Method Article

יישומים טכניים של מערך מיקרו-אלקטרודות והקלטות מהדקי טלאים על קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) התגלו כמודל מבטיח במבחנה לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות ומידול מחלות. כאן אנו מפרטים פרוטוקול למדידת התכווצות ואלקטרופיזיולוגיה של hiPSC-CMs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות היא הגורם המוביל להתשה של תרופות ולגמילה מהשוק. לכן, שימוש במודלים מתאימים להערכת בטיחות הלב הפרה-קלינית הוא צעד קריטי במהלך פיתוח תרופות. נכון לעכשיו, הערכת בטיחות הלב עדיין תלויה מאוד במחקרים בבעלי חיים. עם זאת, מודלים של בעלי חיים סובלים מספציפיות ירודה של בני אדם בשל הבדלים ספציפיים למינים, במיוחד במונחים של מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים לבביים. לפיכך, יש צורך דחוף לפתח מודל אמין, יעיל ומבוסס אדם להערכת בטיחות לב פרה-קלינית. קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם (hiPSC-CMs) התגלו כמודל חוץ-גופי שלא יסולא בפז לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על-ידי תרופות ולמידול מחלות. ניתן לקבל hiPSC-CMs מאנשים עם רקע גנטי מגוון ומצבים חולים שונים, מה שהופך אותם לפונדקאית אידיאלית להערכת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות בנפרד. לכן, מתודולוגיות כדי לחקור באופן מקיף את המאפיינים הפונקציונליים של hiPSC-CMs צריך להיות מבוסס. בפרוטוקול זה אנו מפרטים מבחנים פונקציונליים שונים שניתן להעריך ב- hiPSC-CMs, כולל מדידת התכווצות, פוטנציאל שדה, פוטנציאל פעולה וטיפול בסידן. באופן כללי, לשילוב של hiPSC-CMs בהערכת בטיחות לב פרה-קלינית יש פוטנציאל לחולל מהפכה בפיתוח תרופות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח תרופות הוא תהליך ארוך ויקר. מחקר של תרופות טיפוליות חדשות שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) בין השנים 2009 ל-2018 דיווח כי העלות החציונית המשוערת של מחקרים וניסויים קליניים מהוונים הייתה 985 מיליון דולר למוצר1. קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות היא הגורם המוביל להתשה של תרופות ולגמילה מהשוק2. יש לציין כי קרדיוטוקסיות מדווחת בקרב סוגים רבים של תרופות טיפוליות3. לכן, הערכת בטיחות הלב היא מרכיב מכריע בתהליך פיתוח התרופה. הפרדיגמה הנוכחית להערכת בטיחות הלב עדיין תלויה מאוד במודלים של בעלי חיים. עם זאת, הבדלים בין מינים מהשימוש במודלים של בעלי חיים מוכרים יותר ויותר כגורם עיקרי לתחזיות לא מדויקות עבור קרדיוטוקסיות הנגרמות על ידי תרופות בחולים אנושיים4. לדוגמה, המורפולוגיה של פוטנציאל הפעולה הלבבית שונה באופן מהותי בין בני אדם לעכברים בשל התרומות של זרמי רפולריזציה שונים5. בנוסף, איזופורמים דיפרנציאליים של מיוזין לב ורנ"א מעגלי שיכולים להשפיע על הפיזיולוגיה של הלב תועדו היטב בקרב מינים 6,7. כדי לגשר על פערים אלה, חובה לבסס מודל אמין, יעיל ומבוסס אדם להערכת בטיחות לב פרה-קלינית.

