Method Article

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יכולתם של תאים להגיב לאותות חיצוניים חיונית להתפתחות התאים, לגדילתם ולהישרדותם. כדי להגיב לאות מהסביבה, תא חייב להיות מסוגל לזהות ולעבד אותו. משימה זו מסתמכת בעיקר על תפקודם של קולטני הממברנה, שתפקידם להמיר אותות לשפה הביוכימית של התא. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מהווים את המשפחה הגדולה ביותר של חלבוני קולטני ממברנה בבני אדם. בקרב GPCRs, קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים (mGluRs) הם תת-מחלקה ייחודית המתפקדת כדימרים מחייבים ובעלת תחום חוץ-תאי גדול המכיל את אתר קשירת הליגנד. ההתקדמות האחרונה במחקרים מבניים של mGluRs שיפרה את ההבנה של תהליך ההפעלה שלהם. עם זאת, התפשטות של שינויים קונפורמיים בקנה מידה גדול באמצעות mGluRs במהלך ההפעלה והמודולציה אינה מובנת היטב. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) היא טכניקה רבת עוצמה להמחשה וכימות של הדינמיקה המבנית של ביומולקולות ברמת החלבון הבודד. כדי להמחיש את התהליך הדינמי של הפעלת mGluR2, פותחו חיישנים קונפורמיים פלואורסצנטיים המבוססים על שילוב לא טבעי של חומצות אמינו (UAA) שאפשרו תיוג חלבונים ספציפיים לאתר ללא הפרעה למבנה המקומי של קולטנים. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע ניסויים אלה, כולל הגישה החדשנית לתיוג UAA, הכנת דגימות ואיסוף וניתוח נתוני smFRET. אסטרטגיות אלה ניתנות להכללה וניתן להרחיב אותן כדי לחקור את הדינמיקה הקונפורמציונית של מגוון חלבוני ממברנה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העברת המידע על פני קרום הפלזמה תלויה במידה רבה בתפקוד קולטני הממברנה1. קשירת ליגנד לקולטן מובילה לשינוי קונפורמציה ולהפעלת קולטן. תהליך זה הוא לעתים קרובות allosteric בטבע2. עם למעלה מ-800 חברים, קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם המשפחה הגדולה ביותר של קולטני ממברנה בבני אדם3. בשל תפקידם כמעט בכל התהליכים התאיים, GPCRs הפכו ליעדים חשובים לפיתוח טיפולי. במודל הקנוני של איתות GPCR, הפעלת אגוניסט גורמת לשינויים קונפורמיים של הקולטן המפעילים לאחר מכן את קומפלקס חלבון G ההטרוטרימרי באמצעות חילופי תמ"ג עבור GTP בכיס קשירת הנוקלאוטידים שלG α. יחידות המשנה המופעלות Gα-GTP ו-Gβγ שולטות בפעילות של חלבוני אפקטים במורד הזרם ומפיצות את מפל האיתות 4,5. תהליך איתות זה תלוי למעשה ביכולתם של ליגנדים לשנות את הצורה התלת-ממדית של הקולטן. הבנה מכניסטית של האופן שבו ליגנדות משיגות זאת היא קריטית לפיתוח טיפולים חדשים ולתכנון קולטנים וחיישנים סינתטיים.

קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים (mGluRs) הם חברים במשפחת ה-GPCR מדרגה C והם חשובים להשפעות הנוירומודולטוריות האיטיות של גלוטמט וכוונון הרגישות העצבית 6,7. מבין כל ה-GPCRs, GPCRs מסוג C הם ייחודיים מבחינה מבנית בכך שהם מתפקדים כדימרים מחייבים. mGluRs מכילים שלושה תחומים מבניים: תחום מלכודת הזבובים של ונוס (VFT), תחום עשיר בציסטאין (CRD) ותחום טרנס-ממברנה (TMD)8. השינויים הקונפורמיים במהלך תהליך ההפעלה הם מורכבים וכוללים צימוד קונפורמציה מקומי וגלובלי המתפשט על פני מרחק של 12 ננומטר, כמו גם שיתוף פעולה עמום. תצורות הביניים, הסדר הזמני של המצבים וקצב המעבר בין מדינות אינם ידועים. על ידי ביצוע קונפורמציה של קולטנים בודדים בזמן אמת, ניתן לזהות את מצבי הביניים החולפים ואת רצף השינויים הקונפורמיים במהלך ההפעלה. ניתן להשיג זאת על ידי יישום העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת 9,10 (smFRET), כפי שיושם לאחרונה כדי לדמיין את התפשטות השינויים הקונפורמיים במהלך ההפעלה של mGluR2 11. שלב מפתח בניסויי FRET הוא יצירת חיישני FRET על ידי החדרה ספציפית לאתר של התורם והמקבל פלואורופורים לחלבון המעניין. אסטרטגיית שילוב של חומצות אמינו לא טבעיות (UAA) אומצה12,13,14,15 כדי להתגבר על המגבלות של טכנולוגיות תיוג פלואורסצנטיות טיפוסיות ספציפיות לאתר הדורשות יצירת מוטנטים ללא ציסטאין או החדרת תג גדול המקודד גנטית. זה איפשר את הסידור מחדש הקונפורמי של המקשר האלוסטרי הקומפקטי החיוני, שהצטרף לתחומי קשירת הליגנד והאיתות של mGluR2, כדי להיות נצפה. בפרוטוקול זה מוצג מדריך שלב אחר שלב לביצוע ניסויי smFRET ב- mGluR2, כולל הגישה לתיוג ספציפי לאתר של mGluR2 עם UAA להצמדת פלואורופורים באמצעות תגובת מחזור אזיד מזורזת נחושת. יתר על כן, פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה ללכידה ישירה של חלבוני ממברנה וניתוח נתונים. הפרוטוקול המתואר כאן ישים גם לחקר הדינמיקה הקונפורמציונית של חלבוני ממברנה אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה הכוללת של הפרוטוקול מתוארת באיור 1.

