Method Article

יישומים טכניים של מערך מיקרו-אלקטרודות והקלטות מהדקי טלאים על קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) התגלו כמודל מבטיח במבחנה לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות ומידול מחלות. כאן אנו מפרטים פרוטוקול למדידת התכווצות ואלקטרופיזיולוגיה של hiPSC-CMs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות היא הגורם המוביל להתשה של תרופות ולגמילה מהשוק. לכן, שימוש במודלים מתאימים להערכת בטיחות הלב הפרה-קלינית הוא צעד קריטי במהלך פיתוח תרופות. נכון לעכשיו, הערכת בטיחות הלב עדיין תלויה מאוד במחקרים בבעלי חיים. עם זאת, מודלים של בעלי חיים סובלים מספציפיות ירודה של בני אדם בשל הבדלים ספציפיים למינים, במיוחד במונחים של מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים לבביים. לפיכך, יש צורך דחוף לפתח מודל אמין, יעיל ומבוסס אדם להערכת בטיחות לב פרה-קלינית. קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם (hiPSC-CMs) התגלו כמודל חוץ-גופי שלא יסולא בפז לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על-ידי תרופות ולמידול מחלות. ניתן לקבל hiPSC-CMs מאנשים עם רקע גנטי מגוון ומצבים חולים שונים, מה שהופך אותם לפונדקאית אידיאלית להערכת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות בנפרד. לכן, מתודולוגיות כדי לחקור באופן מקיף את המאפיינים הפונקציונליים של hiPSC-CMs צריך להיות מבוסס. בפרוטוקול זה אנו מפרטים מבחנים פונקציונליים שונים שניתן להעריך ב- hiPSC-CMs, כולל מדידת התכווצות, פוטנציאל שדה, פוטנציאל פעולה וטיפול בסידן. באופן כללי, לשילוב של hiPSC-CMs בהערכת בטיחות לב פרה-קלינית יש פוטנציאל לחולל מהפכה בפיתוח תרופות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח תרופות הוא תהליך ארוך ויקר. מחקר של תרופות טיפוליות חדשות שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) בין השנים 2009 ל-2018 דיווח כי העלות החציונית המשוערת של מחקרים וניסויים קליניים מהוונים הייתה 985 מיליון דולר למוצר1. קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות היא הגורם המוביל להתשה של תרופות ולגמילה מהשוק2. יש לציין כי קרדיוטוקסיות מדווחת בקרב סוגים רבים של תרופות טיפוליות3. לכן, הערכת בטיחות הלב היא מרכיב מכריע בתהליך פיתוח התרופה. הפרדיגמה הנוכחית להערכת בטיחות הלב עדיין תלויה מאוד במודלים של בעלי חיים. עם זאת, הבדלים בין מינים מהשימוש במודלים של בעלי חיים מוכרים יותר ויותר כגורם עיקרי לתח....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה ופתרונות

