Method Article

פיתוח ובדיקה של דיפפטידים ננו-מבניים שעברו מתילציה המעכבים את פעילות ה-src קינאז במבחנה ליישומים אנטי-סרטניים

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול לתכנון ובדיקה של דיפפטידים שיכולים לעכב את פעילות האנזים Src קינאז באמצעות בדיקות תאיות ותאיות ליישומים אנטי-סרטניים. הפפטידים שנוסחו כאן (W-RCH3, WCH3-R CH3 ו-W-R(CH3)2) עיכבו את Src kinase עם ערכי IC50 של 510 ננומטר, 916 ננומטר ו-1 מיקרומטר, בהתאמה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, במטרה לפתח טיפול אנטי-סרטני חדשני, תוכננו שבעה דיפפטידים שהכילו טריפטופן שעבר מתילציה ו/או ארגינין שעבר מתילציה ויוצרו באמצעות סינתזת פפטיד בשלב מוצק של Fmoc. ביטוי יתר של האנזים Src טירוזין קינאז היה מעורב בהתפתחות של סוגי סרטן שונים. דיפפטידים המכילים חומצות אמינו לא טבעיות כגון ארגינין שעבר מתילציה (RCH3), ארגינין דימתילציה (R(CH3)2) ו/או שאריות טריפטופן שעבר מתילציה (WCH3) הוכחו בעבר כמעכבים את Src קינאז. במחקר זה, שלושה דיפפטידים כאלה, W-RCH3, WCH3-R CH3 ו-W-R(CH3)2, נבדקו באמצעות מבחנים תאיים ונמצאו בעלי ערכי IC50 (הריכוז שבו מתרחשת עיכוב של 50%) של 510 ננומטר, 916 ננומטר ו-1 מיקרומטר, בהתאמה. ערכים אלה היו דומים לאלה שהתקבלו עבור פפטידים מחזוריים של פנטה לננו-W-R ([W-R]5-[W-R]9) שסונתזו במחקרים קודמים. עם זאת, הגרסאות הלא מתיליות של הדיפפטידים לא הראו פעילות מעכבת כנגד Src קינאז. כל הדיפפטידים הללו (50 מיקרומטר) לא הראו ציטוטוקסיות כלשהי לאחר דגירה של עד 72 שעות עם שלושה קווי תאים סרטניים שונים, כולל לוקמיה (CCRF-CEM), אדנוקרצינומה של השד (MDA-MB-231) ואדנוקרצינומה של השחלות (SK-OV-3), מה שמעיד על החדירות המוגבלת של הפפטידים דרך קרום התא. לכן, יש צורך במחקר נוסף כדי לשפר את החדירות של פפטידים אלה ליישומים אנטי-סרטניים, כגון על ידי שימוש בנשא פפטיד או פונקציונליזציה נוספת של פפטידים. לסיכום, מחקר זה מספק פרוטוקול לסינתזה ובדיקה של פפטידים המעכבים את פעילות Src קינאז, ובכך בעלי יכולת אנטי-סרטנית מבטיחה, כפי שהוכח באמצעות בדיקות תאיות ותאיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן נגרם על ידי גדילה לא תקינה של תאים נורמליים והוא אחת המחלות הקטלניות ביותר ברחבי העולם. תאים חריגים אלה מתפשטים לאיברים שונים בגוף בתהליך הנקרא גרורות. הצורה הנפוצה ביותר של סרטן היא סרטן השד, שהתרחש אצל 2.26 מיליון אנשים בשנת 2020. יתר על כן, היו כ-1.80 מיליון מקרי מוות כתוצאה מסרטן ריאות בשנת 20201. על פי ארגון הבריאות העולמי, כ-10 מיליון אנשים מתו מסרטן בשנת 20202. תאים סרטניים נבדלים מתאים רגילים בכך שהם מבטאים יתר על המידה אנזימים מסוימים, כגון חלבון טירוזין קינאז (PTKs). המכון הלאומי לסרטן מגדיר קינאזות כאנזימים המסוגלים לזרחן חלבונים או סוכרים אחרים3. ידע על הפונקציה הרגולטורית של קינאזות יכול להקל על תכנון תרופות יעילות נגד סרטן. לדוגמה, PTKs מזרזים זרחון של חלבונים או סוכרים אחרים, וכתוצאה מכך, ATP מומר ל-ADP על ידי אובדן קבוצת פוספט. בסך הכל 80% מהאונקוגנים והפרוטונקוגנים מקודדים PTKs4. Src קינאזות היא משפחה של טירוזין קינאזות ללא קולטנים, כולל Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes ו-Yrk, המתבטאים יתר על המידה בתאים סרטניים, במיוחד בסרטן השד 5,6. טירוזין קינאזות Src קשורות למיטוגנזה, התמיינות, הפעלת תאי T וטרנספורמציה של תאים. Src מסייע לפלישת תאים סרטניים וגרורות בשל יכולתו להפחית את הידבקות התאים הסרטניים. ישנם חמישה תחומים שונים בקינאז Src, המסודרים ממסופי N עד C כ: תחום חומצות שומן, תחום הומולוגיה Src 3 (SH3), תחום הומולוגיה Src 2 (SH2), תחום טירוזין קינאז (SH1) ותחום רגולטורי C-terminal7.

figure-introduction-1
איור 1: תחומי המטרה באנזים Src קינאז, כולל תחום SH3, תחום SH2, תחום קינאז (SH1) ומקטע רגולטורי קצר של מסוף C. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

תחום הקינאז SH1 הוא הממוקד הנפוץ ביותר בעת תכנון מעכבי Src קינאז, מכיוון שהוא מכיל שני אתרים שמורים עבור ATP וקשירת סובסטרט (איור 1). אם רצף חומצות האמינו של תחום הקינאז ידוע, המצע יכול לשמש גם כמטרה לתכנון תרכובת המחקה קשירת סובסטרט ל-Src קינאז8. בנוסף, אתרים אחרים כמו הדומיינים SH3 ו-SH2 יכולים לשמש כמטרות. בהשוואה לתרופות כימותרפיות אחרות, מעכבי קינאז מציגים פחות רעילות ויעילות גבוהה יותר9. נכון לספטמבר 2021, ישנן 73 מולקולות קטנות הפועלות כמעכבי קינאז שאושרו על ידי ה-FDA10. אימטיניב היא דוגמה לתרופה אנטי סרטנית המעכבת באופן סלקטיבי את פעילותו של טירוזין קינאז; עם זאת, חלק מהחולים עמידים לתרופה עקב הופעת מוטציה נקודתית בתחום הקינאז11. אסטרהזניקה שחררה את Saracatinib, שהיא תרופה המעכבת את משפחת Src של טירוזין קינאזות עם ערך IC50 (הריכוז שבו מתרחשת עיכוב של 50%) של 2.7 ננומטר, אך היא הוזלה בניסויי שלב 212. מתוך 52 מעכבי PTK שאושרו על ידי ה-FDA האמריקאי נכון לתחילת 202013, רק 28 PTKs קולטני מטרה, 11 חוסמים את ה-PTK שאינו קולטן, 11 מעכבים חלבון-סרין/תראונין חלבון קינאזות, ושניים חוסמים MEK1/213. העניין המחקרי הגובר באונקולוגיה ימשיך לתדלק את הגילוי של מעכבי קינאז כתרופות אנטי-סרטניות פוטנציאליות. עם זאת, רק 50 מתוך 500 חלבון קינאזות היו ממוקדים לטיפול עד כה; לכן, מספר גדול יותר של קינאזות צפוי להיחקר לפיתוח תרופות בעתיד הקרוב14. בנוסף, יש צורך לגלות מעכבי קינאז כדי לחקור מוטציות קינאז שעדיין לא זוהו המובילות לסרטן.

לפיכך, מחקר זה נועד לפתח פפטידים שיכולים לשמש כמעכבים למשפחת Src ולהתמקד באתר הקישור של ATP בשל יכולתו לשמש כאתר שמור בין קינאזות שונות. לשם כך, סדרה של דיפפטידים המכילים טריפטופן שעבר מתילציה ו/או ארגינין שעבר מתילציה סונתזו ונבדקו על יכולתם הסינרגטית לעכב Src קינאז. טבעת האינדול של טריפטופן מחקה את האדנין של ATP ומתחרה ב-ATP מלהיקשר לאתר קשירת ה-ATP. בנוסף, הארגינין שעבר מתילציה בליגנד מתחרה על תחום SH3 של Src. החוקרים הראו כי פוליפפטיד המכיל ארגינין דה-מתילציה מעכב את תחום SH3, אולי בשל רצף שמור ספציפי על מוטיב הקישור SH3 (כלומר, PXXP), שיש לו זיקה מחייבת לליגנד המכיל שתיים עד שלוש שאריות Arg במסוף N או שאריות Arg אחת עד שתיים על מסוף C של הליגנדים15, 16,17. קבוצת הגואנידינו של Arg נקשרת לשאריות Asp-99 השמורות של תחום SH3 18,19, בעוד שהחלק הנותר של ה-Arg נקשר ל-Trp-118 המשומר של האנזים, כפי שאושר מניתוח NMR ומבני הגביש של מספר תחומי SH319. כאן, מוצג פרוטוקול לסינתזה של שבעה דיפפטידים שעברו מתילציה ובדיקת יכולת העיכוב שלהם כנגד Src קינאז. יתר על כן, נבדקה יכולתם של פפטידים אלה להרוג מספר קווי תאים סרטניים במבחנה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של פפטידים

הערה: הסינתזה של W-R מתוארת כדוגמה מייצגת (איור 2).

  1. שקלו 566 מ"ג (0.3 מילימול) של שרף H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl והוסיפו אותו לכלי סינתזת הפפטידים (ראה טבלת חומרים), על פי הנוהל בו השתמשו Mandal et al20. בצע סינתזת פפטידים באמצעות אסטרטגיית סינתזת פפטיד פאזה מוצקה (SPPS) מבוססתהיטב 21.
    הערה: דיפפטידים שעברו מתילציה או דימתילציה המכילים חומצות אמינו לא טבעיות הורכבו על שרף אמיד זירת החלקה (כושר העמסה של 0.3 מילימול לגרם), ואילו דיפפטידים המכילים חומצות אמינו טבעיות הורכבו על שרף שחומצת האמינו הראשונה הייתה מחוברת אליו, כגון שרף H-Arg(Pbf)-2-chlorotriryl (כושר העמסה של 0.3 מילימול לגרם). חשוב לציין, שרף אמיד המשטח מייצר פפטיד מכוסה ב-C-terminal NH2.
  2. נפח את השרף היבש למשך שעה אחת ב -5 מ"ל של N, N-dimethylformamide (DMF) בלחץ גז חנקן המחובר לכלי הפפטיד.
    הערה: בצע את כל תהליך הסינתזה במכסה אדים. יש ללבוש משקפי מגן, כפפות ומעיל מעבדה לאורך כל הניסוי. טיימר חיוני גם כדי לעקוב אחר שלבי הוספת ריאגנטים כימיים.
  3. הסר עודף DMF באמצעות לחץ גז חנקן המחובר לכלי סינתזת הפפטיד לאורך תהליך הסינתזה.
  4. שוקלים 473.9 מ"ג של Fmoc-trp(Boc)-OH (0.9 מילימול) ו-341 מ"ג של 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) (0.9 מילימול) כריאגנטים לצימוד. הוסיפו את האבקות למבחנה והמיסו אותן ב-5 מ"ל של DMF יבש.
  5. הוסף 313.4 מיקרוליטר (1.8 מילימול) של N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) כחומר מפעיל למבחנה (שלב 1.4) וערבב על ידי ניעור הצינורית.
  6. הוסף את תכולת המבחנה לשרף ואפשר לתגובה להמשיך למשך שעה תחת גז חנקן בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מסננים את עודפי ה-DMF באמצעות לחץ גז חנקן ושוטפים את השרף פי 3 עם DMF.
  7. הסר את ההגנה על ה-N מסוף Fmoc באמצעות 5 מ"ל של 20% פיפרידין ב-DMF (v/v) למשך 20 דקות תחת גז חנקן. שטפו את השרף 3x עם DMF (3 x 5 מ"ל).
  8. יבש את השרף על ידי הוספת 5 מ"ל דיכלורומתאן (DCM) ושמור אותו מתחת לגז חנקן למשך 5 דקות, ולאחר מכן רוקן את ה-DCM באמצעות לחץ גז חנקן. הוסף 5 מ"ל מתנול מתחת לגז חנקן למשך 5 דקות כדי להגביר את יובש השרף.
  9. הוסף 10 מ"ל של קוקטייל מחשוף טרי שהוכן של TFA/thioanisole/dithiothreitol/anisole (90:3:5:2 v/v/v/w/v) למשך 2.5 שעות כדי להסיר את ההגנה על כל שרשראות הצד ולבקע את הדיפפטיד מהשרף.
    זהירות: יש להוסיף את קוקטייל המחשוף בגליל מדידה מזכוכית מכיוון ש-TFA הוא חומצי ומסוכן; היזהר בעת השימוש בו.
  10. לאחר 2.5 שעות, מסננים את תמיסת התגובה מכלי הפפטיד באמצעות לחץ חנקן לבקבוק תחתון עגול. הוסף 250 מ"ל של אתר דיאתיל קר (Et2O) לבקבוק התחתון העגול המכיל את הפפטיד הגולמי כדי לזרז את הפפטיד.
  11. מסננים את הפפטיד המשקע באמצעות נייר סינון במשפך חרוטי עם זרוע צד אחת המחוברת למים (כך שהסינון מתרחש עקב לחץ המים), ואוספים את המשקעים (הפפטידים) כדי להסיר לחלוטין את האתר. הפפטיד הגולמי משקע תוך 10 דקות.
  12. טהר את הפפטיד הגולמי על עמודת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) בשלב הפוך (ראה טבלת חומרים) באמצעות מערכת שיפוע. השתמש בשיפוע של 0%-100% אצטוניטריל המכיל 0.1% TFA במים המכילים 0.1% TFA למשך 30-60 דקות בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה.

figure-protocol-1
איור 2: סינתזת פפטידים בשלב מוצק של W-R. קיצורים: HBTU = 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate; DIPEA = N,N-Diisopropylethylamine; TFA = חומצה טריפלואורואצטית; DMF = דימתיל פורממיד. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. קביעת רעילות התאים של הפפטידים המסונתזים

  1. צלחת 2,000 תאים/באר של תאי SK-OV-3, 5,000 תאים/באר של תאי MDA-MB-231, או 5 ×-106 תאים/באר של תאי CCRF-CEM (בנפח כולל של 100 מיקרוליטר לבאר) לתוך מיקרו-צלחת של 96 בארות. לדגור את התאים באטמוספירה לחה של 5% CO2, 95% אוויר ב-37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים למפגש של 75%-80%.
    הערה: מדיית RPMI-16 משמשת לתרבית תאי CCRF-CEM והמדיום החיוני המינימלי (EMEM) של Eagle עבור קווי תאים MDA-MB-231 ו-SK-OV-3. שתי המדיות מתווספות ל-10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (10,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-10 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ב-0.9% NaCl). יש להניח את כל החומרים והתוספים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני תחילת הניסוי. יש לבצע את הניסוי במכסה מנוע לבטיחות ביולוגית, ללבוש כפפות וחלוק מעבדה.
  2. שאפו את המדיום באמצעות פיפטה והוסיפו 100 מיקרוליטר של פפטיד 50 מיקרומטר או 10 מיקרומטר דוקסורוביצין (Dox) המשמש כבקרה חיובית בטריפליקט לבארות המכילות את שלושת הסוגים השונים של תאי סרטן המצופים בצלחת 96 הבארות. החזר את הצלחת לחממה למשך 72 שעות (באותם תנאים שהוזכרו בשלב 2.1).
  3. לאחר 72 שעות, הוסף 20 מיקרוליטר של 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) לצלחת 96 הבארות. עוטפים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגרים את הצלחת למשך 1-4 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה.
    הערה: MTS הוא צבע המשמש להדמיית תאים חיים (לא מטופלים או מטופלים בפפטידים), מכיוון שרק התאים החיים ממירים MTS טטרזוליום לצבע פורמזן צבעוני שניתן למדוד ב-490 ננומטר.
  4. מדוד את הספיגה של תוצר הפורמזן ב-490 ננומטר (A490) בקורא מיקרו-פלטות (ראה טבלת חומרים). כלול מדיום מעורבב עם MTS כריק לניסוי. השתמש במים בלבד (מכיוון שהפפטידים מסיסים במים) וב-0.1 N HCl (מכיוון ש-WCH3 דורש HCl להמסה) כבקרות שליליות.
  5. מדוד את אחוז הישרדות התאים באמצעות המשוואה הבאה (Eq 1), באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני (ראה טבלת חומרים). הנוהל זהה לזה שבו השתמשו Mandal etal 20.
    figure-protocol-2שווה ערך (1)

3. בדיקת פעילות קינאז c-Src

הערה: בדיקת פעילות Src kinase בוצעה באמצעות ערכת בדיקה מסחרית (ראה טבלת חומרים) בשלוש עותקים, על פי הנוהל של Chhikara et al.22. השתמש ב-WCH3 ו-RCH3 בלבד כבקרות כדי להשוות את ההשפעה של חומצת אמינו מתילציה בלבד על קינאז ועם חומצת אמינו אחרת שעברה מתילציה או ללא מתילציה

  1. במשטח שחור לא מחייב בנפח נמוך של 384 בארות, הוסף 2.5 מיקרוליטר מקוקטייל התגובההמכיל 0.7 ננומטר תחום הקינאז 6-Src שלו במאגר קינאז, המהווה חלק מערכת הבדיקה, ל-2.5 מיקרוליטר של פפטידים מדוללים מראש המומסים ב-10% DMSO (ריכוז יעד פי 4). דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות שייקר מיקרופלייט (5 סל"ד) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
    הערה: קוקטייל התגובה מורכב ממאגר קינאז (200 מ"מ HEPES, pH 7.5), MgCl2 (16 מ"מ), DMSO (4%), EGTA (8 מ"מ), 2-מרקפטואתנול (43 מ"מ) ובריג'-35 (0.04%). המצע האופטימלי של תגובת הקינאז של ניסוי זה הוא (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. הוסף לצלחת 5 מיקרוליטר מקוקטייל ה-ATP/מצע (40 מיקרומטר/600 מיקרומטר) ודגירה למשך 30 דקות על שייקר מיקרופלייט בטמפרטורת החדר.
  3. בינתיים, הכן את תערובת זיהוי ה-ADP 1x המכילה 8 ננומטר של עוקב ADP ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן ADP2 מצומד צבע (ראה טבלת חומרים) לעצירה וזיהוי מאגר B (1x) מהערכה. עצור את תגובת הקינאז (שלב 3.2) על ידי הוספת 10 מיקרוליטר מתערובת זיהוי ה-ADP 1x ודגירה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  4. מדוד את עוצמת הקרינה באמצעות קורא מיקרו-פלטות, עם עירור ב-580 ננומטר, פליטה ב-630 ננומטר ורוחב פס של 10 ננומטר. השג יחידות פלואורסצנטיות יחסית (RFUs) מהמכשיר כדי להשיג את אחוז עיכוב האנזים, על פי Eq (2).
    figure-protocol-3Eq (2)
  5. חשב את ערך IC50 כפי שמופיע באתר החברה23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2,W CH3-R, WCH3-R(CH3)2, ופפטידי הביקורת W-R סונתזו באמצעות סינתזת פפטידים בשלב מוצק Fmoc (איור 3), עם טוהר של 95%, 98.7%, 99%, 100%, 100% ו-99.5%, בהתאמה. המבנים הכימיים של דיפפטידים אלה אושרו באמצעות ESI-MS. ערכי m/z של דיפפטידים אלה היו 374.1624, 388.1949, 388.1794, 374.1815, 402.2022 ו-361.1457, בהתאמה.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפפטידים שיוצרו ונבדקו כאן לעיכוב של Src קינאז וכתוצאה מכך הרג של תאים סרטניים הכילו טריפטופן שעבר מתילציה ו/או ארגינין שעבר מתילציה, שהן חומצות אמינו לא טבעיות. היווצרות המשקעים הלבנים עם הוספת אתר דיאתיל היא שלב קריטי בסינתזה של פפטידים אלה. עם זאת, לא כל הפפטידים הסינתטיים יכולים ליצור משקעים; לכן, גם כאשר לא נוצר משקעים, ניתן לאשר סינתזת פפטידים מוצלחת על ידי קביעת המסה הרצויה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה (LC-MS). ניתן להשתמש במסות הפפטידים כדי לחזות את ספקטרום 1<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לדיקן המחקר המדעי (DSR) באוניברסיטת המלך עבד אל-עזיז (KAU), ג'דה, ערב הסעודית, שמימן את הפרויקט הזה במסגרת מענק מס. (ז: 031-130-1443).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-דיתיותרייטולסיגמא-אולדריץ'10708984001סינתזת פפטידים
משפך מסנן פריטי אולדריץ' לסינתזה בשלב מוצקסיגמא-אולדריץ'Z283304כלי סינתזה פפטיד
Alexa594 TracerBell Brook Labs, מדיסון, WI3013
אניזולסיגמא-אולדריץ'8014520500
CellTiter 96 AQueous One  פתרון  ריאגנטים לבדיקת התפשטות תאים PromegaG3582בדיקת התפשטות תאים (מגיב MTS)
דיכלורומתאן, 99.9%,Extra Dry FishersciAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich
(Boc)- OHסיגמא-אולדריץ'47561-25G-F
HPLC C18 טור שימדזו  (מערכת RP-HPLC)שיפוע מים/אצטוניטריל
IRDye QC-1 מרווהמעבדות בל ברוק, מדיסון, WI3013
קורא מיקרופלייט SpectraMax M2eמולקולריים
מיקרוסופט אקסלתוכנת גיליון אלקטרונימיקרוסופט
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA)סיגמא-אולדריץ'496219
N,N-דימתילפורממיד, נטול מים, 99.8%FishersciAA43997M1
Piperidine 20%Sigma-Aldrich80645
שרף אמיד זירת החלקה (100-200 רשת)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisoleSigma-Aldrich92358
Transcreener ADP2 FI AssayBell Brook Labs, Madison, WI3013c-Src ערכת בדיקת פעילות קינאז
8520670025-Fmoc-Trp מכשירים של