1. הכנת תא הדגימה

  1. ניקוי מגלשות וכיסויים
    הערה: שלבים אלה נועדו לנקות את המשטחים של השקופיות כמו גם את הכיסויים ולהכין אותם לאמינוזילניזציה. אחת הדרישות הקריטיות לביצוע ניסויים פלואורסצנטיים של מולקולה בודדת על מולקולות הקשורות לפני השטח היא משטח פסיבי. טכניקת הפסיבציה האמינה והניתנת לשחזור כוללת חיבור קוולנטי של שרשראות פולימריות אינרטיות למשטח הזכוכית כשכבה צפופה. פוליאתילן גליקול (PEG) הוא הפולימר היעיל ביותר המשמש לפסיביות פני השטח16. הפרטים של הליך הפסיבציה באמצעות PEG (PEGylation) מתוארים להלן:
    1. סמן חורים שיש לקדוח על השקופיות עם סמן (~ 6 מ"מ זה מזה והרחק מהקצה). השתמש ב-Dremel כדי לקדוח חורים קטנים (בקוטר 1 מ"מ) במגלשת הזכוכית. לטבול את המגלשות במים במהלך תהליך הקידוח.
    2. שטפו את השקופיות עם אצטון כדי להסיר שאריות דיו מהטוש.
    3. מוציאים מאצטון ושוטפים את המגלשות במים, ואז מחממים אותן במיקרוגל במשך 5 דקות במים בהספק גבוה (700 W).
    4. נקו את המגלשות במים לפני שתניחו אותן בצנצנת צביעה מזכוכית לבדיקה. מניחים את הכיסויים בצנצנת מכתים אחרת.
    5. סוניקו את השקופיות והכיסויים באצטון למשך 30 דקות בסוניק אמבטיה בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס.
    6. בינתיים, נקה בקבוק זכוכית להכנת תמיסת האמינוזילניזציה המשמשת בשלב הבא. ממלאים את הבקבוקון ב-1 M KOH, מדליקים את הבקבוקון למשך 30 דקות, שוטפים היטב את ה-KOH במים, ולאחר מכן מסננים במשך 30 דקות נוספות במתנול. השאירו את הבקבוקון במתנול עד למועד שלב האמינוזילניזציה.
    7. בינתיים, הסירו את האמינוזילן, ה-mPEG והביוטין-PEG מהמקפיא (−20 מעלות צלזיוס) ואפשרו להם להגיע לטמפרטורת החדר (RT) בחושך.
    8. יש להשליך אצטון מהמגלשה ולכסות את הצנצנות במיכל הפסולת הכימית המתאים, לשטוף היטב במים, ולאחר מכן להניף את המגלשות ב-5 M KOH למשך 30 דקות.
    9. שטפו את המגלשות והכיסויים במים, ולאחר מכן הוסיפו מתנול למשך 2 דקות (חזרו פעמיים). השאירו את הצנצנות מלאות במתנול עד לשלב האמינוזילניזציה.
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש במים שעברו דה-יוניזציה, אלא אם צוין אחרת. נעשה שימוש בסוניק אמבטיה הפועל בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס.
  2. אמינוזילניזציה
    הערה: שלב זה נועד לקשר באופן קוולנטי את האמינוזילאן למשטח ההחלקה והכיסוי הנקיים. mPEG וביוטין-PEG פונקציונליים ייקשרו באופן קוולנטי למשטח זה בשלב הבא.
    1. הכינו תערובת אמינוזילניזציה בבקבוק נקי (שלב 1.6). הכן את הפתרון על ידי ערבוב מתנול (150 מ"ל), חומצה אצטית (7.5 מ"ל, השתמש פיפטה זכוכית), ו aminosilane (2.5 מ"ל).
    2. מערבבים את התמיסה בעדינות במכסה האדים הכימיים, ואז יוצקים אותה לתוך צנצנות ההחלקה והכיסוי. השתמש ב-50 מ"ל עבור הכיסויים וב-100 מ"ל עבור השקופיות. ודא שהשקופיות והכיסויים שקועים לחלוטין בפתרון.