ההמצאה פורצת הדרך של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) יצרה פלטפורמות חסרות תקדים לבדיקת תרופות ומידול מחלות. במהלך העשור האחרון, שיטות ליצירת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (hiPSC-CMs) הפכו מבוססות היטב 8,9. hiPSC-CMs משכו עניין רב ביישומים הפוטנציאליים שלהם במידול מחלות, בדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות ורפואה מדויקת. לדוגמה, hiPSC-CMs שימשו למודל הפנוטיפים הפתולוגיים של מחלות לב הנגרמות על ידי ירושה גנטית, כגון תסמונת QT ארוכה10, קרדיומיופתיה היפרטרופית 11,12, וקרדיומיופתיה מורחבת13,14,15. כתוצאה מכך, זוהו מסלולי איתות מרכזיים המעורבים בפתוגנזה של מחלות לב, מה שיכול לשפוך אור על אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול יעיל. יתר על כן, hiPSC-CMs שימשו לבדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות הקשורות לסוכנים אנטי סרטניים, כולל דוקסורוביצין, טרסטוזומאב ומעכבי טירוזין קינאז16,17,18; אסטרטגיות להפחתת קרדיוטוקסיות כתוצאה מכך נמצאות בחקירה. לבסוף, המידע הגנטי שנשמר ב- hiPSC-CMs מאפשר סריקה וחיזוי של קרדיוטוקסיות הנגרמות על ידי תרופות הן ברמת הפרט והן ברמת האוכלוסייה19,20. באופן קולקטיבי, hiPSC-CMs הוכיחו את עצמם ככלי רב ערך לחיזוי בטיחות לב מותאם אישית.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבסס מתודולוגיות כדי לחקור באופן מקיף ויעיל את המאפיינים הפונקציונליים של hiPSC-CMs, שהם בעלי חשיבות רבה ביישום hiPSC-CMs לקראת מודלים של מחלות, בדיקת קרדיוטוקסיות הנגרמת על ידי תרופות ורפואה מדויקת. כאן אנו מפרטים מערך של מבחנים פונקציונליים כדי להעריך את התכונות הפונקציונליות של hiPSC-CMs, כולל מדידת התכווצות, פוטנציאל שדה, פוטנציאל פעולה וטיפול בסידן (Ca2+) (איור 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה ופתרונות

  1. הכן מדיום תחזוקה hiPSC-CM על ידי ערבוב בקבוק 10 מ"ל של תוסף 50x B27 ו 500 מ"ל של RPMI 1640 בינוני. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בו תוך חודש. יש לאזן את הטמפרטורה הבינונית עד לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
  2. הכן מדיום זריעה hiPSC-CM על ידי ערבוב 20 מ"ל של החלפת סרום ו 180 מ"ל של מדיום תחזוקה hiPSC-CM (10% דילול, v / v). בעוד שעדיף לזרוע טרייה בינונית, ניתן לאחסן אותה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבועיים. יש לאזן את המדיום ל-RT לפני השימוש.
  3. הכן תמיסת ציפוי מטריצה חוץ-תאית על ידי הפשרת בקבוק אחד (10 מ"ל) של מטריצת קרום מרתף ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה והעלאת 500 μL של מטריצת קרום מרתף בצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לשימוש נוסף. יש לערבב 500 μL של מטריצת ממברנת מרתף ו-100 מ"ל של מדיום DMEM/F12 קר כקרח (דילול 1:200, v/v) כדי ליצור תמיסת ציפוי מטריצת ממברנה במרתף.
  4. הכן 50 מ"ל של תמיסה של Tyrode המכילה 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl2, 5 mM גלוקוז, ו 10 mM HEPES. התאם את ה-pH ל-7.4 באמצעות NaOH. הכינו את הפתרון של טירוד טרי ביום הניסוי.
  5. הכן 50 מ"ל של תמיסת פיפטה תוך תאית המכילה 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA ו- 10 mM HEPES. התאם את ה-pH ל-7.2 באמצעות KOH. Aliquot את תמיסת פיפטה תוך תאית בצינורות סטריליים 5 מ"ל ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. ביום הניסוי, הוסף MgATP טרי לתמיסה כדי להשיג ריכוז סופי של 3 mM.
  6. הכן 1 מ"ל של תמיסת העמסה Fura-2 AM המכילה 2 μM Fura-2 AM ו- 0.1% F-127 פלורוני. הכינו תמיסת העמסה טרייה ביום הניסוי והגנו עליה מפני האור.

