הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות

4.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64236

⸱

9 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1INRAe, AgroParisTech, Micalis Institute, Université Paris-Saclay, 2Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz-Centre for Infection Research (HZI), 3Medical Faculty, University of Würzburg, 4Centre de Biochimie Structurale, INSERM U1054, CNRS UMR 5048, University of Montpellier

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול להכנה וכיול חיץ של תמציות תאים מזני נוקאאוט אקסונוקלאז V של Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD ו- ΔrecB). זוהי גישה מהירה, קלה וישירה לביטוי במערכות סינתזת חלבונים נטולות תאים באמצעות תבניות דנ"א ליניאריות.

תקציר

סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) הפכה לאחרונה לפופולרית מאוד בתחום הביולוגיה הסינתטית בשל יתרונותיה הרבים. שימוש בתבניות דנ"א ליניאריות עבור CFPS יאפשר עוד יותר לטכנולוגיה למצות את מלוא הפוטנציאל שלה, ויקצר את זמן הניסוי על ידי ביטול שלבי השיבוט, הטרנספורמציה ומיצוי הפלסמיד. ניתן להגביר את הדנ"א הליניארי במהירות ובקלות על ידי PCR כדי להשיג ריכוזים גבוהים של התבנית, תוך הימנעות מרעילות פוטנציאלית של ביטוי in vivo . עם זאת, תבניות דנ"א ליניאריות מתפרקות במהירות על-ידי אקסונוקלאזות שנמצאות באופן טבעי בתמציות התאים. ישנן מספר אסטרטגיות שהוצעו כדי להתמודד עם בעיה זו, כגון הוספת מעכבי נוקלאז או שינוי כימי של קצוות DNA ליניאריים להגנה. כל האסטרטגיות הללו עולות זמן ומשאבים נוספים ועדיין אינן משיגות רמות כמעט פלסמידים של ביטוי חלבונים. פרוטוקול מפורט לאסטרטגיה חלופית מוצג כאן לשימוש בתבניות DNA ליניאריות עבור CFPS. על-ידי שימוש בתמציות תאים מתאי נוקאאוט עם מחסור באקסונוקלאז, תבניות דנ"א ליניאריות נשארות שלמות ללא צורך בשינויי קצה כלשהם. אנו מציגים את שלבי ההכנה של ליזאט תאים מזן Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי תזה סוניקטיבית וכיול חיץ עבור Mg-גלוטמט (Mg-glu) ו- K-גלוטמט (K-glu) במיוחד עבור DNA ליניארי. שיטה זו מסוגלת להשיג רמות ביטוי חלבון דומות לאלה של דנ"א פלסמיד ב- E. coli CFPS.

מבוא

מערכות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) משמשות יותר ויותר כשיטה מהירה, פשוטה ויעילה להנדסת ביו-סנסורים, ייצור מבוזר ויצירת אב-טיפוס של מעגלים גנטיים1. בשל הפוטנציאל הגדול שלהם, מערכות CFPS משמשים באופן קבוע בתחום הביולוגיה הסינתטית. עם זאת, עד כה מערכות CFPS מסתמכות על פלסמידים מעגליים שיכולים להגביל את הטכנולוגיה מלהגיע למלוא הפוטנציאל שלה. הכנת דנ"א פלסמיד תלויה בשלבים רבים שגוזלים זמן רב במהלך השיבוט ובכמויות גדולות של בידוד דנ"א. מצד שני, ניתן להשתמש בהגברת PCR מפלסמיד, או מתבנית DNA מסונתזת, כדי פשוט להכין תבניות CFPS תוך מספר שעות 2,3. לכן, יישום של DNA ליניארי מציע פתרון מבטיח עבור CFPS. עם זאת, דנ"א ליניארי מתפרק במהירות על-ידי אקסונוקלאזות הנמצאות באופן טבעי בתמציות תאים4. ישנם פתרונות המטפלים בבעיה זו, כגון שימוש בחלבון λ-phage GamS5 או DNA המכיל אתרי צ'י6 כסוכני הגנה, או הגנה ישירה על הדנ"א הליניארי על ידי שינוי כימי של קצותיו 2,7,8,9. כל השיטות הללו דורשות תוספי מזון לתמצית התא, שהם יקרים וגוזלים זמן רב. זה ידוע כבר זמן רב כי קומפלקס אקסונוקלאז V (RecBCD) משפיל דנ"א ליניארי בתאיםליזטים 4. לאחרונה, הראינו שדנ"א ליניארי יכול להיות מוגן הרבה יותר טוב בליזאטים מתאים שהוצאו עבור גנים של אקסונוקלאז (recBCD)10.

בפרוטוקול זה, צעדים להכנת ליזטים ללא תאים מזן E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD על ידי סוניקציה ליזיס מתוארים בפירוט. סוניקציה ליזה היא טכניקה נפוצה ובמחיר סביר בשימוש על ידי מספר מעבדות11,12. התמציות המופקות מזן זה אינן זקוקות לתוספת של כל רכיב נוסף או שינוי בתבנית דנ"א כדי לתמוך בביטוי מתבניות דנ"א ליניאריות. השיטה מסתמכת על השלב החיוני של אופטימיזציה של חיץ עבור תמציות תאים במיוחד לביטוי DNA ליניארי ממקדמי E. coli מקומיים. הוכח כי אופטימיזציה ספציפית זו של חיץ לביטוי DNA ליניארי היא המפתח עבור מקדמי σ70 מקומיים להניב ייצור חלבון גבוה ללא חלבון GamS או תוספת DNA צ'י, אפילו הימנעות טיהור של מוצרי PCR10. הריכוז האופטימלי של Mg-glu לביטוי DNA ליניארי נמצא דומה לזה של דנ"א פלסמיד. עם זאת, הריכוז האופטימלי של K-glu הראה הבדל משמעותי בין דנ"א ליניארי לפלסמיד, ככל הנראה בשל מנגנון הקשורלתעתוק 10. הפונקציונליות של חלבונים המתבטאים בשיטה זו הוכחה עבור מספר יישומים, כגון סריקה מהירה של מתגי toehold והערכת פעילות של גרסאות אנזים10.

פרוטוקול זה מספק פתרון פשוט, יעיל וחסכוני לשימוש בתבניות דנ"א ליניאריות במערכות ללא תאי E. coli פשוט על ידי שימוש בתמציות תאים מוטנטיות ΔrecBCD וכיול ספציפי לדנ"א ליניארי כתבנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה ומאגר

  1. הכנת 2xYT+P בינוני (מוצק ונוזלי)
    1. הכן מדיה נוזלית ומוצקה כמתואר בטבלה 1, ולאחר מכן עקר על-ידי autoclaving.
      הערה: פרוטוקול זה דורש צלחת אגר אחת של 2xYT+P המכילה כלוראמפניקול (10 מיקרוגרם/מ"ל). נפח המדיה הנוזלית פרופורציונלי לנפח הליזאט הנדרש. כאן, נפח התחלתי של 5 ליטר של מדיה נוזלית 2xYT+P משמש. עם זאת, ניתן לכוונן את הנפח לפי הצורך, בידיעה ש-1 ליטר מתרבית התאים גורם ל-2 עד 3 מ"ל של ליזאט התא הסופי.
  2. הכנת כלוראמפניקול (34 מ"ג/מ"ל)
    1. שוקלים 0.34 גרם של כלוראמפניקול, מוסיפים אתנול ל-10 מ"ל וממיסים על ידי ערבוב. Aliquot 1 מ"ל כל אחד למספר צינורות, ולאחסן ב -20 °C לשימוש מאוחר יותר.
  3. הכנת חיץ S30A
    1. הכינו חיץ S30A לפי טבלה 2, תוך שאיפה ל-2 ליטר של חיץ זה.
      הערה: שוב, עוצמת הקול של מאגר זה פרופורציונלית לנפח הליזאט הנדרש.
    2. לפני האוטוקלאב, התאימו את ה-pH של החיץ ל-7.7 באמצעות חומצה אצטית קרחונית.
    3. אוטוקלאב את המאגר.
    4. יש לשמור על חיץ זה בטמפרטורה של 4°C לאחר ההרכבה האוטומטית.
    5. לפני השימוש, יש להוסיף DTT (מסונן על-ידי מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר) למאגר S30A כדי להגיע לריכוז סופי של 2 mM (2 מ"ל של מלאי 1 M DTT עד 1 L של מאגר S30A).