    3. דגירה במשך 10 דקות, ולאחר מכן sonicate את הצנצנות במשך 1 דקות (סוניקציה מסיר את הזיהומים מן פני השטח), ו דגירה במשך 10 דקות נוספות.
    4. יש להשליך תמיסת אמינוזילניזציה במיכל איסוף הפסולת. מוסיפים מתנול לצנצנות, סוגרים את הצנצנות עם מכסים ומנערים בעדינות ביד. יש להשליך את המתנול, ולמלא צנצנות במים.
    5. החזירו את בקבוק האמינוסילן למקפיא (−20 מעלות צלזיוס).
  3. PEGylation
    הערה: שלבים אלה מתארים את הליך PEGylation.
    1. במהלך aminosilanization, להכין את חיץ pegylation. שוקלים 84 מ"ג של סודיום ביקרבונט (NaHCO3) ומוסיפים אותו ל-10 מ"ל מים (10 מ"מ). בנוסף, שוקלים mPEG וביוטין-PEG ומניחים אותם בצד. עבור שש שקופיות וכיסויים, יש להשתמש ב-96 מ"ג mPEG וב-1.2-2.4 מ"ג ביוטין-PEG.
      הערה: חשוב לא להוסיף יותר מדי ביוטין-PEG מכיוון שהוא יכול להגדיל את מספר כתמי הרקע. אין להמיס את תערובת PEG עד ממש לפני המריחה על שקופיות.
    2. לשטוף את המגלשות עם מים, לייבש אותם עם מכה אוויר עדין, ולאחר מכן למקם אותם בתיבות הרכבה לחות.
      הערה: חיוני להשתמש בחברת תעופה נקייה. הימנע משימוש באוויר משומר דחוס, אשר יכול להשאיר שאריות על הזכוכית.
    3. יש להוסיף חיץ פגילציית לתערובת אבקת PEG ולפיפטה מעלה ומטה בעדינות מספר פעמים כדי להתמוסס. הוסף 55 μL של חיץ pegylation לכל שקופית (עבור שש שקופיות, להוסיף 330 μL של חיץ pegylation).
    4. צנטריפוגה ב-9,600 x גרם למשך דקה אחת ב-23 מעלות צלזיוס כדי לזרז חלקיקים לא פתורים. אסוף את הסופרנטנט לשימוש בשלב הבא.
      הערה: ביוטין-PEG עובר הידרוליזה במהירות עקב נוכחותה של קבוצת NHS. חשוב לבצע את שלבי הערבוב והצנטריפוגה במהירות.
    5. יש למרוח תמיסת PEGylation של 60 μL על כל שקופית ולאחר מכן להניח את מכסה הכיסוי על גביו, כך שתמיסת ה-PEGylation תהיה דחוקה בין השקופית למכסה הכיסוי.
      הערה: הימנע מהכנסת בועות בין השקופית לכיסוי, מכיוון שהדבר יפחית את יעילות הפסיבציה. הסר את כל הבועות על ידי התאמת הכיסוי והשקופית עם קצה פיפט.
    6. הניחו את השקופיות במגירה שטוחה וחשוכה. ניתן לאחסן שקופיות למשך הלילה; עם זאת, דגירה במשך 4-6 שעות גורמת לפסיביות אופטימלית.
      הערה: חשוב לזכור איזה צד הוא pegylated.
    7. סמן את הצד שאינו פגום לפני האחסון. לאחר הדגירה, יש לפרק בעדינות ולשטוף היטב את המגלשות והכיסויים במים
    8. ייבשו את המגלשות והכיסויים על ידי נשיפת אוויר. שמור את השקופיות והכיסויים בצינור סטרילי (50 מ"ל), כאשר משטח ה- PEGylated פונה זה לזה. יש לאחסן בטמפרטורה של −20°C עד ליום הניסוי.
      הערה: מומלץ להשתמש בשקופיות ובכיסויים תוך 4 שבועות מההכנה. משטחי ה-PEGylated צריכים לפנות הרחק זה מזה. אחסון השקופיות והכיסויים של PEGylated בשקיות אטומות בוואקום יכול להאריך את חיי המדף שלהן.

