז מסוג ISigmaSCR103בידוד ADSC
DAPI InvitrogenD1306אימונופלואורסצנטי
DMEM-F12Gibco11320033תרבית תאים
DMSOSigma276855מיטוכונדריה JC-1 ניתוח זרימה
EGTASigma324626בידוד מיטוכונדריה
FBSGibco10100147תרבית תאים
BD BiosciencesFACSCanto& סחר; IIמאפיינים של ADSCs
מיקרוסקופ פלואורסצנטיleicaDM2500ג'לטין אימונופלואורסצנטי
סיגמא48722צינור הומוגניזציה מזכוכית התמיינות רב כיוונית
מיטוכונדריהF519062סנגון
AibeiM2520גירוי-על שחלתי
היאלורונידאזסיגמאH1115000גירוי-על שחלתי
  מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIMT-2
ערכת צביעת מיטוכונדריה מבודדתSigmaCS0760מיטוכונדריה JC-1 ניתוח זרימה JC-1
SigmaT4069בדיקת תפקוד מיטוכונדריה
KClSigmaP5405העברת מיטוכונדריה
KH2PO4SigmaP5655העברת
מיטוכונדריהLaminBAbcamab-16048בדיקת תפקוד מיטוכונדריה
M16 MediumSigmaM7292תרבית תאי עובר
M2 MediumSigmaM7167תרבית תאי עובר
מניטולSigmaM9546העברת מיטוכונדריה
MicroinjectorOlympus+ eppendorfIX73העברת מיטוכונדריה
MitoTracker אדוםInvitrogenM22425מכתים מיטוכונדריה
MOPSSigmaM1442בידוד מיטוכונדריה
מתווך נוירופילמנט פוליפפטיד (NFM)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-16143התמיינות רב-כיוונית
אינדוקציה נוירוגניתGibcoA1647801התמיינות רב כיוונית
אנולאז ספציפי לנוירונים (NSE)סנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-292097התמיינות רב כיוונית
שמן אדום OסנגוןE607319התמיינות אדיפוגנית
אדום תמיסת OסיגמהO1516התמיינות רב כיוונית
אינדוקציה אוסטאוגניתCyagenHUXXC-90021התמיינות רב כיוונית
PBS (מי מלח חוצץ פוספט)היקלוןSH30256.LS תרבית תאים
פניצילין וסטרפטומיציןהיקלוןSV30010תרבית תאים
PMSGAibeiM2620מעכב גירוי-על שחלתי
סיגמאP8340בידוד מיטוכונדריה
סוכרוזסיגמאV900116בידוד מיטוכונדריה
TrisSigma648314בידוד מיטוכונדריה
Tris-HClSigma108319העברת מיטוכונדריה
Triton X-100beyotimeP0096אימונופלואורסצנטי
VDACAbcamab-14734בדיקת תפקוד מיטוכונדריה
ציטומטריית זרימת בידוד מיקרו-הזרקה שמן קוקטייל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sheng, X., et al. The mitochondrial protease LONP1 maintains oocyte development and survival by suppressing nuclear translocation of AIFM1 in mammals. eBioMedicine. 75, 103790(2022).
  2. Qi, L., et al. Mitochondria: the panacea to improve oocyte quality. Annals of Translational Medicine. 7 (23), 789(2019).
  3. Babayev, E., Seli, E. Oocyte mitochondrial function and reproduction. Current Opinion in Obstettrics & Gynecology. 27 (3), 175-181 (2015).
  4. Bentov, Y., Esfandiari, N., Burstein, E., Casper, R. F. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome of infertility treatment in older patients. Fertility and Sterility. 93 (1), 272-275 (2010).
  5. Ben-Meir, A., et al. Coenzyme Q10 restores oocyte mitochondrial function and fertility during reproductive aging. Aging Cell. 14 (5), 887-895 (2015).
  6. He, Y., Wang, Y., Zhang, H., Zhang, Y., Quan, F. Alpha-lipoic acid improves the maturation and the developmental potential of goat oocytes in vitro. Reproduction in Domestic Animals. 56 (4), 545-554 (2021).
  7. Gunalan, E., Yaba, A., Yilmaz, B. The effect of nutrient supplementation in the management of polycystic ovary syndrome-associated metabolic dysfunctions: A critical review. Journal of the Turkish German Gynecological Association. 19 (4), 220-232 (2018).
  8. Liu, M., et al. Resveratrol protects against age-associated infertility in mice. Human Reproduction. 28 (3), 707-717 (2013).
  9. Cohen, J., Scott, R., Schimmel, T., Levron, J., Willadsen, S. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs. Lancet. 350 (9072), 186-187 (1997).
  10. Wang, Z. B., et al. Transfer of autologous mitochondria from adipose tissue-derived stem cells rescues oocyte quality and infertility in aged mice. Aging. 9 (12), 2480-2488 (2017).
  11. Mobarak, H., et al. Autologous mitochondrial microinjection; a strategy to improve the oocyte quality and subsequent reproductive outcome during aging. Cell & Bioscience. 9, 95(2019).
  12. Bagheri, H. S., et al. Mitochondrial donation in translational medicine; from imagination to reality. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 367(2020).
  13. Sheng, X., et al. Mitochondrial transfer from aged adipose-derived stem cells does not improve the quality of aged oocytes in C57BL/6 mice. Molecular Reproduction & Development. 86 (5), 516-529 (2019).
  14. Arana, M., Mazo, M., Aranda, P., Pelacho, B., Prosper, F. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization. Methods in Molecular Biology. 1036, 47-61 (2013).
  15. Yang, Y., Zhang, C., Sheng, X. Isolation and culture of three kinds of umbilical cord mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (186), e64065(2022).
  16. Yang, Y., et al. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen scaffold improves ovarian function in a premature ovarian failure model of mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 55 (4), 302-311 (2019).
  17. Ward, M. A., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), (2018).
  18. Rinaudo, P., et al. Microinjection of mitochondria into zygotes creates a model for studying the inheritance of mitochondrial DNA during preimplantation development. Fertility and Sterility. 71 (5), 912-918 (1999).
  19. Arroyo, G., et al. Pronuclear morphology, embryo development and chromosome constitution. Reproductive Biomedicine Online. 20 (5), 649-655 (2010).
  20. Gosden, R. G., Johnson, M. H. Can oocyte quality be augmented. Reproductive Biomedicine Online. 32 (6), 551-555 (2016).
  21. Su, J., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen scaffolds restores ovarian function in a rat model of premature ovarian insufficiency. Human Reproduction. 31 (5), 1075-1086 (2016).
  22. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), 115963(2014).
  23. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

B
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים