Method Article

פיתוח ובדיקה של דיפפטידים ננו-מבניים שעברו מתילציה המעכבים את פעילות ה-src קינאז במבחנה ליישומים אנטי-סרטניים

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול לתכנון ובדיקה של דיפפטידים שיכולים לעכב את פעילות האנזים Src קינאז באמצעות בדיקות תאיות ותאיות ליישומים אנטי-סרטניים. הפפטידים שנוסחו כאן (W-RCH3, WCH3-R CH3 ו-W-R(CH3)2) עיכבו את Src kinase עם ערכי IC50 של 510 ננומטר, 916 ננומטר ו-1 מיקרומטר, בהתאמה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, במטרה לפתח טיפול אנטי-סרטני חדשני, תוכננו שבעה דיפפטידים שהכילו טריפטופן שעבר מתילציה ו/או ארגינין שעבר מתילציה ויוצרו באמצעות סינתזת פפטיד בשלב מוצק של Fmoc. ביטוי יתר של האנזים Src טירוזין קינאז היה מעורב בהתפתחות של סוגי סרטן שונים. דיפפטידים המכילים חומצות אמינו לא טבעיות כגון ארגינין שעבר מתילציה (RCH3), ארגינין דימתילציה (R(CH3)2) ו/או שאריות טריפטופן שעבר מתילציה (WCH3) הוכחו בעבר כמעכבים את Src קינאז. במחקר זה, שלושה דיפפטידים כאלה, W-RCH3, WCH3-R CH3 ו-W-R(CH3)2, נבדקו באמצעות מבחנים תאיים ונמצאו בעלי ערכי IC50 (הריכוז שבו מתרחשת עיכוב של 50%) של 510 ננומטר, 916 ננומטר ו-1 מיקרומטר, בהתאמה. ערכים אלה היו דומים לאלה שהתקבלו עבור פפטידים מחזוריים של פנטה לננו-W-R ([W-R]5-[W-R]9) שסונתזו במחקרים קודמים. עם זאת, הגרסאות הלא מתיליות של הדיפפטידים לא הראו פעילות מעכבת כנגד Src קינאז. כל הדיפפטידים הללו (50 מיקרומטר) לא הראו ציטוטוקסיות כלשהי לאחר דגירה של עד 72 שעות עם שלושה קווי תאים סרטניים שונים, כולל לוקמיה (CCRF-CEM), אדנוקרצינומה של השד (MDA-MB-231) ואדנוקרצינומה של השחלות (SK-OV-3), מה שמעיד על החדירות המוגבלת של הפפטידים דרך קרום התא. לכן, יש צורך במחקר נוסף כדי לשפר את החדירות של פפטידים אלה ליישומים אנטי-סרטניים, כגון על ידי שימוש בנשא פפטיד או פונקציונליזציה נוספת של פפטידים. לסיכום, מחקר זה מספק פרוטוקול לסינתזה ובדיקה של פפטידים המעכבים את פעילות Src קינאז, ובכך בעלי יכולת אנטי-סרטנית מבטיחה, כפי שהוכח באמצעות בדיקות תאיות ותאיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן נגרם על ידי גדילה לא תקינה של תאים נורמליים והוא אחת המחלות הקטלניות ביותר ברחבי העולם. תאים חריגים אלה מתפשטים לאיברים שונים בגוף בתהליך הנקרא גרורות. הצורה הנפוצה ביותר של סרטן היא סרטן השד, שהתרחש אצל 2.26 מיליון אנשים בשנת 2020. יתר על כן, היו כ-1.80 מיליון מקרי מוות כתוצאה מסרטן ריאות בשנת 20201. על פי ארגון הבריאות העולמי, כ-10 מיליון אנשים מתו מסרטן בשנת 20202. תאים סרטניים נבדלים מתאים רגילים בכך שהם מבטאים יתר על המידה אנזימים מסוימים, כגון חלבון טירוזין קינאז (PTKs). המכון הלאומי לסרטן מגדיר קינאזות כאנזימים המסוגלים לזרחן חלבונים או סוכרים אחרים3. ידע על הפונקציה הרגולטורית של קינא....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של פפטידים

הערה: הסינתזה של W-R מתוארת כדוגמה מייצגת (איור 2).

  1. שקלו 566 מ"ג (0.3 מילימול) של שרף H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl והוסיפו אותו לכלי סינתזת הפפטידים (ראה טבלת חומרים), על פי הנוהל בו השתמשו Mandal et al20. בצע סינתזת פפטידים באמצעות אסטרטגיית סינתזת פפטיד פאזה מוצקה (SPPS) מבוססתהיטב 21.
    הערה: דיפפטידים שעברו מתילציה או דימתילציה המכילים חומצות אמינו לא טבעיות הורכבו על שרף אמיד זירת החלקה (כושר העמסה של 0.3 מילימול לגרם), ואילו דיפפטידים המכילים חומצות אמינו טבעיות הורכבו על שרף שחומצת האמינו הראש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2,W CH3-R, WCH3-R(CH3)2, ופפטידי הביקורת W-R סונתזו באמצעות סינתזת פפטידים בשלב מוצק Fmoc (איור 3), עם טוהר של 95%, 98.7%, 99%, 100%, 100% ו-99.5%, בהתאמה. המבנים הכימיים של דיפפטידים אלה אושרו באמצעות ESI-MS. ערכי m/z של דיפפטידים אלה היו 374.1624, 388.1949, 388.1794, 374.1815, 402.2022 ו-361.1457, בהתאמה.

.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפפטידים שיוצרו ונבדקו כאן לעיכוב של Src קינאז וכתוצאה מכך הרג של תאים סרטניים הכילו טריפטופן שעבר מתילציה ו/או ארגינין שעבר מתילציה, שהן חומצות אמינו לא טבעיות. היווצרות המשקעים הלבנים עם הוספת אתר דיאתיל היא שלב קריטי בסינתזה של פפטידים אלה. עם זאת, לא כל הפפטידים הסינתטיים יכולים ליצור משקעים; לכן, גם כאשר לא נוצר משקעים, ניתן לאשר סינתזת פפטידים מוצלחת על ידי קביעת המסה הרצויה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS). ניתן להשתמש במסות הפפטידים כדי לחזות את ספקטרום 1<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לדיקן המחקר המדעי (DSR) באוניברסיטת המלך עבד אל-עזיז (KAU), ג'דה, ערב הסעודית, שמימן את הפרויקט הזה במסגרת מענק מס. (ז: 031-130-1443).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'10708984001סינתזת פפטידים
משפך מסנן פריטי אולדריץ' לסינתזה בשלב מוצקסיגמא-אולדריץ'Z283304כלי סינתזה פפטיד
Alexa594 TracerBell Brook Labs, מדיסון, WI3013
אניזולסיגמא-אולדריץ'8014520500
CellTiter 96 AQueous One  פתרון  ריאגנטים לבדיקת התפשטות תאים PromegaG3582בדיקת התפשטות תאים (מגיב MTS)
דיכלורומתאן, 99.9%,Extra Dry FishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich
(Boc)- OHסיגמא-אולדריץ'47561-25G-F
HPLC C18 טור שימדזו  (מערכת RP-HPLC)שיפוע מים/אצטוניטריל
IRDye QC-1 מרווהמעבדות בל ברוק, מדיסון, WI3013
קורא מיקרופלייט SpectraMax M2eמולקולריים
מיקרוסופט אקסלתוכנת גיליון אלקטרונימיקרוסופט
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)סיגמא-אולדריץ'496219
N,N-דימתילפורממיד, נטול מים, 99.8%FishersciAA43997M1
Piperidine 20%Sigma-Aldrich80645
שרף אמיד זירת החלקה (100-200 רשת)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisoleSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src ערכת בדיקת פעילות קינאז
8520670025-Fmoc-Trp מכשירים של

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Src Kinase InhibitionMethylated DipeptidesSolid Phase Peptide SynthesisAnti Cancer PeptidesTyrosine Kinase ActivityAcellular AssaysPeptide PermeabilityCancer Cell LinesPeptide FunctionalizationIC50 Measurement