2. ביטוי mGluR2 עם חומצת אמינו לא טבעית משולבת, תיוג פלואורסצנטי ומיצוי

הערה: פרוטוקול זה מתאר את ההכנה, הריאגנטים והטיפול בתאים לביטוי mGluR2 המכיל את UAA 4-azido-L-פנילאלנין (AZP). ההליך הוא עבור תאי HEK293T הגדלים על כיסויי זכוכית 18 מ"מ. ניתן להרחיב את ההליך לפי הצורך.

  1. זריעה
    הערה: שמור על תאי HEK293T ב-DMEM בתוספת סרום בקר עוברי של 10% (v/v), 100 יחידות·mL−1 פניצילין-סטרפטומיצין, וחיץ HEPES של 15 mM (קובץ משלים 1) (pH 7.4) בטמפרטורה של 37 °C תחת 5% CO2.
    1. מעבירים את התאים עם 0.05% טריפסין-EDTA. תאי זרע HEK293T על זכוכית פולי-L/D-ליזין (PLL/PDL) מכסים כך שהם מגיעים למפגש של ≥80% בזמן ההעברה.
  2. טרנספקציה
    1. הכן פתרון מלאי של 40 mM של AZP ב- 0.1 M NaOH.
    2. הכן מדיה עם תוסף AZP לגידול תאים ולביטוי mGluR2. תוסף מדיה סטנדרטי (+ FBS, עט/סטרפ, 15 mM HEPES) באמצעות תמיסת מלאי AZP של 40 mM. הביאו את ריכוז ה-AZP הסופי ל-0.6 מ"מ. הוסף תמיסת HEPES של 1 M (נוספה מחצית מהנפח של פתרון מלאי AZP של 40 mM). לדוגמה, כדי להכין 10 מ"ל של מדיה בתוספת AZP, שלב 9.775 מ"ל של מדיה סטנדרטית, 150 μL של 40 mM תמיסת מלאי AZP, ו- 75 μL של 1 M HEPES פתרון.
    3. לסנן (לעקר) את המדיה באמצעות מסנן מזרק (0.2 מיקרומטר, PES).
    4. החלף את המדיה הרגילה במדיה המכילה מדיה בתוספת AZP לפני ההעברה.
      הערה: יש להיזהר שלא לייבש את התאים במהלך החלפת המדיה.
    5. טרנספקט של התאים באמצעות מגיב טרנספקציה (טבלת חומרים) בהתאם למדריך היצרן. טרנספקט HEK293T תאים על מכסה 18 מ"מ באמצעות סך של 2 מיקרוגרם של DNA (1000 ng של tRNA / synthetase + 1000 ng של פלסמיד חלבון המכיל קודון ענבר). עיין בטבלה 1 לקבלת הריכוז והנפח של הרכיבים שבהם נעשה שימוש.
    6. שנו את המדיה 24 שעות לאחר ההעברה למדיה טרייה עם תוסף AZP ואפשרו לתאים לגדול למשך 24 שעות נוספות.
  3. תיוג עם צבעי אלקין ציאנין
    1. 20 דקות לפני התווית, יש לשטוף את הכיסויים במאגר הקלטה חם (37 °C) (RB) (קובץ משלים 1) פעמיים, ולהעביר אותם למדיה סטנדרטית חמה (37 °C) ללא AZP (+ FBS, עט/סטרפ, 15 mM HEPES).
    2. הכן את תמיסת הסימון המכילה Cy3-alkyne, Cy5-alkyne, BTTES, נחושת (II) סולפט (CuSO4), (+) נתרן L-אסקורבט, ואמינוגואנידין.
    3. עקוב אחר סדר הביצוע וההוספה של פתרונות (טבלה 2):
      1. הכן 50 mM BTTES.
      2. הכינו 100 mM אמינוגואנידין.
      3. הכינו 100 mM Na-ascorbate.
      4. הכן 655.5 μL של RB.
      5. הוסף צבע אלקיין Cy3/Cy5 (10 mM במלאי DMSO) ל-RB.
        הערה: הוסף אמינוגואנידין ל-RB.
      6. הכינו 20 מ"מ CuSO4.
      7. מערבבים CuSO4 ו- BTTES בצינור חדש (הפתרון יהפוך לכחול).
      8. הוסף את תערובת CuSO4 ו- BTTES ל- RB (2.3.3.6.)
      9. הוסף את Na-Ascorbate.
      10. עקוב אחר הנפח המופיע בטבלה 2 להלן לקבלת כיסוי של 18 מ"מ.
    4. מערבבים היטב את התמיסה ודוגרים על קרח ובחושך במשך 10 דקות לפני סימון התאים.
    5. לפני הוספת תמיסת הסימון לכיסויים, הסר את המדיה ושטוף אותם ב- RB. הוסיפו את תמיסת ההתוויה ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C בתנאים חשוכים.
    6. הערה: כדי לשפר את הסימון, יש להוסיף גלוטמט (ריכוז סופי ~ 0.5 מ"מ) לאחר 10 דקות ולדגור במשך 5 דקות נוספות. נחושת רעילה מאוד לתאים, ותגובת התיוג לא צריכה להימשך יותר מ-15 דקות in vivo. מכינים את כל הרכיבים טריים. הוסף Na-Ascorbate אחרון. יש לשמור על התגובה בטמפרטורה של 4°C בזמן ההכנה. עם זאת, עם הוספת תמיסת התוויה, התאים יאוחסנו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתוך האינקובטור.
  4. קצירת התאים ומיצוי החלבונים (תזה תאית)
    1. הסר את תמיסת ההתוויה ושטוף את הכיסוי (18 מ"מ) המכיל את התאים הטרנספקטיביים mGluR2 פעמיים עם RB.
    2. באמצעות פיפט, יש לשטוף את התאים מהכיסוי ולתלות אותם מחדש ב-RB (1 מ"ל).
      הערה: צמצם את חשיפת הדגימה לאור ככל האפשר לאחר נקודה זו.
    3. גלולה את התאים על ידי סיבוב ב 1,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. יש לתלות את גלולת התא ב-80-130 μL של תמיסת התזה.
      הערה: כדור התא צריך להיות גלוי בעין. נפח התזה תלוי בכמות הדגימה שאבדה במהלך תהליך ההתוויה והכביסה.
    4. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג כדי לשבור את הכדור. עוטפים בנייר כסף ומניחים על הנדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 0.5-1 שעות כדי להניח את התאים.
    5. גלולה את החלק הבלתי מסיס על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g ו 4 °C במשך 20 דקות. מעבירים את הסופרנטנט לצינור קר טרי (החלבון הליזד שמכיל את החלבון המתויג פלואורסצנטי בעל עניין) ומאחסנים אותו על קרח לניסויים.

3. הרכבה ופונקציונליזציה של תא זרימה של מולקולה בודדת

  1. הסירו את המגלשה ואת המכסה מהמקפיא ותנו להם להתחמם ב-RT בחושך (~30 דקות).
  2. הרכיבו את התא באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי על ידי כריכת רצועות של סרט הדבקה דו-צדדי בין המגלשה לכיסוי. ודא שמשטחי PEGylated יוצרים את פנים תא הזרימה.
  3. באמצעות קצה פיפט, לחץ על הכיסוי כדי לוודא שהקלטת יוצרת מגע מלא הן עם הכיסוי והן עם החלקה; היזהרו לא לשבור את הכיסוי. יש למרוח אפוקסי על קצות השקופיות.
    הערה: אין להוסיף כל כך הרבה כי אפוקסי ממלא את החורים שנקדחו.
  4. הניחו את תא הזרימה כשצד הכיסוי פונה כלפי מטה בקופסה חשוכה ולחה כדי לאפשר לאפוקסי להתייבש (~30 דקות).
    הערה: הוסף מאגר T50 (קובץ משלים 1) דרך החורים שנקדחו כדי למנוע מהאפוקסי לכסות את החורים (10-15 μL) במהלך תקופת הייבוש.
  5. דגירה של כל נתיב תא עם 500 ננומטר נויטרווידין (מדולל ב-T50) על ידי החלת ~40 μL באיטיות על כל נתיב.
  6. דגרו ב-RT במשך 2 דקות בתוך קופסה חשוכה ולחה. לשטוף עם ~ 100 μL של חיץ T50 לכל נתיב.
  7. לדגום כל נתיב תא עם נוגדן ביוטינילציה 20 ננומטר11. בחירת הנוגדן תלויה בתג שעל החלבון.
    הערה: אם הנוגדן העיקרי אינו ביוטינילציה, יש לדגור תחילה עם הנוגדן המשני הביוטינילציה למשך 30 דקות ולאחר מכן לדגור עם הנוגדן הראשוני.
  8. דגירה ב-RT במשך 30 דקות בתוך קופסה חשוכה ולחה. לשטוף עם ~ 200 μL של T50 לכל נתיב.
    הערה: ודא שהנתיבים לעולם לא יתייבשו במהלך תהליך ההכנה.

4. מאגרי מולקולות בודדות

  1. חיץ טרולוקס
    הערה: מאגר Trolox הוא המאגר ההתחלתי ליצירת מאגר הדמיה. מרכיבי המאגר תלויים בניסוי ועשויים להשתנות בהתאם לחלבון המעניין. המאגר המשמש בפרוטוקול המתואר כאן כולל מלחים (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), חומר אגירה (HEPES), וטרולוקס (pH ~ 7.35).
    1. להמיס 9-10 מ"ג של Trolox ב-10 מ"ל של מאגר הקלטה של מולקולה בודדת (SRB, קובץ משלים 1)
      הערה: Trolox הופך את החיץ למעט חומצי. התאם את ה- pH בשלב זה באמצעות תמיסת נתרן הידרוקסידי (NaOH), 10 M (pH 7.35). התאמת ה- pH העדינה תבוצע לאחר שהטרולוקס יתמוסס לחלוטין; עם זאת, הגדלת ה- pH בנקודה זו מגדילה את המסיסות של הטרולוקס.
    2. ערבבו את התמיסה ב-RT באמצעות נדנדת ספסל למשך 4-8 שעות (עטופה ברדיד אלומיניום) כדי להמיס את הטרולוקס במלואו.
    3. בדוק את ה- pH והתאם במידת הצורך.
    4. ודא שהטרולוקס מומס במלואו. לעקר את התמיסה עם מסנן מזרק ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להשתמש במאגר לאחר 2-10 ימי יישון. Trolox עוזר לדכא מצמוץ והוא נפוץ במחקרים של מולקולות בודדות17. התכונות נגד מצמוץ מגיעות מנגזרת מחומצנת של Trolox18; לפיכך, מומלץ לשמור אותו ב- RT לפחות כמה שעות כדי להבשיל. בנוסף, קרינת UV של תמיסת Trolox טרייה מאיצה את תהליך החמצון וניתן להשתמש בה כדי להאיץ את "ההזדקנות" של חיץTrolox 18.
  2. מתכון מאגר הדמיה: יש לערבב חיץ Trolox + חומר ניקוי (~ פי 2 מערך ה- CMC של חומר הניקוי) + 4 mM חומצה פרוטוקטכואית (PCA).
    הערה: ריכוז חומרי הניקוי נשמר בקרבת CMC, שכן ריכוזי דטרגנטים גבוהים עלולים לגרום לדנטורציה מוגברת של חלבונים. לדוגמה, ניתן להשתמש בתערובת הבאה 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + כולסטרול (W%, 10:1) + 40 μL של 100 mM PCA פתרון מניות. כאן, PCA פועל כסוכן נוגד חמצון ושימש בעבר במחקרי smFRET19. DDM אינו יוני, משמש בדרך כלל לסלול חלבוני ממברנה20,21, ושימש במחקרים של מולקולות בודדות. DDM הוא חומר ניקוי טוב לבחירה ראשונה; עם זאת, אנו ממליצים לבדוק מספר חומרי ניקוי ולוודא שהתוצאות עקביות.