2. מדידת תנועת כיווץ hiPSC-CM

  1. הכן לוחות מצופים מטריצת מטריצת מרתף על ידי הוספת 100 μL של תמיסת ציפוי מטריצה חוץ-תאית לכל באר של 96 צלחות היטב. לדגום את לוחות 96 הבאר באינקובטור תרבית תאים לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בלילה.
  2. דיסוציאציה אנזימטית של hiPSC-CMs
    1. בקש hiPSCs ממכון הלב וכלי הדם של סטנפורד iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). צור hiPSC-CMs על פי הפרסומים הקודמים 8,9. שימו לב ל-hiPSC-CMs שגודלו בתרבית בלוחות של שש בארות תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10.
      הערה: אין לנתק את התאים כאשר הם עדיין מתרבים. אחרת, התאים יצמחו יתר על המידה על הבארות לאחר ציפוי מחדש ויובילו לתוצאות לא מדויקות של הבדיקות התפקודיות. בדרך כלל, hiPSC-CMs להפסיק את ההתרבות בימים 18-23.
    2. ודא שה- hiPSC-CMs פועמים בחוזקה ויש להם טוהר של מעל 95%. להעריך את הטוהר על ידי immunostaining נגד טרופונין לב T, סמן ספציפי של cardiomyocytes 8,9.
    3. שאפו את אמצעי התחזוקה ושטפו את התאים עם 1x DPBS פעמיים. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים לכל באר של לוחות שש הבארות ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש לעקוב באופן קבוע אחר משך הדגירה. הקפידו לא לעכל את התאים יתר על המידה, שכן הדבר יפגע בכדאיות התאים.
    4. פיפטה עדינה hiPSC-CMs למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות פיפטה 5 מ"ל כדי ליצור השעיה של תא יחיד. הוסף נפח שווה של מדיום זריעת hiPSC-CMs כדי לנטרל את תמיסת ניתוק התא.
    5. צנטריפוגה hiPSC-CMs ב 300 x g במשך 3 דקות ב RT. לשאוף את supernatant ולהשעות את גלולת התא ב 1-2 מ"ל של מדיום זריעה hiPSC-CM.
    6. כמת את צפיפות התאים ואת הכדאיות שלהם באמצעות שיטת הרחקה של טריפאן כחול. בקצרה, ערבבו 10 μL של תרחיף תאים עם נפח שווה של כחול טריפאן, העבירו לשקופית ספירת תאים, ולאחר מכן ספרו באמצעות מונה תאים, כפי שתואר קודםלכן 21.
  3. זריעת hiPSC-CMs
    1. הסר את תמיסת ציפוי המטריצה החוץ-תאית מלוחות 96 הבארות.
    2. זרעו 50,000 תאים לבאר ב-100 מיקרון של מדיום זריעה hiPSC-CM והניחו את לוחות 96 הבאר באינקובטור של תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך הלילה.
    3. החלף את מדיום הזריעה hiPSC-CM ב-100 μL של מדיום תחזוקה hiPSC-CM יום אחד לאחר הציפוי. שנה את מדיום התחזוקה של hiPSC-CM כל יומיים עד ההקלטה.
  4. איסוף נתונים
    1. מדוד את תנועת הכיווץ hiPSC-CM לפחות 10 ימים לאחר הציפוי (מומלץ).
    2. הפעל את בקר הטמפרטורה והגדר 37 °C כטמפרטורה המועדפת. הפעל את המיקרוסקופ, המצלמה ואספקת CO2 .
    3. מלאו את מעיל המים של מחזיק הצלחת בכמות מתאימה של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה (איור 2A). הניחו את הצלחת בת 96 הבארות על מחזיק הצלחת ואפשרו לתאים להתאקלם למשך 5 דקות לפחות.
    4. פתח את תוכנת התצוגה, הגדר את קצב פריימים של המצלמה ל- 75 פריימים לשנייה (fps) ואת רזולוציית הווידאו / תמונה ל- 1024 × 1024 פיקסלים. החל את הפונקציות מיקוד אוטומטי ובהירות אוטומטית. הקלט סרטונים ותמונות של hiPSC-CMs.
      הערה: הימנע מרטט של טבלת המיקרוסקופ במהלך ההקלטה.
    5. פתח את תוכנת המנתח לניתוח אוטומטי.

3. מדידת פוטנציאל שדה hiPSC-CM

  1. הכנת לוחות מצופים מטריצת מטריצת מרתף
    1. הנח בזהירות טיפה של 8 μL של תמיסת ציפוי מטריצה חוץ-תאית מעל אזור אלקטרודות ההקלטה של כל באר של לוחות מערך המיקרואלקטרודות (MEA) של 48 בארות. ראו איור 3A עבור אזור האלקטרודה המתאים למיקום טיפות. שלב זה הוא קריטי לשמירה על המונולייר hiPSC-CM מרוכז באלקטרודות. הימנע מלגעת באלקטרודות בשום פנים ואופן.
    2. הוסיפו 3 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה לאזור המקיף את הבארות (איור 3A) של לוחות MEA בעלי 48 בארות כדי למנוע אידוי של תמיסות הציפוי. לדגום 48-well MEA צלחות באינקובטור תרבית תאים לחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 45-60 דקות.
      הערה: אין לדגור במשך זמן רב מדי כדי למנוע את התייבשות מטריצת קרום המרתף.
  2. בצע דיסוציאציה אנזימטית של hiPSC-CMs כמתואר בשלב 2.2.
  3. זריעת hiPSC-CMs
    1. הסר את רוב מדיום המטריצה החוץ-תאית משטח הבאר מבלי לגעת באלקטרודות באמצעות קצה פיפטה של 200 μL באותה שורה או עמודה בודדת.
    2. זרע 50,000 תאים לכל באר בטיפה של 8 μL של מדיום זריעה hiPSC-CM מעל שטח אלקטרודת ההקלטה של כל באר מאותה שורה או עמודה.
    3. חזור על שני השלבים האחרונים עד שכל הבארות היו מצופות בתאים. בדוק מתחת למיקרוסקופ שלכל הבארות יש את ההשעיה hiPSC-CM. לצפיפות הרצויה, ראו איור 3B.
      הערה: חיבור של hiPSC-CMs ייפגע אם מטריצת קרום המרתף מיובשת לחלוטין, מה שהופך את חיבור התא לתת-אופטימלי.
    4. דגירה של לוחות MEA בגודל 48 בארות באינקובטור תרבית תאים לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 60 דקות.
    5. הוסיפו באיטיות ובעדינות 150 μL של מדיום זריעה hiPSC-CM לכל באר של צלחות MEA בגודל 48 בארות. כדי להוסיף מדיום מבלי לפזר hiPSC-CMs שנזרעו בעבר, החזיקו את הצלחת בזווית של 45 מעלות, השכיבו את קצה הפיפטה על הקיר של כל באר, ושחררו את המדיום באיטיות.
      הערה: הוספת בינוני מהר מדי או בלחץ גבוה תנתק את הקרדיומיוציטים הדביקים. הימנע ממגע ישיר עם מתלה נפילה hiPSC-CM.
    6. לדגום את לוחות MEA 48 באר באינקובטור תרבית תאים לחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לילה.
    7. רענן את מדיום הזריעה hiPSC-CM עם 300 μL של מדיום תחזוקה hiPSC-CM יום אחד לאחר הציפוי. שנה את מדיום התחזוקה hiPSC-CM כל יומיים לפני ההקלטה.
  4. איסוף נתונים
    1. יש לבצע מדידת MEA לפחות 10 ימים לאחר הציפוי (מומלץ). ביום 10 לאחר הציפוי, בדקו את הצפיפות של הכאה ספונטנית של hiPSC-CM מונולייר תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 10, שאמורה להיות כפי שמוצג באיור 3C.
    2. מניחים את צלחת ה-MEA בעלת 48 הבארות בכלי ההקלטה. מסך המגע מאפשר לצפות בטמפרטורה (37 מעלות צלזיוס) ובמצב CO2 (5%).
    3. פתח את תוכנת הנווט. בחלון ההגדרה הניסיונית, בחר תצורת לב בזמן אמת והקלטות פוטנציאליות שדה. החל תצורות מכות ספונטניות או קצביות.
    4. בפרמטרים של זיהוי פעימות, הגדר את סף הזיהוי ל- 300 μV, תקופת פעימה מינימלית ל- 250 אלפיות השנייה ותקופת פעימה מקסימלית ל- 5 שניות. בחר רגרסיה פולינומית לחישוב משך פוטנציאל השדה (FPD).
    5. בדוק אם אות הפעילות החשמלית הבסיסי בוגר ויציב.
      הערה: צורות הגל הבוגרות שנרשמו על-ידי כל אלקטרודה מלוחית MEA מרובת הבארות חייבות לשקף את פוטנציאל שדה הלב עם מאפיינים הניתנים לזיהוי בקלות במקביל לעלייה חדה בדה-פולריזציה של הלב ובשלב ה-repolarization, כפי שמוצג באיור 3D-F.
    6. לרכוש את פעילויות הלב הבסיסיות במשך 1-3 דקות. אם יש צורך בטיפול תרופתי, הוסיפו תרכובות לבארות לאחר ההקלטה הבסיסית. מניחים את הצלחת באינקובטור לפחות 30 דקות לפני ההקלטה הבאה.

4. מדידת פוטנציאל פעולה hiPSC-CM

  1. הכינו כלים מצופים במטריקס של ממברנות מרתף על-ידי הנחת 500 μL של תמיסת ציפוי מטריצה חוץ-תאית על החלק התחתון של הזכוכית של כלים בקוטר 35 מ"מ (איור 4A). לדגום את הכלים 35 מ"מ באינקובטור תרבית תאים לחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לילה.
  2. בצע דיסוציאציה אנזימטית של hiPSC-CMs כמתואר בשלב 2.2.
  3. זריעת hiPSC-CMs
    1. הסר את תמיסת ציפוי המטריצה החוץ-תאית מהכלים בקוטר 35 מ"מ. זרע 50,000 תאים לכל באר ב 500 μL של מדיום זריעה hiPSC-CM על החלק התחתון זכוכית של צלחות 35 מ"מ.
    2. לדגום את הכלים 35 מ"מ באינקובטור תרבית תאים לחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לילה. הסר את מדיום הזריעה hiPSC-CM והוסף 2 מ"ל של מדיום תחזוקה hiPSC-CM למנות 35 מ"מ.
      הערה: מומלץ לשים קצה לא מסונן של 200 μL מעל פיפטה השאיפה של 2 מ"ל כדי להסיר את המדיום המושקע כדי למנוע נגיעה בתאים.
    3. שנה את מדיום תרבות hiPSC-CM כל יומיים לפני ההקלטה.
  4. איסוף נתונים
    1. בצע מדידת פוטנציאל פעולה לפחות 10 ימים לאחר הציפוי (מומלץ). הכינו את הפתרון של טירודה טרייה כמתואר בשלב 1.4. הפשירו אליקוט אחד של תמיסת פיפטה תוך תאית והוסיפו MgATP טרי לריכוז סופי של 3 mM.
    2. משוך את המיקרופיפטים מנימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך מיקרו-פיפטה.
      הערה: עדיפות להתנגדות של 2-5 MΩ של המיקרופיפטות.
    3. החלף את מדיום התחזוקה hiPSC-CM בתמיסה של Tyrode ואפשר לתאים להתאקלם לפתרון של Tyrode למשך 15 דקות (איור 4C). הכנס את חיישני הטמפרטורה לתא, הכנס את צלחת ה-35 מ"מ לתא כפי שמוצג באיור 4C, והתאם את הטמפרטורה ל-37 °C (איור 4D).
    4. מלאו את המיקרו-פיפטות בתמיסה תוך-תאית והכניסו אותן למחזיק המחובר לראש מגבר המדבקה (איור 4E). פתח את תוכנת הגירוי/רכישה, טען את פרוטוקול הקלטת פוטנציאל הפעולה ובחר את תצורת מהדק המתח.
    5. הכנס את המיקרופיפטה לתמיסת האמבטיה, בחר hiPSC-CMs יחיד מתאים, והתאם והורד את מיקום המיקרופיפטה ליד התא שנבחר באמצעות מיקרומניפולטור. כאשר קצה הפיפטה מוכנס לתמיסת האמבטיה, בדוק את עמידות הפיפטה שניתן לראות על צג האוסצילוסקופ.
    6. מקם את הפיפטה קרוב לתא, והפולסים הנוכחיים יפחתו מעט כדי לשקף את התנגדות האטם הגוברת. החל יניקה עדינה עם לחץ שלילי כדי להגדיל את ההתנגדות, אשר תיצור gigaseal. החלת פונקציית החותם .
    7. החל יניקה נוספת כדי לשבור את הממברנה כדי לקבל תצורת הקלטה של תא שלם. ברגע שחלק הממברנה בתוך אזור הפיפטה נקרע על ידי יניקה, התמיסה הפנימית נמצאת בשיווי משקל עם הציטופלסמה של התא. בשלב זה, עבור ממצב מהדק מתח (מהדק V) למצב מהדק זרם או ללא הזרקת זרם (C-Clamp) באמצעות תיבת הדו-שיח של המגבר. לחץ על תקליט כפתור כדי ליצור ולשמור את קבצי ההקלטה הפוטנציאליים של הפעולה.
      הערה: שינוי המצב מספק הקלטה רציפה של פוטנציאל הפעולה הספונטני של hiPSC-CMs באמצעות פרוטוקול הקלטה ללא טריגר וללא גירוי, אשר ניתן לנטר בפלט V-mon של מגבר מהדק התיקון.

5. מדידת hiPSC-CM Ca2+ חולף

  1. עיין בפרוטוקול הקודם להכנת תאי תאים מותאמים אישית להדמיית Ca 2+ 21. להכנת תא התא המצופה במטריצת מטריצת המרתף, מקם 200 μL של תמיסת ציפוי מטריצה חוץ-תאית בתאי התא. לדגור את תאי התאים באינקובטור תרבית תאים לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך הלילה.
  2. בצע דיסוציאציה אנזימטית של hiPSC-CMs כמתואר בשלב 2.2.
  3. זריעת hiPSC-CMs
    1. הסר את תמיסת ציפוי המטריצה החוץ-תאית מתאי התא. זרע 20,000 תאים לכל באר ב 200 μL של מדיום זריעה hiPSC-CM.
    2. החלף את מדיום הזריעה hiPSC-CM ב-200 μL של מדיום תחזוקה hiPSC-CM יום אחד לאחר הציפוי. שנה את מדיום התחזוקה hiPSC-CM כל יומיים לפני ההקלטה.
  4. איסוף נתונים
    1. בצע מדידת ארעיות של Ca2+ לפחות 10 ימים לאחר הציפוי (מומלץ). הכינו את הפתרון של טירודה טרייה כמתואר בשלב 1.4. הכן פתרון טעינה פורה - 2 בבוקר כמתואר בשלב 1.6.
    2. שאפו את מדיום התחזוקה hiPSC-CM ושטפו עם הפתרון של Tyrode פעמיים. החל 100 μL של פתרון טעינה Fura-2 AM ודגירה במשך 10 דקות ב- RT.
    3. החלף את פתרון הטעינה Fura-2 AM בפתרון של Tyrode ואפשר לפחות 5 דקות לדה-אסטריפיקציה מלאה של Fura-2 AM.
    4. הוסף טיפה של שמן טבילה על המטרה 40x של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד במטרה לטבול שמן 40x (0.95 NA). מקם את תא התא במתאם הבמה של המיקרוסקופ (איור 5A).
    5. התקן את חוטי בקר הטמפרטורה לתא האמבטיה והגדר אותו ל -37 מעלות צלזיוס. התקן את אלקטרודות גירוי השדה החשמלי והגדר את הפולסים ל-0.5 הרץ עם משך זמן של 20 אלפיות השנייה.
    6. הפעל את מקור האור המחליף אורך גל במהירות גבוהה במיוחד והגדר אותו למצב מיתוג מהיר של 340 ננומטר ו-380 ננומטר בהתאם להוראות המכשיר.
    7. החל זמן חשיפה של 20 אלפיות השנייה עבור שני אורכי הגל וזמן הקלטה של 20 שניות בתוכנה. הקלט את הסרטון המשקף שינויים בזמן אמת של Ca2+ חולף ב- hiPSC-CMs. ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני ונתח את הנתונים כפי שתואר קודםלכן 23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד את תנועת הכיווץ, פוטנציאל השדה, פוטנציאל הפעולה ו-Ca2+ חולף של hiPSC-CMs. דיאגרמה סכמטית הכוללת עיכול אנזימטי, זריעת תאים, תחזוקה והולכת בדיקה תפקודית מוצגת באיור 1. היווצרות החד-שכבתית hiPSC-CM נחוצה למדידת תנועת ההתכווצות (איור 2B). עקבות מייצגים של תנועת ההתכווצות-הרפיה של hiPSC-CMs מוצגים באיור 2C. תוכנת האנליזה מאפשרת ניתוח של עקבות תנועה של כיווץ-הרפיה באופן אוטומטי על ידי זיהוי התחלת הכי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכנולוגיית iPSC אנושית התפתחה כפלטפורמה רבת עוצמה למידול מחלות ובדיקת תרופות. כאן נתאר פרוטוקול מפורט למדידת התכווצות hiPSC-CM, פוטנציאל שדה, פוטנציאל פעולה ו-Ca2+ חולף. פרוטוקול זה מספק אפיון מקיף של התכווצות hiPSC-CM ואלקטרופיזיולוגיה. מבחנים פונקציונליים אלה יושמו בפרסומים מרובים מהקבוצה שלנו 12,13,18,24,25,26,27.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. הוא מייסד שותף של Greenstone Biosciences אך אין לו אינטרסים מתחרים, שכן העבודה המוצגת כאן היא עצמאית לחלוטין. המחברים האחרים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לבלייק וו על הגהת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, ונאס"א NNX16A069A (JCW), ו 872244 מלגת פוסט-דוקטורט של AHA (GMP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ עם מיקרו-באר 20 מ"מ #1.5 כיסוי זכוכיתCellvisD35-20-1.5-Nמהדק תיקון
50x B27 תוספימזון LifeTechnologies 17504-044hiPSC-CM תרבית בינונית
6 בארות צלחת תרביתE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM תרבית
96 בארות שטוחות שקופות תחתית פוליסטירן שחור מטופלות TC מיקרו-פלטותקורנינג3603מדידת תנועת התכווצות
AccutaseSigma-AldrichA6964דיסוציאציה אנזימטית
הסטודיו המשולב של Axion (AxIS)תוכנת ניווטAxion Biosystems
נימי זכוכית בורוסיליקטמנגנון הרווארדBF 100-50-10,מהדק תיקון
CaCl2 1 M in H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s פתרון
שקופיות תא ספירת תאיםThermoFisher ScientificC10228ספירת תאים
CytoView 48 בארות צלחות MEAAxion BiosystemsM768-tMEA-48B
MEA DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028מטריצה חוץ-תאית
בינונית DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםפישר סיינטיפיק14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889תמיסת פיפטה תוך-תאית
EPC 10 USB  מגבר מהדק תיקוןWarner Instruments89-5000מהדק תיקון
Fura-2, AM, תא מתאים ThermoFisherScientificF1221Ca2+ מדידה חולפת
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270Tyrode' s פתרון
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s solution
hiPSCsמכון הלב וכלי הדם של סטנפורד iPSC ביובנק
KClסיגמא-אולדריץ'529552טירוד s פתרון
החלפת סרום נוקאאוטThermoFisher Scientific10828-028מדיום זריעה hiPSC-CM
KOH 8  MSigma-AldrichP4494תמיסת פיפטה תוך-תאית
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ מדידה חולפת; מקור אור מיתוג אורך גל במהירות גבוהה במיוחד
Luna-FL מונה תאי פלואורסצנטי אוטומטיWISBIOMEDLB-L20001ספירת תאים
Maestro Pro  מערכת MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Growth Factor מופחת (GFR) מטריצת ממברנה בסיסית356231 מדיוםמטריצה חוץ-תאית
MgATPSigma-AldrichA9187תמיסת פיפטה תוך-תאית
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s solution
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s פתרון
NaOH 10  מסיגמא-אולדריץ72068טירוד s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (תמיסה של 20% ב-DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ מדידת חולף
RPMI 1640 mediumLife Technologies11875-119מדיום תרבית hiPSC-CM
Sony SI8000 מערכת הדמיית תנועה של תאיםSony Biotechnologyמדידת תנועה מתכווצת
חולץ מיקרופיפטה סאטרמכשירי סאטרP-97מהדק תיקון
כתם כחול טריפןLife TechnologiesT10282ספירת תאים
'

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216(2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345(2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628(2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859(2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117(2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925(2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662(2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565(2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microelectrode ArrayPatch Clamp RecordingHuman iPSC CardiomyocytesCardiac Safety AssessmentDrug Induced CardiotoxicityCalcium Transient MeasurementField Potential RecordingAction Potential RecordingWhole Cell RecordingCardiac Electrophysiology

Related Articles