Method Article

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

DOI:

10.3791/64254

⸱

August 17th, 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יכולתם של תאים להגיב לאותות חיצוניים חיונית להתפתחות התאים, לגדילתם ולהישרדותם. כדי להגיב לאות מהסביבה, תא חייב להיות מסוגל לזהות ולעבד אותו. משימה זו מסתמכת בעיקר על תפקודם של קולטני הממברנה, שתפקידם להמיר אותות לשפה הביוכימית של התא. קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מהווים את המשפחה הגדולה ביותר של חלבוני קולטני ממברנה בבני אדם. בקרב GPCRs, קולטני גלוטמט מטאבוטרופיים (mGluRs) הם תת-מחלקה ייחודית המתפקדת כדימרים מחייבים ובעלת תחום חוץ-תאי גדול המכיל את אתר קשירת הליגנד. ההתקדמות האחרונה במחקרים מבניים של mGluRs שיפרה את ההבנה של תהליך ההפעלה שלהם. עם זאת, התפשטות של שינויים קונפורמיים בקנה מידה גדול באמצעות mGluRs במהלך ההפעלה והמודולציה אינה מובנת היטב. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) היא טכניקה רבת עוצמה להמחשה וכימות של הדינמיקה המבנית של ביומולקולות ברמת החלבון הבודד. כדי להמחיש את התהליך הדינמי של הפעלת mGluR2, פותחו חיישנים קונפורמיים פלואורסצנטיים המבוססים על שילוב לא טבעי של חומצות אמינו (UAA) שאפשרו תיוג חלבונים ספציפיים לאתר ללא הפרעה למבנה המקומי של קולטנים. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע ניסויים אלה, כולל הגישה החדשנית לתיוג UAA, הכנת דגימות ואיסוף וניתוח נתוני smFRET. אסטרטגיות אלה ניתנות להכללה וניתן להרחיב אותן כדי לחקור את הדינמיקה הקונפורמציונית של מגוון חלבוני ממברנה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העברת המידע על פני קרום הפלזמה תלויה במידה רבה בתפקוד קולטני הממברנה1. קשירת ליגנד לקולטן מובילה לשינוי קונפורמציה ולהפעלת קולטן. תהליך זה הוא לעתים קרובות allosteric בטבע2. עם למעלה מ-800 חברים, קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) הם המשפחה הגדולה ביותר של קולטני ממברנה בבני אדם3. בשל תפקידם כמעט בכל התהליכים התאיים, GPCRs הפכו ליעדים חשובים לפיתוח טיפולי. במודל הקנוני של איתות GPCR, הפעלת אגוניסט גורמת לשינויים קונפורמיים של הקולטן המפעילים לאחר מכן את קומפלקס חלבון G ההטרוטרימרי באמצעות חילופי תמ"ג עבור GTP בכיס קשירת הנוקלאוטידים שלG α. יחידות המשנה המופעלות Gα-GTP ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה הכוללת של הפרוטוקול מתוארת באיור 1.

1. הכנת תא הדגימה

  1. ניקוי מגלשות וכיסויים
    הערה: שלבים אלה נועדו לנקות את המשטחים של השקופיות כמו גם את הכיסויים ולהכין אותם לאמינוזילניזציה. אחת הדרישות הקריטיות לביצוע ניסויים פלואורסצנטיים של מולקולה בודדת על מולקולות הקשורות לפני השטח היא משטח פסיבי. טכניקת הפסיבציה האמינה והניתנת לשחזור כוללת חיבור קוולנטי של שרשראות פולימריות אינרטיות למשטח הזכוכית כשכבה צפופה. פוליאתילן גליקול (PEG) הוא הפולימר היעיל ביותר המשמש לפסיביות פני השטח16. הפרטים של הליך הפסיבציה באמצעות PEG (PEGylation) מתוארים להלן:
    1. סמן חורים שיש לקד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבעה ותיוג פלואורסצנטי של חיישן FRET מבוסס UAA
כאןנדונו תוצאות מופת של החדרה ותיוג פלואורסצנטי של UAA (AZP) בתוך ה-CRD של mGluR2 (548UAA). כפי שצוין קודם לכן, כדי להכניס AZP ל-mGluR2, יש צורך בביטוי משותף של מנגנון התרגום המהונדס, הכולל סינתזה tRNA שונה ו-tRNA משלים (pIRE4-Azi), ו-mGluR2 המכיל קודון ענבר במיקום 548, שנוצר באמצעות מוטגנזה, (איור 2A,B). התיוג של AZP על-ידי צבעי ציאנין מושג על-ידי תגובת ציקלואידציה מזורזת נחושת (איור .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GPCRs הם חלבונים הפועלים על קרום התא כדי ליזום התמרת אותות. GPCRs רבים מורכבים ממספר תחומים, כאשר האיתות תלוי באינטראקציה השיתופית בין התחומים. כדי לווסת את המאפיינים של קולטני ממברנה אלה, חיוני להבין את ההתנהגות הדינמית של התחומים המרובים. העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית חד-מולקולתית (smFRET) היא טכניקה פלואורסצנטית המאפשרת מדידה של קונפורמציה ודינמיקה של חלבונים בזמן אמת11,32. כאן, מתוארת גישה המשלבת smFRET, משיכה של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull) ומיקרוסקופ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת רזא ופאבח'ש על הדיונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות R01GM140272 (ל- R.V.), על ידי קרן המנהיגות של סירל למדעי החיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן, ועל ידי הקונסורציום הביו-רפואי של שיקגו בתמיכת קרנות סירל בקרן הקהילה של שיקגו (ל- R.V.). B.W.L. נתמך על ידי מענק ההדרכה של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) T32GM-008061.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(+)-נתרן L-אסקורבטסיגמא אולדריץ'חתול # 11140-250G
4-azido-L-פנילאלניןChem-Impex InternationalCat # 06162
548UAALiauw et al. 2021מבנה טרנספטציה
חומצה אצטיתפישר כימי64-19-7
אצטוןפישר כימיקל67-64-1
Adobe Illustrator (2022)https://www.adobe.com/RRID:SCR_010279תוכנה, אלגוריתם
אמינוגואנידין (הידרוכלוריד)קיימן כימיקל81530
אמינוסילןאולדריץ'919-30-2
סוניקטור אמבטיה 2.8 ליטרפישר אמבט2.8 ליטר
ביוטין-PEGLaysan Bio Incפריט# ביוטין-PEG-SVA-5000-100 מ"ג
BTTESקליק כימיה כלים1237-500
נחושת (II) סולפטסיגמא אולדריץ'חתול # 451657-10G
תלוש כיסויVWR16004-306תא מדגם
Cy3 אלקיןקליק כימיה כליםTA117-5
Cy5 אלקיןקליק כלים לכימיהTA116-5
DDMAnatracePart# D310 1 GMחומר ניקוי
DDM-CHS (10:1)AnatracePart# D310-CH210 1 מ"לחומר ניקוי עם כולקטרול
מוגדר סרום בקר עובריThermo Fisher ScientificSH30070.03
Di01-R405/488/561/635מסנן SemrockNotch
DMEMCorning10-013-CV
EMCCDאנדורDU-897Uמצלמה
ET542lpChromaמסנן פליטה מעבר ארוך
FF640-FDi01Semrockפליטת מסנן דיכרואי
FLAG-tag נוגדןGenscriptA01429
חרוז פלואורסצנטיInvitrogen T7279TetraSpeck מיקרוספירותכדוריות
חרוז זכוכית שקופיותFisherfinest12-544-4תא דגימה
גלוטמטסיגמא אולדריץ'חתול # 6106-04-3
HEK 293Tסיגמא אולדריץ'חתול # 12022001קו תאים
HEPESFisherBioReagents7365-45-9
מפצל תמונהOptoSplit II
KOHFluka1310-58-3
לייזרOxxiusמשלב לייזר 4 קווים
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermo Fisher L3000015מגיב טרנספקציה
מתנולפישר כימי67-56-1
מיקרוסקופאולימפוסאולימפוס IX83
Milli-Q מיםBarnsteadWater Deionizer
m-PEGLaysan Bio Incפריט # MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635Semrockמראה דיכרואית
OptiMEMThermo Fisher Scientific51985091סרום מופחת בינוני
OptiMEM/סרום מופחת בינוני ThermoFisher Scientific
OriginPro (2020b)https://www.originlab.com/RRID:SCR_014212תוכנת ניתוח נתונים וגרפים
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140-122
pIRE4-AziAddgeneפלסמיד # 105829מבנה טרנספט
פולי-L-ליזין הידרוברומידסיגמא אולדריץ'חתול # P2636
חומצה פרוטוקאטכואית (PCA)קבוצת HWI99-50-3
smמצלמה (גרסה 1.0)http://ha.med.jhmi.edu/resources/מצלמה תוכנה
נתרן ביקרבונטFisherBioReagents144-55-8
נתרן הידרוקסיד (NaOH)Sigma1310-73-2
מסנן מזרקWhatman UNIFLOCat#9914-2502סינון נוזלי
TroloxSigma53188-07
אולטרסאונד מדעי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FRETMembrane ReceptorsConformational DynamicsProtein LabelingMetabotropic Glutamate ReceptorsGPCR ActivationHidden Markov ModelingFluorescent SensorsHEK 293T CellsSite Specific Labeling

Related Articles