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Cancer. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer#:~:text=Cancer%20a%20leading%20cause,and%20rectum%20and%20prostate%20cancers (2022).
  3. Negi, P., Cheke, R. S., Patil, V. M. Recent advances in pharmacological diversification of Src family kinase inhibitors. Egyptian Journal of Medical Human Genetics. 22 (1), 52(2021).
  4. Huang, X. L., et al. Role of receptor tyrosine kinases mediated signal transduction pathways in tumor growth and angiogenesis-New insight and futuristic vision. International Journal of Biological Macromolecules. 180, 739-752 (2021).
  5. Mohammed, S., et al. Sublethal doxorubicin promotes migration and invasion of breast cancer cells: role of Src Family non-receptor tyrosine kinases. Breast Cancer Research. 23 (1), 76(2021).
  6. Biscardi, J. S., Ishizawar, R. C., Silva, C. M., Parsons, S. J. Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c-Src interactions in breast cancer. Breast Cancer Research. 2 (3), 1-8 (2000).
  7. Ortiz, M. A., et al. Src family kinases, adaptor proteins and the actin cytoskeleton in epithelial-to-mesenchymal transition. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 67(2021).
  8. Hill, Z. B., Perera, B. G., Andrews, S. S., Maly, D. J. Targeting diverse signaling interaction sites allows the rapid generation of bivalent kinase inhibitors. ACS Chemical Biology. 7 (3), 487-495 (2012).
  9. Wu, S., Fu, L. Tyrosine kinase inhibitors enhanced the efficacy of conventional chemotherapeutic agent in multidrug resistant cancer cells. Molecular Cancer. 17 (1), 25(2018).
  10. Ayala-Aguilera, C. C., et al. Small molecule kinase inhibitor drugs (1995-2021): Medical indication, pharmacology, and synthesis. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (2), 1047-1131 (2022).
  11. Lyczek, A., et al. Mutation in Abl kinase with altered drug-binding kinetics indicates a novel mechanism of imatinib resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (46), 2111451118(2021).
  12. Musumeci, F., Schenone, S., Brullo, C., Botta, M. An update on dual Src/Abl inhibitors. Future Medicinal Chemistry. 4 (6), 799-822 (2012).
  13. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors: A 2020 update. Pharmacological Research. 152, 104609(2020).
  14. Cohen, P., Cross, D., Jänne, P. A. Kinase drug discovery 20 years after imatinib: Progress and future directions. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (7), 551-569 (2021).
  15. Feng, S., Chen, J. K., Yu, H., Simon, J. A., Schreiber, S. L. Two binding orientations for peptides to the Src SH3 domain: development of a general model for SH3-ligand interactions. Science. 266 (5188), 1241-1247 (1994).
  16. Alexandropoulos, K., Cheng, G., Baltimore, D. Proline-rich sequences that bind to Src homology 3 domains with individual specificities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (8), 3110-3114 (1995).
  17. Feng, S., Kasahara, C., Rickles, R. J., Schreiber, S. L. Specific interactions outside the proline-rich core of two classes of Src homology 3 ligands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (26), 12408-12415 (1995).
  18. Polverini, E., Rangaraj, G., Libich, D. S., Boggs, J. M., Harauz, G. Binding of the proline-rich segment of myelin basic protein to SH3 domains: Spectroscopic, microarray, and modeling studies of ligand conformation and effects of posttranslational modifications. Biochemistry. 47 (1), 267-282 (2008).
  19. Weng, Z., et al. Structure-function analysis of SH3 domains: SH3 binding specificity altered by single amino acid substitutions. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5627-5634 (1995).
  20. Mandal, D., Nasrolahi Shirazi, A., Parang, K. Cell-penetrating homochiral cyclic peptides as nuclear-targeting molecular transporters. Angewandte Chemie. 50 (41), 9633-9637 (2011).
  21. Hussein, W. M., Skwarczynski, M., Toth, I. Peptide Synthesis: Methods and Protocols. , Humana Press. (2020).
  22. Chhikara, B. S., et al. Phenylpyrazalopyrimidines as tyrosine kinase inhibitors: Synthesis, antiproliferative activity, and molecular simulations. Molecules. 25 (9), 2135(2020).
  23. TRANSCREENER ADP2 Fl Assay. BellBrook Labs. , Available from: https://www.bellbrooklabs.com/wp-content/uploads/2021/03/Tech-Manual-ADP2-Fl-v031621.pdf (2022).
  24. Sanner, M. F., et al. Cyclic peptides as protein kinase inhibitors: Structure-activity relationship and molecular modeling. Journal of Chemical Information and Modeling. 61 (6), 3015-3026 (2021).
  25. Nahhas, A. F., Nahhas, A. F., Webster, T. J. The physical properties of tripeptide stereocomplex nano-formations. Journal of Biomedical Nanotechnology. 16 (10), 1495-1503 (2020).
  26. Nahhas, A. F., Chang, R., Webster, T. J. Introducing unnatural amino acids-containing tripeptides as antimicrobial and anticancer agents. Journal of Biomedical Nanotechnology. 14 (5), 987-993 (2018).
  27. Deng, G., et al. Tryptophan-containing dipeptide derivatives as potent PPARγ antagonists: design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling. European Journal of Medicinal Chemistry. 43 (12), 2699-2716 (2008).
  28. Chetty, V. T., Sharma, A. M. Can PPARγ agonists have a role in the management of obesity-related hypertension. Vascular Pharmacology. 45 (1), 46-53 (2006).
  29. Skeggs, L. T., Kahn, J. R., Shumway, N. P. The preparation and function of the hypertensin-converting enzyme. Journal of Experimental Medicine. 103 (3), 295-299 (1956).
  30. Lunow, D., Kaiser, S., Brückner, S., Gotsch, A., Henle, T. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis. European Food Research and Technology. 237 (1), 27-37 (2013).
  31. Weber, J., Wilke-Mounts, S., Grell, E., Senior, A. E. Tryptophan fluorescence provides a direct probe of nucleotide binding in the noncatalytic sites of Escherichia coli F1-ATPase. The Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 11261-11268 (1994).
  32. Iavarone, A. T., Patriksson, A., vander Spoel, D., Parks, J. H. Fluorescence probe of Trp-cage protein conformation in solution and in gas phase. Journal of the American Chemical Society. 129 (21), 6726-6735 (2007).
  33. Nongonierma, A. B., Fitzgerald, R. J. Inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) by tryptophan containing dipeptides. Food & Function. 4 (12), 1843-1849 (2013).
  34. Bjelke, J. R., et al. Dipeptidyl peptidases 8 and 9: specificity and molecular characterization compared with dipeptidyl peptidase IV. The Biochemical Journal. 396 (2), 391-399 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Src Kinase InhibitionMethylated DipeptidesSolid Phase Peptide SynthesisAnti Cancer PeptidesTyrosine Kinase ActivityAcellular AssaysPeptide PermeabilityCancer Cell LinesPeptide FunctionalizationIC50 Measurement