      הערה: שוב, עוצמת הקול של מאגר זה פרופורציונלית לנפח הליזאט הנדרש.
  4. הכנת תמיסת אנרגיה
    הערה: תמיסת אנרגיה זו מבוססת על נייר13 של Sun et al. (ריכוז מלאי של פי 14). טבלה 3 משחזרת את הרכיבים הדרושים להכנת מלאי תמיסות האנרגיה, עם מספרים קטלוגיים עבור כל הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה.
    1. הכינו את פתרונות המלאי לפי טבלה 3 ושמרו אותם על קרח.
    2. כייל את ה-pH כמבוקש עבור הרכיבים שצוינו, באמצעות חיץ Tris 2 M (60.57 גרם של בסיס Tris בנפח של 250 מ"ל של מים סטריליים) או KOH 15% (15 גרם של KOH בנפח של 100 מ"ל של מים סטריליים) כפי שמצוין בטבלה 3.
    3. בצינור של 15 מ"ל, הוסף את הנפח של כל רכיב בסדר המצוין בטבלה 3.
    4. Aliquot תמיסת האנרגיה, 150 μL לכל צינור.
    5. יש להקפיא את האליקוטים על קרח יבש ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
  5. הכנת תמיסת חומצות אמינו (AA)
    הערה: תמיסת חומצות האמינו מוכנה על-ידי ערכת דוגם חומצות האמינו RTS. כל אחת מ-20 חומצות האמינו מסופקת בערכה זו כנפח של 1.5 מ"ל ב-168 מ"ל, למעט לאוצין שהוא ב-140 מ"ל. כאן, פתרון המלאי המוכן הוא מרוכז פי 4, ולא פתרון העבודה הנדרש. הריכוז הסופי של תמיסת חומצות האמינו הוא 6 mM עבור כל חומצות האמינו, למעט לאוצין שהוא 5 mM.
    1. מפשירים את 20 צינורות חומצות האמינו על ידי מערבולות ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם מומסים לחלוטין.
      הערה: ייתכן ש-Cys לא יתמוסס במלואו.
    2. בצינור של 50 מ"ל, הוסף 12 מ"ל מים סטריליים ו-1.5 מ"ל כל אחת מחומצות האמינו בסדר המצוין בטבלה 4.
    3. מערבולת עד שהפתרון ברור למדי, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במידת הצורך.
      הערה: ייתכן ש-Cys לא יתמוסס במלואו.
    4. Aliquot 500 μL של תמיסת חומצת האמינו לכל צינור על קרח.
    5. הקפיא את האליקוטים על קרח יבש ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  6. הכנת פתרונות לכיול חיץ
    1. הכן את תמיסת המלאי עבור Mg-glu (100 mM) ו- K-glu (3 M) כפי שמצוין בטבלה 5. בצע דילול סדרתי (בנפח של 1 מ"ל) ממלאי זה עבור Mg-glu (0 עד 20 mM) ו- K-glu (20 עד 300 mM) כפי שמצוין בקובץ משלים 1 עבור שלבי כיול.
      הערה: ריכוזי מלאי אלה מיועדים לשלב הכיול וייתכן שיהיה צורך לשנותם בעת הגדרת הניסוי הסופי. הריכוזים הגבוהים ביותר של המלאי שנבדקו עבור פרוטוקול זה הם 1 M ו-4.5 M עבור Mg-glu ו-K-glu, בהתאמה.
  7. הכנת מלאי פתרונות PEG8000
    1. הכן 50 מ"ל של 40% PEG8000 פתרון (20 גרם של PEG8000 בנפח 50 מ"ל של מים סטריליים).

2. תרבית תאים והכנת ליזאט (ניסוי של 4 ימים)

  1. יום 1
    1. זן פסים BL21 Rosetta2 ΔrecBCD (טבלה 6) מ-80°C גליצרול על צלחת אגר 2xYT+P המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול. לחלופין, ניתן להשתמש גם ב-BL21 Rosetta2 ΔrecB (טבלה 6)10.
    2. דגירה לילה ב 37 °C (86 °F).
  2. יום 2
    1. לחסן מושבה אחת מצלחת האגר הנ"ל ל-10 מ"ל של 2xYT+P בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול.
    2. יש לדגור במשך הלילה בטמפרטורה של 37°C עם רעידות של 200 סל"ד.
  3. יום 3
    1. צור תת-תרבות על-ידי דילול תרבית הלילה 100 פעמים ל-4 ליטר של מדיה טרייה 2xYT+P המכילה 10 מיקרוגרם/מ"ל כלוראמפניקול.
      הערה: לדוגמה, 40 מ"ל של תרבות הלילה מתווספים ל-3960 מ"ל של מדיה טרייה. לאחר דילול, המדיה של 4 L מחולקת ל-4 צלוחיות (נפח 5 L) כך שכל בקבוקון מכיל 1 L.
    2. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד במשך כ-3 עד 4 שעות של צמיחה כדי להגיעל-OD 600 של 1.5-2.0. לדלל את התרבית פי 4 אם מודדים OD600 > 0.8.
      הערה: זמן הדגירה המדויק עשוי להשתנות בהתאם לזן, לאינוקולום הראשוני, לכלי המעבדה ולמכשירים שבהם נעשה שימוש. לזני הנוקאאוט ΔrecB/ΔrecBCD יש שיעורי גדילה דומים לאלה של הורי BL21 Rosetta2 (איור משלים 1).
    3. שים את התרבות על הקרח.
    4. סובבו את התאים בטמפרטורה של 5,000 x g למשך 12 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק.
    5. השהה את כדורי התא ב-800 מ"ל של S30A+DTT מקוררים.
      הערה: הנפח של S30A+DTT קטן פי 5 מנפח תרבית התאים המקורי. לדוגמה, עבור נפח התחלתי של 1 ליטר של תרבית התא, יש להשעות את כדוריות התא ב-200 מ"ל של S30A+DTT. מומלץ גם לבצע צעד זה בחדר קר ב 4 מעלות צלזיוס, כמו גם שמירה על כל החומרים על קרח.
    6. סובבו את התאים בטמפרטורה של 5,000 x g למשך 12 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק.
    7. חזור על שלבים 2.3.5 ו- 2.3.6.
    8. יש להדביר את כדוריות התאים ב-160 מ"ל של S30A+DTT צונן.
      הערה: הפעם הנפח של S30A+DTT קטן פי 25 מנפח תרבית התאים המקורי. לדוגמה, עבור נפח התחלתי של 1 ליטר של תרבית התא, יש להשעות את כדוריות התא ב-40 מ"ל של S30A+DTT. שוב, מומלץ לבצע את הצעד הזה בחדר קר ב 4 מעלות צלזיוס, כמו גם כדי לשמור את החומרים על קרח.
    9. העבירו את התאים לצינורות 50 מ"ל מקוררים ושקלים מראש.
    10. סובבו את התאים ב-2,000 x g למשך 8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השליכו את הסופר-נטנט על ידי פירוק.
    11. סובבו את התאים בטמפרטורה של 2,000 x g למשך 4 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הסירו בזהירות את הסופר-נאטנט הנותר על ידי שימוש בפיפטה.
    12. מדוד מחדש את משקל הצינור כדי לחשב את משקל כדור התא.
    13. שמור את כדורי התא ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. יום 4
    1. קח את כדורי התא מ -80 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותם על קרח במשך 1-2 שעות.
    2. השהה את כדורי התא ב-0.9 מ"ל של חיץ S30A+DTT לגרם ממשקל הכדורים. פיפטה לאט כדי להשעות את התאים, הימנעות קצף העליון ככל האפשר, אם בכלל.
    3. מניחים 1 מ"ל aliquots של התאים המחיים לתוך 1.5 מ"ל microtubes, ולשמור אותם על קרח או בלוק קר מקורר מראש ב 4 מעלות צלזיוס (עדיף להשתמש בלוקים מתכת).
      הערה: אם האליקוט האחרון הוא הרבה פחות מ-1 מ"ל, עדיף להשליך אותו מאשר לנפח תת-אופטימלי. הנפח האופטימלי (1 מ"ל) עבור סוניקציה נקבע עבור מערך זה (צינור, סוניקטור וגשושית), ועשוי להשתנות עבור מערך אחר.
    4. סוניקטור כל צינור בסוניקטור (בדיקה 3 מ"מ, תדר 20 קילוהרץ), עם מערך של 20% משרעת לשלושה מחזורים (סוניקציה של 30 שניות, הפסקה של דקה אחת).
      הערה: האנרגיה הכוללת שהועברה בשלושת המחזורים הייתה ~266 ג'אול (~80-110 ג'אול למחזור). במהלך שלב זה, שמור את הצינורות על בלוק קר כי הוא מוקף קרח. החליפו בין שני בלוקים קרים כדי למנוע התחממות יתר של הגשושית (בלוק הקור ההמתנה נשמר גם קר על קרח). שני הבלוקים הקרים היו מקוררים מראש במקרר יום לפני הסוניקציה.
    5. סובבו את הליזאט ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. לאסוף את supernatant (ליזאט התא) עם פיפטה ולהעביר צינור 50 מ"ל.
    7. לדגור את התא lysate ב 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד תסיסה במשך 80 דקות.
    8. סובבו את הליזאט ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    9. אסוף את הסופר-נאטנט והאליקוט 30 μL כל אחד במיקרו-צינוריות מקוררות מראש של 1.5 מ"ל, תוך שמירה על כל הצינורות על קרח.
    10. מקפיאים בהבזק את האליקוטים של ליזאט על קרח יבש ומאחסנים בטמפרטורה של -80°C.

3. כיול מאגר ללא תאים עבור DNA ליניארי

הערה: מאגר ללא תאים כויל לריכוזים אופטימליים של Mg-glu ו-K-glu כמתואר ב-Sun et al.13. יש צורך בקובץ משלים 1 לשלבי הכיול. התגובות נקבעו לנפח סופי של 10.5 μL כל אחת. התמציות כוילו באמצעות 1 ננומטר של דנ"א ליניארי (ראה סעיף 4 להלן) או דנ"א פלסמיד. ניתן לבצע את הניסויים באותו יום שבו המאגרים מוכנים, או להקפיא את המאגרים המוכנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי לבצע את הניסוי ביום אחר. עבור כל שלבי הכיול, כל רכיב הופשר על קרח לפני ערבוב וצינור לתוך צלחת 384 באר.

  1. הכן תערובת מאסטר, על פי הכרטיסייה 'הכנת מאגר' בקובץ Excel קובץ משלים 1, המכיל: (א) תמצית תאים (33% מנפח התגובה הכולל), (ב) דנ"א מדווח (כדנ"א ליניארי ו/או פלסמיד) לריכוז סופי של 1 ננומטר, (ג) מאגר ללא תאים (PEG8000, תמיסת AA ותמיסת אנרגיה), ו-(ד) K-glu לריכוז סופי של 80 mM.
  2. עבור נפח תגובה של 10.5 μL, קח 1.05 μL (10% תגובה כוללת) של ריכוזים שונים של מלאי מרוכז Mg-glu 10x (טווחי ריכוז סופיים: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ו- 20 mM) והוסף 9.45 μL (90% תגובה כוללת) של תערובת המאסטר. מערבבים בעדינות.
    הערה: השתמש בצינורות PCR בעלי שמונה רצועות כדי להכין את הדילולים ולערבב עם פיפטה רב-ערוצית. במידת הצורך, ניתן להשתמש בטווח שונה של ריכוזי Mg-glu.
  3. Pipette 10 μL של התגובות הנ"ל לתוך microplate 384 תחתית מרובעת היטב, לכסות אותו באמצעות חותם צלחת דבק, ולמדוד ביטוי גנים כמו פלט פלואורסצנטי. הקלט נתוני פלואורסצנטיות באמצעות קורא צלחות (לדוגמה: 485 ננומטר; Em: 528 ננומטר) במרווחים קבועים (למשל, 5 דקות) במשך 8 שעות של דגירה ב-30 מעלות צלזיוס עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 עותקים לדקה.
    הערה: במידת הצורך, סובב את המיקרו-פלטה בגודל 384 בארות (<2,500 x גרם, דקה אחת, טמפרטורת החדר) לפני תחילת איסוף הנתונים. מדידות נקודת קצה שימשו להשוואת ביטוי GFP בהרכבי המאגרים השונים. ניתן להמיר את ערכי הפלואורסצנציה ליחידות סטנדרטיות לצורך התווייה (ראה להלן).
  4. זהה את ריכוז Mg-glu שמביא לערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר בנקודת הקצה.
    הערה: אם אינכם בטוחים לגבי ריכוז ה-Mg-glu האופטימלי שהושג, חזרו על שלב 3.2 עם טווחי ריכוז מגוונים יותר.
  5. עם ריכוז Mg-glu הממוטב, המשך לכיול K-glu עבור מגוון ריכוזים (20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 ו- 240 mM), תוך שימוש באותם נפחים המצוינים בשלב 3.2. הפעל את הניסוי וזהה את הערך הפלואורסצנטי הגבוה ביותר מבין ריכוזי K-glu שנבדקו. זה מציין את הרכב החיץ האופטימלי עבור Mg-glu ו- K-glu עבור ליזאט זה.
    הערה: אם אינכם בטוחים לגבי ריכוז K-glu האופטימלי שהושג, חזרו על השלב עם טווחי ריכוז מגוונים יותר.
  6. לאחר קביעת ערכי Mg-glu ו- K-glu, הכן צינורות מלאי של הרכב החיץ האופטימלי בהתאם לנפח האצווה המתקבל. השתמש בכרטיסייה 'הכנת חיץ' בקובץ משלים 1 כדי לחשב את מספר צינורות החיץ הדרושים, aliquot 38 μL לכל צינור, ולאחסן ב -80 °C.

4. הכנת DNA ליניארי

הערה: לכיול ליזאט, נעשה שימוש בפלסמיד P70a-deGFP. פלסמיד זה נשמר ב- E. coli KL740 cl857+ (טבלה 6) עבור miniprep באמצעות ערכת Miniprep פלסמיד, או maxiprep באמצעות ערכת Maxiprep פלסמיד. מקטעי דנ"א ליניאריים ששימשו כתבניות ביטוי בתגובות נטולות התאים הוגברו באמצעות הפריימרים והתבניות המפורטים בטבלה 7 ובטבלה 8.

  1. הגברת PCR מפלסמיד P70a-deGFP באמצעות DNA פולימראז עם פריימרים אוליגו המפורטים בטבלה 7. הגדר את תגובות ה- PCR בנפח של 50 μL, על פי פרוטוקול היצרן, באמצעות תוכנית thermocycler: [98 °C למשך 2 דקות; 40 מחזורי x (98 °C למשך 30 שניות → 66 °C למשך 30 שניות → 72 °C למשך 60 שניות); 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 4 מעלות צלזיוס למשך ∞].
  2. עכל את הדנ"א של התבנית בתגובות ה-PCR על-ידי הוספת 1 μL של אנזים הגבלת DpnI לכל תגובת PCR של 50 μL ודגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לטהר את תגובת ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי PCR ו-DNA ולהצטייד במים נטולי נוקלאזה.
  3. יש לאמת את מוצרי ה-PCR על ג'ל אגרוז 1% (1x TAE) לפני השימוש.
  4. כמת את מוצרי ה-PCR המטוהרים (או את מכיני הפלסמיד) באמצעות Nanodrop (ND-1,000).
    הערה: אם משתמשים בפולימראז/חיץ דנ"א התואם ישירות לתגובה נטולת התאים במורד הזרם, ניתן לדלג לחלוטין על שלב הטיהור (שלב 2) ועל ריכוז הדנ"א הלא מטוהר נמדד על ידי בדיקה פלואורומטרית עם צבע קושר דנ"א במקום זאת (ראו Batista et al.10).

5. ביצוע ניסיוני

הערה: בנוסף לשימוש בקובץ משלים 1 כדי לכייל את מלאי המאגר עבור כל אצווה של ליזאט שהוכנה (לעיל), מומלץ להשתמש בכרטיסייה 'הכנת תגובה' בקובץ כדי להגדיר את התגובות הבאות ללא תאים. כמו בעבר, נפח התגובות נקבע על 10.5 μL לכל תגובה, מתוכם רק 10 μL הוא סוף סוף pipetted לתוך צלחת 384 באר לאיסוף נתונים. כאן, 5 ננומטר מכל תבנית משמשים לביטוי ללא תאים. חשוב להיות עקביים בעת התגובות - להשתמש באותה פיפטה ובסוג הטיפים. יש לטפטף בזהירות כדי למנוע בועות בבאר או כל נוזל שנדבק לקירות הבאר. במידת הצורך, סובבו את הצלחת (<2,500 x גרם, דקה אחת, בטמפרטורת החדר).

  1. חשב את אמצעי האחסון לפיפטה על-ידי הזנת תיאורי הדגימה והשכפולים הדרושים לכל דגימה בכרטיסייה 'הכנת תגובה' בקובץ משלים 1.
    הערה: אם נדרש אמצעי אחסון תגובה שאינו 10.5 μL, ניתן להזין אותו גם לקובץ משלים 1. הקובץ יחשב את מספר הצינורות של מאגרי חיץ שעברו אופטימיזציה בעבר ואת צינורות תמצית התאים שיש להפשיר על קרח.
  2. תייג מיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל להכנת תערובת מאסטר אופטימלית (בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד), הוסף את הנפחים הנכונים של ה-Buffer וה-Lysate וערבב בעדינות.
    הערה: בשל הבדלים בריכוזי K-glu אופטימליים במאגרים שלהם, יש ליצור עותקים של הכרטיסייה 'הכנת תגובה' לשימוש בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד.
  3. פיפטה של דגימות הדנ"א תחילה, לאחר מכן מים נטולי נוקלאזה, ולבסוף תערובת האב האופטימלית (MM) משלב 5.2. ערבבו את התגובה נטולת התאים בעדינות עם הפיפטה רגע לפני שתוסיפו אותה לקורא הצלחות והימנעו מבועות.
    הערה: השתמש בצינור PCR בעל שמונה רצועות כדי לערבב את נפח התגובה לקבלת שכפול נוסף. לדוגמה, אם מיועדים לשלשות טכניות, הכינו תערובת לארבע תגובות והשאירו נפח מת בצינור על מנת להפחית את שגיאות הפיפטינג תוך הוספת הדגימות לצלחת.
  4. הגדר את התגובות בקורא הלוחות (Ex 485 nm; Em 528 ננומטר). ריצות קינטיות תיעדו נתוני פלואורסצנטיות במרווחי זמן קבועים (למשל, 5 דקות) במשך 8 שעות של דגירה ב-30 מעלות צלזיוס, עם רעידות מסלוליות רצופות ב-307 סל"ד.
    הערה: מדידות נקודת הקצה דווחו כנקודת הזמן של 8 שעות. ערכי הפלואורסצנציה שנאספו הם ביחידות שרירותיות (a.u.), אך ניתן להמיר אותם ליחידות סטנדרטיות לצורך התוויה (ראה להלן).

6. כימות יחסי של FITC ו-GFP

הערה: ביטוי GFP מיוצא על-ידי קורא הלוחות ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות (a.u.). עם זאת, מומלץ להשתמש ביחידות מידה סטנדרטיות על מנת להשוות ערכי פלואורסצנציה בין הגדרות שונות (קבוצות, ציוד, משתמשים ומעבדות). מוצגים כאן שלבים מפורטים להמרת ערכי הפלואורסצנציה (a.u.) לערכים שווי ערך ל- FITC ולערכים eGFP (μM), תוך שימוש בעקומות סטנדרטיות של NIST-FITC ו- eGFP רקומביננטי. אחסן את פתרון המלאי של NIST-FITC ב-4°C ואחסן eGFP רקומביננטי ב-20°C-. ודא שתמיסת המלאי והדילולים הסדרתיים מוגנים מפני אור. עם המסירה, מומלץ לדחוס את ה-eGFP הרקומביננטי לנפחים קטנים יותר כדי למנוע מחזורי הפשרה מרובים בהקפאה.