  1. הכן מדיום תחזוקה hiPSC-CM על ידי ערבוב בקבוק 10 מ"ל של תוסף 50x B27 ו 500 מ"ל של RPMI 1640 בינוני. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו תוך חודש. יש לאזן את הטמפרטורה הבינונית עד לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
  2. הכן מדיום זריעה hiPSC-CM על ידי ערבוב 20 מ"ל של החלפת סרום ו 180 מ"ל של מדיום תחזוקה hiPSC-CM (10% דילול, v / v). בעוד שעדיף לזרוע טרייה בינונית, ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבועיים. יש לאזן את המדיום ל-RT לפני השימוש.
  3. הכן תמיסת ציפוי מטריצה חוץ-תאית על ידי הפשרת בקבוק אחד (10 מ"ל) של מטריצת קרום מרתף ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה והעלאת 500 μL....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד את תנועת הכיווץ, פוטנציאל השדה, פוטנציאל הפעולה ו-Ca2+ חולף של hiPSC-CMs. דיאגרמה סכמטית הכוללת עיכול אנזימטי, זריעת תאים, תחזוקה והולכת בדיקה תפקודית מוצגת באיור 1. היווצרות החד-שכבתית hiPSC-CM נחוצה למדידת תנועת ההתכווצות (איור 2B). עקבות מייצגים של תנועת ההתכווצות-הרפיה של hiPSC-CMs מוצגים באיור 2C. תוכנת האנליזה מאפשרת ניתוח של עקבות תנועה של כיווץ-הרפיה באופן אוטומטי על ידי זיהוי התחלת הכי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית iPSC אנושית התפתחה כפלטפורמה רבת עוצמה למידול מחלות ובדיקת תרופות. כאן נתאר פרוטוקול מפורט למדידת התכווצות hiPSC-CM, פוטנציאל שדה, פוטנציאל פעולה ו-Ca2+ חולף. פרוטוקול זה מספק אפיון מקיף של התכווצות hiPSC-CM ואלקטרופיזיולוגיה. מבחנים פונקציונליים אלה יושמו בפרסומים מרובים מהקבוצה שלנו 12,13,18,24,25,26,27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. הוא מייסד שותף של Greenstone Biosciences אך אין לו אינטרסים מתחרים, שכן העבודה המוצגת כאן היא עצמאית לחלוטין. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לבלייק וו על הגהת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, ונאס"א NNX16A069A (JCW), ו 872244 מלגת פוסט-דוקטורט של AHA (GMP).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ עם מיקרו-באר 20 מ"מ #1.5 כיסוי זכוכיתCellvisD35-20-1.5-Nמהדק תיקון
50x B27 תוספימזון LifeTechnologies 17504-044hiPSC-CM תרבית בינונית
6 בארות צלחת תרביתE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM תרבית
96 בארות שטוחות שקופות תחתית פוליסטירן שחור מטופלות TC מיקרו-פלטותקורנינג3603מדידת תנועת התכווצות
AccutaseSigma-AldrichA6964דיסוציאציה אנזימטית
הסטודיו המשולב של Axion (AxIS)תוכנת ניווטAxion Biosystems
נימי זכוכית בורוסיליקטמנגנון הרווארדBF 100-50-10,מהדק תיקון
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s פתרון
שקופיות תא ספירת תאיםThermoFisher ScientificC10228ספירת תאים
CytoView 48 בארות צלחות MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48B
MEA DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028מטריצה חוץ-תאית
בינונית DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםפישר סיינטיפיק14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889תמיסת פיפטה תוך-תאית
EPC 10 USB  מגבר מהדק תיקוןWarner Instruments89-5000מהדק תיקון
Fura-2, AM, תא מתאים ThermoFisherScientificF1221Ca2+ מדידה חולפת
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270Tyrode' s פתרון
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s solution
hiPSCsמכון הלב וכלי הדם של סטנפורד iPSC ביובנק
KClסיגמא-אולדריץ'529552טירוד s פתרון
החלפת סרום נוקאאוטThermoFisher Scientific10828-028מדיום זריעה hiPSC-CM
KOH 8  MSigma-AldrichP4494תמיסת פיפטה תוך-תאית
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ מדידה חולפת; מקור אור מיתוג אורך גל במהירות גבוהה במיוחד
Luna-FL מונה תאי פלואורסצנטי אוטומטיWISBIOMEDLB-L20001ספירת תאים
Maestro Pro  מערכת MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor מופחת (GFR) מטריצת ממברנה בסיסית356231 מדיוםמטריצה חוץ-תאית
MgATPSigma-AldrichA9187תמיסת פיפטה תוך-תאית
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s solution
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s פתרון
NaOH 10  מסיגמא-אולדריץ72068טירוד s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (תמיסה של 20% ב-DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ מדידת חולף
RPMI 1640 mediumLife Technologies11875-119מדיום תרבית hiPSC-CM
Sony SI8000 מערכת הדמיית תנועה של תאיםSony Biotechnologyמדידת תנועה מתכווצת
חולץ מיקרופיפטה סאטרמכשירי סאטרP-97מהדק תיקון
כתם כחול טריפןLife TechnologiesT10282ספירת תאים
'

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles