פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור פוליזום אאוקריוטי מגושי סויה שלמים. לאחר הריצוף, ניתן להשתמש בצינורות סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים כדי לזהות גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ברמות השעתוק והטרנסלטום.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מטרת פרוטוקול זה היא לספק אסטרטגיה לחקר הטרנסלטום האאוקריוטי של הגולם הסימביוטי של פולי הסויה (גליצין מקס). מאמר זה מתאר שיטות הממוטבות לבידוד פוליריבוזומים שמקורם בצמחים ואת ה-mRNA הקשורים אליהם לניתוח באמצעות ריצוף RNA. ראשית, ליזאטים ציטופלסמיים מתקבלים באמצעות הומוגניזציה בתנאים משמרים פוליזום ורנ"א מגושים שלמים וקפואים של פולי סויה. לאחר מכן, הליזטים מנוקים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, ו-15% מהסופר-נאטנט משמש לבידוד RNA כולל (TOTAL). הליזאט המנוקה הנותר משמש לבידוד פוליזומים על ידי אולטרה-צנטריפוגציה באמצעות כרית סוכרוז דו-שכבתית (12% ו-33.5%). mRNA הקשור לפוליזום (PAR) מטוהר מכדורים פוליסומליים לאחר חידוש. הן TOTAL והן PAR מוערכים על ידי אלקטרופורזה נימית רגישה ביותר כדי לעמוד בתקני האיכות של ספריות ריצוף עבור RNA-seq. כדוגמה ליישום במורד הזרם, לאחר ריצוף, ניתן להשתמש בצינורות סטנדרטיים לניתוח ביטוי גנים כדי לקבל גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי ברמות השעתוק והטרנסלטום. לסיכום, שיטה זו, בשילוב עם RNA-seq, מאפשרת לחקור את הוויסות התרגומי של mRNA אאוקריוטי ברקמה מורכבת כגון הגולם הסימביוטי.
מבוא
צמחים קטניים, כגון סויה (גליצין מקס), יכולים לבסס סימביוזה עם חיידקי אדמה ספציפיים הנקראים ריזוביה. מערכת יחסים הדדית זו מעוררת את היווצרותם של איברים חדשים, הגושים הסימביוטיים, על שורשי הצמח. הגושים הם האיברים הצמחיים המארחים את החיידקים ומורכבים מתאים מארחים שהציטופלסמה שלהם מיושבת עם צורה מיוחדת של ריזוביה הנקראת חיידקים. חיידקים אלה מזרזים את הפחתת החנקן האטמוספרי (N 2) לאמוניה, אשר מועבר לצמח בתמורה לפחמימות 1,2.
אף על פי שסימביוזה זו של קיבוע חנקן היא אחת הסימביוזה בין צמחים למיקרובים הנחקרים ביותר, היבטים רבים עדיין צריכים להיות מובנים טוב יותר, כגון כיצד ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. גידול צמחים וחיסון ריזוביה
- כדי ליצור את הגושים הנדרשים, לזרוע את זרעי סויה של בחירה במצע שנבחר בתא הגידול בתנאים מבוקרים.
הערה: בפרוטוקול זה, זרעים נזרעו בבקבוק פלסטיק 0.5 ליטר מלא בתערובת של חול:ורמיקוליט (1:1). תא הגידול נקבע עם טמפרטורת מחזור יום / לילה של 28 °C (75 °F) / 20 ° C, בהתאמה, ו photoperiod אור / חושך של 16 h / 8 h, בהתאמה. עוצמת הקרינה הפעילה מבחינה פוטוסינתטית הייתה 620 μmol·m−2·s−1. - הכינו מראש תמצית שמרים נוזלית מניטול (YEM)-בינונית (ראו טבלת חומרים). אוטוקלאב את המדיום.
- באותו יום של זריעת זרעים, לחסן בקבוק אחד המכיל 100 מ"ל של YEM עם זן Bradyrhizobium elka....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הערכת הכמות והאיכות של שברים TOTAL ו- PAR המטוהרים באמצעות ההליך הנ"ל היא המפתח לקביעת הצלחתו, שכן עבור רוב היישומים במורד הזרם, כגון ריצוף RNA, דגימות באיכות גבוהה הן בסיסיות להכנת ספרייה וריצוף. יתר על כן, שלמות מולקולות הרנ"א מאפשרת לכידת תמונת מצב של פרופיל ביטוי הגנים ברגע איסוף הדגימה18. בהקשר זה, מספר שלמות RNA (RIN) מתקבל בעת ביצוע מדידות אלה באמצעות Bioanalyzer. ה- RIN משמש להקצאת ערכי תקינות באופן חזק, אמין ובלתי תלוי במשתמש, החל מ- 10 (שלם) ועד 1 (פגום לחלוטין)18.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חקר ויסות ביטוי גנים ברמת התרגום הוא קריטי להבנה טובה יותר של תהליכים ביולוגיים שונים, שכן נקודת הקצה של ביטוי גנים בתאים היא שפע חלבונים13,14. ניתן להעריך זאת על ידי ניתוח הטרנסלטום של הרקמה או האורגניזם המעניין שעבורו יש לטהר את השבר הפוליסומלי ואת ה- mRNAs הקשורים אליו ניתח 3,4,34,35,36.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
מחקר זה מומן על ידי מענק CSIC I+D 2020 מס ' 282, מענק FVF 2017 מס ' 210, ו- PEDECIBA (מריה מרתה סיינז).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>גידול צמחים וחיסון ריזוביה | |||
| שייקר אורביטלי | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (תמצית שמרים) 0122 (מניטול) | |
| <טיפול בגירעון במים> | |||
| KNO3 | Merck | ||
| 221295 מכשיר | פורומטר | דגם SC-1 | |
| אזמל | |||
| <חזק>הכנת תמציות ציטוזוליות | |||
| בריג' L23 | סיגמא-אולדריץ' | P1254 | |
| צנטריפוגה | סיגמא | דגם 2K15 | |
| כלורנפניקול | סיגמא-אולדריץ' | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| מטחנת רקמות פלסטיק | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| צלחת שקילה | Deltalab | 1911103 | |
| <חזק>הכנת כריות סוכרוז | |||
| סוכרוז | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti רוטור | בקמן-קולטר | ||
| אולטרה-צנטריפוגה | בקמן-קולטר | אופטימה L-100K | |
| צינורות אולטרה-צנטריפוגה | בקמן-קולטר | 344059 | צינורות 13.2 מ"ל |
| <חזק>מיצוי RNA ובקרת איכות | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. בדיקת ננו RNA כוללת של Eukaryote | |
| כלורופורם | DI | 41191 | |
| אתנול | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| <חזק>שונות | |||
| שפופרות פלקון 15 מ"ל | Biologix | 10-0152 | |
| טיפים לסינון 10 ומיקרו; L | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| טיפים לסינון 1000 ומיקרו; L | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| טיפים לסינון 20 ומיקרו; L | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| טיפים לסינון 200 ומיקרו; L | Tarsons | 528104 | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל | Tarsons | 500010-N | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל | Tarsons | 500020-N | |
| חברת ריצוף | Macrogen | ||
| Sterile 250 מ"ל בקבוק | Marienfeld | 4110207 |
מקורות
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377(2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legu....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