  1. הכינו תמיסה של 100 mM נתרן בוראט, pH 9.5, ולאחסן בטמפרטורת החדר או ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן 12 דילולים (70 μL כל אחד) עבור העקומה הסטנדרטית, 2x לכל צעד (50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562, 0.781, 0.390, 0.195, 0.097, 0.048 ו- 0 μM) של תקן FITC הניתן למעקב NIST ממלאי 50 μM באמצעות תמיסת נתרן בוראט. הכינו את סדרת הדילול במשולש.
  3. בדומה לשלב 6.2, הכינו דילולים סדרתיים (70 μL כל אחד) מה-eGFP הרקומביננטי באמצעות תמיסת הנתרן בוראט (1.2, 0.3, 0.075, 0.0188, 0.0047, 0.0012, 0.,0003, 0.,00007 ו-0 μM). לצורך חישוב טוחנות, שקול את הגודל המלא של החלבון (28 kDa) ואת הריכוז של eGFP מטוהר (1 גרם / ליטר). הכינו את סדרת הדילול במשולש.
  4. הוסף 20 μL מכל דילול (תשע בארות כל אחת = שלוש סדרות דילולים x שלושה שכפולים טכניים) למיקרו-פלטה בעלת תחתית מרובעת של 384 בארות, המכוסה על ידי חותם צלחת דבק, ודגירה בקורא צלחות למדידה.
    הערה: כאן, ההגדרות ששימשו היו עירור: 485/20, פליטה: 528/20, עם רווח 50. עם זאת, ניתן להשתמש בשילובי אורכי גל/רווח נוספים גם כדי לכייל מולקולות פלואורסצנטיות אחרות ו/או הגדרות רווח. כדי לחשב את מקדם ההמרה, נדרשות הגדרות אורך גל ורווח זהה כדי לרכוש את נתוני הפלואורסצנציה של GFP מהניסויים נטולי התאים ומנתוני העקומה הסטנדרטיים.
  5. השתמש בטווח האותות הליניארי (כאן, לדוגמה, [FITC] ≤ 0.781 μM) כדי להתאים את השיפוע [y = ax ו- R2] עבור כל תנאי.
    הערה: הטווח עשוי להיות שונה עבור מכונות שונות ופתרונות סטנדרטיים בשימוש.
  6. שמור את הנתונים עבור כיול FITC ו- eGFP כדי לחשב מדידות יחסיות עבור המעבדה על-ידי ביצוע הדוגמה בטבלה 9. חלק את הערכים המתקבלים ביחידות שרירותיות פלואורסצנטיות (a.u.) על ידי ערך שיפוע העקומה "a" (y = ax) כדי להעריך את ייצור GFP במונחים של FITC או eGFP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות מייצגות מוצגות כאן לאחר כיול הליזאט לרמות אופטימליות של Mg-גלוטמט ו-K-גלוטמט בנפרד עבור דנ"א ליניארי ופלסמיד (איור 1). הריכוז האופטימלי של Mg-גלוטמט דומה בתמציות Δ recB ו-ΔrecBCD ב-8 mM (איור 1B). עם זאת, ריכוז K-גלוטמט אופטימלי עבור דנ"א פלסמיד הוא 140 mM, בעוד שריכוז K-גלוטמט אופטימלי עבור דנ"א ליניארי עבור אותה תמצית הוא 20 mM (איור 1C). בניתוח השוואתי של ביטוי GFP בתמציות מתאיWT ו- Δ recBCD, נרא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מראים כי ליזאט תאים שהוכן מ- E. coli BL21 Rosetta2 עם נוקאאוט גנומי עבור אופרון recB או recBCD תומך בביטוי חלבון גבוה מתבניות DNA ליניאריות. פרוטוקול זה מפרט הליך כיול ליזאט שלב אחר שלב הספציפי לתבניות דנ"א ליניאריות (איור 2), שהוא שלב קריטי שמוביל לביטוי גבוה של מקדמי σ70 בדנ"א ליניארי, ומגיע לרמות כמעט פלסמיד עבור ריכוזי דנ"א שווים. פרוטוקול זה מדגיש את החשיבות של כיול המאגר בהתאם לסוג הדנ"א (ליניארי או פלסמיד) שישמש ביישום הסופי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