5. הגדרת מיקרוסקופ ואיסוף נתוני smFRET

  1. הפעל את המחשב ואת המיקרוסקופ. הפעל את הלייזרים כדי להתחמם (532 ננומטר עבור עירור Cy3 ו-640 ננומטר עבור עירור Cy5).
    הערה: כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה 100x TIRF (N.A. 1.49), מפצל תמונה ומצלמת EMCCD. ההתקנה מצוידת בשילוב לייזר בעל ארבע שורות, מראה דיכרואית, מסנן פליטת מעבר ארוך, מסנן דיכרואי פליטה ומסנן חריץ.
  2. הפעל את מצלמת EMCCD ופתח את תוכנת המצלמה. המתן 20 דקות עד שהמצלמה תגיע ל-69°C- ותתייצב.
  3. הרכיבו את תא הדגימה על במת המיקרוסקופ. הוסף את דגימת החלבון בהדרגה כדי להשיג ~ 400 מולקולות לכל שדה ראייה (שלב 2.4.5). לשטוף את התא עם 100 μL של חיץ הדמיה.
  4. התאם את הרווח, קצב הרכישה וכוחות הלייזר כך שאותות פלואורסצנטיים של מולקולה בודדת יזוהו הן בערוץ התורם והן בערוצים המקבלים. התאימו את ריכוז החלבונים בתוך תא הדגימה במידת הצורך.
    הערה: עם יותר מ-400 מולקולות בשדה הראייה, ההבחנה בין מולקולות בודדות הופכת לקשה יותר, ורעשי הרקע יהיו גבוהים יותר.
  5. להלהיב את התורם ולרכוש עקבות זמן עד שלפחות 80% מהמולקולות התורמות בשדה הראייה עוברות פוטו-אקונומיקה.
  6. בסוף הסרט, הפעילו את הלייזר של 640 ננומטר כדי להלהיב ישירות את המקבל עד שחלק מהמולקולות המקבלות יעברו פוטו-אקונומיקה, מה שמקל על מולקולה בודדת מאפליה מרובה.
  7. עבור לשדה תצוגה אחר וחזור על השלבים לעיל כדי לאסוף לפחות שלושה סרטים (שכפולים טכניים) לכל תנאי.
    הערה: השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית בעת בחירת אזור עניין חדש (ROI) ומיקוד כדי למזער את הלבנת הפוטו. שימו לב לסחף הבמה במהלך הרכישה. אם נצפתה סחף ניכר לאחר המעבר להחזר השקעה חדש, המתן 3 דקות לפני תחילת הרכישה.

6. ניתוח נתונים

  1. יישור ערוצים של תורמים ומקבלים (מיפוי סרטים)
    1. הקלט את תמונות החרוזים הפלואורסצנטיים בערוצים התורמים והמקבלים.
    2. צור את קובץ המיפוי באמצעות נתוני החרוזים כדי לתאם את הפלואורסצנציה של התורם והמקבל מכל מולקולה22,23.
      הערה: אות הפליטה ממולקולה בודדת מפוצל לאותות תורמים ומקבלים על ידי מסנן דיכרואיק פליטה בתוך מפצל התמונה. תמונות התורם ומקבל מוקרנות על המצלמה זו לצד זו. כדי לשייך במדויק את עוצמות התורם והמקבל של מולקולה בודדת בין שני האזורים, קובץ מיפוי נוצר לעתים קרובות באמצעות דגימות חרוזים פלואורסצנטיות. באמצעות קובץ מיפוי זה, כל המולקולות המתגלות בערוצי התורם והקבלה ממופות זו לזו. לאחר מכן הניתוח מייצר את עקבות הזמן, שהם עוצמות התורם ומקבל לאורך זמן, עבור כל מולקולה.
  2. בחירה של עקבות FRET של מולקולה בודדת (קטיף חלקיקים)
    הערה: עקבות חלקיקים בודדים נבדקים ונבחרים לניתוח במורד הזרם באמצעות MATLAB. קריטריוני הבחירה המדויקים תלויים במערכת. הנחיות כלליות לגבי מה מהווה חלקיק איכותי מפורטות כאן. כל הקודים שהשתנו בהתאמה אישית זמינים ב- GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. בחר את העקבות שבהם העוצמה הכוללת של העקבות (תורם + מקבל) יציבה לאורך זמן. בחר את העקבות עם שינויים אנטי-קורלטיביים בעוצמות התורם והמקבל.
    2. בחר את מולקולות התורם והמקבל המציגות הלבנה חד-שלבית. בחר את העקבות שאורכם >5 שניות.
      הערה: הרקע בכל ערוץ לאחר ההלבנה צריך להגיע לאפס. העקבות לא צריכים להיות הרבה אירועים מהבהבים; זה יגדיל את הקושי של ניתוח.
    3. חשב את יעילות FRET באמצעות המשוואה E = (I A− 0.088 × I D)/(I D + [I A− 0.088 × I D])24,25,26, כאשר I D ו- I A הם עוצמות תורם גולמי ומקבל, בהתאמה.
      הערה: דליפת הפליטה של התורם לערוץ המקבל נקבעת באמצעות דגימה המסומנת על ידי התורם בלבד באמצעות לייזר 532 ננומטר26. מקדם תיקון הדליפה, 0.088, עשוי להשתנות בהגדרות שונות בהתאם לערכות המסננים שבהן נעשה שימוש. חשוב לציין כי המרה כמותית וחזקה של יעילות FRET למרחקים מוחלטים דורשת תיקון של עוצמות התורם והמקבל עבור גורמים רבים ונדונו בהרחבה לפני27.
  3. זהה את המצב הקונפורמי על ידי מידול מרקוב מוסתר (HMM)
    1. הפעל את תוכנית vbFRET28 ב- MATLAB וייבא את העקבות שנבחרו עבור תנאי נתון. הגדר את האילוצים עבור מספר המצבים הפוטנציאליים והאיטרציות שיש לבצע.
      הערה: בהתבסס על הנתונים הגולמיים מהתוצאות המייצגות, הועלתה ההשערה כי ישנם עד ארבעה מצבי FRET בדידים שנכבשו על ידי חיישן הקונפורמציה; לפיכך, נקבע טווח של אחת עד ארבע מדינות. שיפורים בהתאמה נקבעו בעבר כעלייה זניחה עם >25 איטרציות; לפיכך, 25 איטרציות שימשו להתאמת הנתונים המייצגים.
    2. נתח את עקבות smFRET וייצא את העקבות האידיאליים ואת מפגש הניתוח. שמור את המעקבים האידיאליים בתיקיה נפרדת לניתוח במורד הזרם.
      הערה: התוכניות המשמשות לחילוץ נתוני מעבר מצב וזמן שהייה מעקבים אידיאליים היו זמינות בעבודהשפורסמה בעבר 29.
    3. באמצעות תוכניות MATLAB, חלץ מעברי מצבים והתווה אותם כמפת חום כאשר קואורדינטת X המציינת קונפורמציה התחלתית וקואורדינטת Y המציינת קונפורמציה סופית.
      הערה: מעברים מוגדרים כשינויים בערך FRET >0.1 בתוצאות המייצגות שנדונו כאן. סף המעברים תלוי במצבים הקונפורמיים המשוערים שחלבון בעל עניין תופס (סף המעבר שנקבע להיות קטן מההפרש בין מצבי FRET הקרובים ביותר), וכן ברזולוציה המותרת על ידי מערך הניסוי. בחינת מפות חום עבור תנאים מרובים מאפשרת לזהות את המצבים הקונפורמיים הנפוצים ביותר שחיישן עובר דרכם, ובכך תופס. ארבעה מצבי FRET זוהו עבור התוצאות המייצגות (FRET = 0.31, 0.51, 0.71 ו- 0.89).
    4. באמצעות תוכניות MATLAB, חלץ את זמני השהייה עבור כל מצב קונפורמציה מזוהה. הקצה טווח של ערכי FRET התוחמים כל מצב ורזולוציית זמן במהלך רכישת נתונים. טווחי FRET מחולקים באופן שווה במצבי FRET סמוכים. יש לייצא את זמני המגורים עבור תנאי טיפול מסוימים.
      הערה: ברוב המקרים, ניתן להעריך היטב נתונים בזמן השהייה על-ידי פונקציית דעיכה מעריכית אחת. ניתוח זה יכול להתבצע בתוכנת ניתוח נתונים וגרפים.
  4. התאמת גאוס של היסטוגרמות אוכלוסיית smFRET לכימות תפוסת המדינה
    1. ייבוא היסטוגרמות FRET של אוכלוסייה עבור תנאים מעניינים לתוך ניתוח נתונים ותוכנת גרפים לניתוח התאמת שיא מרובים.
    2. ציין את מספר הפסגות הקיימות (ארבע פסגות או מצבים בהתבסס על ניתוח HMM). ההתאמה בוצעה באמצעות התפלגויות גאוס מרובות30 המוגדרות כ figure-protocol-1- , כאשר A הוא אזור הפסגה, xc הוא מרכז הפסגה, ו - w הוא רוחב השיא עבור כל פסגה.
    3. הגבל את הפרמטרים המתאימים כ- A > 0, xc = FRET ± 0.02 ו- 0.1 ≤w≤ 0.24. ארבע פסגות FRET עבור היסטוגרמות FRET של אוכלוסייה בודדת הותאמו בו זמנית. החל את האילוצים המוגדרים עבור ההתאמות של כל התנאים.
    4. חישוב מצב התפוסה (אחוז) כשטח שיא הריבית חלקי השטח הכולל, המוגדר כסכום כל הפסגות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבעה ותיוג פלואורסצנטי של חיישן FRET מבוסס UAA
כאןנדונו תוצאות מופת של החדרה ותיוג פלואורסצנטי של UAA (AZP) בתוך ה-CRD של mGluR2 (548UAA). כפי שצוין קודם לכן, כדי להכניס AZP ל-mGluR2, יש צורך בביטוי משותף של מנגנון התרגום המהונדס, הכולל סינתזה tRNA שונה ו-tRNA משלים (pIRE4-Azi), ו-mGluR2 המכיל קודון ענבר במיקום 548, שנוצר באמצעות מוטגנזה, (איור 2A,B). התיוג של AZP על-ידי צבעי ציאנין מושג על-ידי תגובת ציקלואידציה מזורזת נחושת (איור ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCRs הם חלבונים הפועלים על קרום התא כדי ליזום התמרת אותות. GPCRs רבים מורכבים ממספר תחומים, כאשר האיתות תלוי באינטראקציה השיתופית בין התחומים. כדי לווסת את המאפיינים של קולטני ממברנה אלה, חיוני להבין את ההתנהגות הדינמית של התחומים המרובים. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית חד-מולקולתית (smFRET) היא טכניקה פלואורסצנטית המאפשרת מדידה של קונפורמציה ודינמיקה של חלבונים בזמן אמת11,32. כאן, מתוארת גישה המשלבת smFRET, משיכה של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull) ומיקרוסקופ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת רזא ופאבח'ש על הדיונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R01GM140272 (ל- R.V.), על ידי קרן המנהיגות של סירל למדעי החיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן, ועל ידי הקונסורציום הביו-רפואי של שיקגו בתמיכת קרנות סירל בקרן הקהילה של שיקגו (ל- R.V.). B.W.L. נתמך על ידי מענק ההדרכה של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) T32GM-008061.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-נתרן L-אסקורבטסיגמא אולדריץ'חתול # 11140-250G
4-azido-L-פנילאלניןChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021מבנה טרנספטציה
חומצה אצטיתפישר כימי64-19-7
אצטוןפישר כימיקל67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279תוכנה, אלגוריתם
אמינוגואנידין (הידרוכלוריד)קיימן כימיקל81530
אמינוסילןאולדריץ'919-30-2
סוניקטור אמבטיה 2.8 ליטרפישר אמבט2.8 ליטר
ביוטין-PEGLaysan Bio Incפריט# ביוטין-PEG-SVA-5000-100 מ"ג
BTTESקליק כימיה כלים1237-500
נחושת (II) סולפטסיגמא אולדריץ'חתול # 451657-10G
תלוש כיסויVWR16004-306תא מדגם
Cy3 אלקיןקליק כימיה כליםTA117-5
Cy5 אלקיןקליק כלים לכימיהTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMחומר ניקוי
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 מ"לחומר ניקוי עם כולקטרול
מוגדר סרום בקר עובריThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635מסנן SemrockNotch
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDאנדורDU-897Uמצלמה
ET542lpChromaמסנן פליטה מעבר ארוך
FF640-FDi01Semrockפליטת מסנן דיכרואי
FLAG-tag נוגדןGenscriptA01429
חרוז פלואורסצנטיInvitrogen T7279TetraSpeck מיקרוספירותכדוריות
חרוז זכוכית שקופיותFisherfinest12-544-4תא דגימה
גלוטמטסיגמא אולדריץ'חתול # 6106-04-3
HEK 293Tסיגמא אולדריץ'חתול # 12022001קו תאים
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
מפצל תמונהOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
לייזרOxxiusמשלב לייזר 4 קווים
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo Fisher L3000015מגיב טרנספקציה
מתנולפישר כימי67-56-1
מיקרוסקופאולימפוסאולימפוס IX83
Milli-Q מיםBarnsteadWater Deionizer
m-PEGLaysan Bio Incפריט # MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Semrockמראה דיכרואית
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091סרום מופחת בינוני
OptiMEM/סרום מופחת בינוני ThermoFisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212תוכנת ניתוח נתונים וגרפים
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
pIRE4-AziAddgeneפלסמיד # 105829מבנה טרנספט
פולי-L-ליזין הידרוברומידסיגמא אולדריץ'חתול # P2636
חומצה פרוטוקאטכואית (PCA)קבוצת HWI99-50-3
smמצלמה (גרסה 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/מצלמה תוכנה
נתרן ביקרבונטFisherBioReagents144-55-8
נתרן הידרוקסיד (NaOH)Sigma1310-73-2
מסנן מזרקWhatman UNIFLOCat#9914-2502סינון נוזלי
TroloxSigma53188-07
אולטרסאונד מדעי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769(2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518(2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194(2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

Related Articles