ACB ו-JLF מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF ו-JB מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA ו-JLF מכירים בתמיכה במימון על ידי מענק ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB מאשרת תמיכה מה-ERC החל מ-"COMPUCELL" (מספר מענק 657579). המרכז לביוכימי סטרוקטורלה (Centre de Biochimie Structurale) מכיר בתמיכת התשתית הצרפתית לביולוגיה מבנית משולבת (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). ח"כ מודה על תמיכה במימון ממחלקת MICA של INRAe, אוניברסיטת פריז-סקלי, DIM-RFSI של אזור איל-דה-פראנס (IdF) ו-ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). עבודה זו נתמכה על ידי מימון באמצעות פרס המאגד של מועצת המחקר האירופית (865973 ל-CLB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-YT מרקInvitrogen22712020
1.5 מ"ל צינורות נעילה בטוחהEppendorf301200861.5 מ"ל מיקרו-צינור
384 בארות מיקרו-פלטה תחתונה מרובעתThermo Scientific Nunc142761
3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium)Sigma-AldrichP8877
חותם צלחת דבקThermo Scientific Nunc
AgarInvitrogen30391023
ATP (אדנוזין 5'-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט)Sigma-AldrichA8937
BL21 Rosetta2Merck Millipore71402
BL21 Rosetta2 Δ recBAddgene176582
BL21 Rosetta2 Δ recBCDAddgene176583
cAMP (אדנוזין 3' 5'-מונופוספט מחזורי)סיגמא-אולדריץ' A9501
כלורמפניקול Sigma-AldrichC0378
CoA (קו-אנזים A הידרט)Sigma-AldrichC4282
Corning 15 מ"ל PP צינורות צנטריפוגה, מתלה ארוז במכסה CentriStar,קורנינג43079015 מ"ל צינור
קורנינג 50 מ"ל PP צינורות צנטריפוגה, תחתית חרוטית עם מכסה CentriStar,430828 צינור סטרילי50 מ"ל CTP
(Cytidine 5'-triphosphate, מלח דיסודיום הידרט)אלפא אזר  J62238
DpnINEBR0176S
DTT (DL-DITHIOTHREITOL)Sigma-AldrichD0632
חומצה פולינית (חומצה פולינית מוצקה, מלח סידן)Sigma-AldrichF7878
GTP (גואנוזין 5?-טריפוספט,  מלח דיסודיום)סיגמא-אולדריץ'371701
HEPESסיגמא-אולדריץ'  H3375
K פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)קרל רוט231-834-5
K פוספט מונו-בסיסי (H2KO4P)סיגמא-אולדריץ'P5655
K-גלוטמטאלפא AesarA17232
מ"ג-גלוטמט Sigma-Aldrich49605
Millex-GP, 0.22 ומיקרו; m, polyethersulfoneMerck Milliporeמסנןממברנה SLGP033RB 0.22 ומיקרו; m
Monarch PCR & ערכת ניקוי DNANEBT1030SPCR & ערכת ניקוי DNA
ערכת מיני-הכנה פלסמיד מונרךNEBT1010Sערכת מיני-הכנה פלסמיד
NAD (B-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד הידרט) סיגמא-אולדריץ' N6522
NIST-traceable FITC תקןInvitrogenF36915NIST-FITC
NucleoBond Xtra Maxi kitMacherey-Nagel740414.1פלסמיד Maxiprep Kit
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
קורא צלחותBiotek סינרגיה HTX
מטוהר רקומביננטי EGFP חלבוןChromotekEGFP-250רקומביננטי eGFP
Q5 נאמנות גבוהה 2X מאסטר מיקסNEBM0492SDNA פולימראז
Q5 נאמנות גבוהה 2X מאסטר מיקסניו אינגלנד BiolabsM0492LDNA פולימראז
Qubit dsDNA BR ערכת בדיקהתרמוQ32850בדיקה פלואורומטרית עם צבע קושר DNA
RTS Amino Acid SamplerbiotechrabbitBR1401801
SpermidineSigma-Aldrich85558
מיםסטריליים מים מטוהרים ממערכת Millipore RiOs 8, מעוקרים על ידי חיטוי.
הבסיסיים של TrisCytiva17-1321-01 
tRNARoche10109550001
מעבד אולטרסאונד תא ויברה VC-505SONICSVC505סוניקטור
UTP Na3 (אורידין 5'- טריפוספט, טריסודיום מלח הידרט)Acros Organics 
מים, מים ללא נוקלאזThermoR0581נוקלאז
232701 סטרילי יחידת מסנן מזרק מוצרי מדעי החיים 226310010 ללא

מקורות

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328(2021).
  3. Schinn, S. -M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8(2016).
  4. Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
  5. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  6. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
  7. Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
  8. Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
  9. Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
  10. Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
  11. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882(2019).
  12. Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).
  13. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).
  14. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  15. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MgKGFPEscherichia Coli
סינתזת חלבונים נטולת תאים מתמציות תאיות חסרות אקסונוקלאז תוך שימוש בתבניות DNA ליניאריות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.