מאמר שיטה

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

DOI:

10.3791/64274

⸱

23 ביוני 2023

 , 
1Children’s Mercy Research Institute, Children’s Mercy Kansas City, 2Department of Pediatrics, University of Missouri-Kansas City School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גנים רבים מעודכנים, מעודדים נדידה ופלישה של תאי גידול, מה שמוביל לפרוגנוזה גרועה. קביעה אילו גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול היא קריטית. פרוטוקול זה מציג שיטה לחקר ההשפעות של ביטוי מוגבר של גן על נדידה ופלישה של תאי גידול בזמן אמת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי הגידול הם תנועתיים ופולשניים מאוד ומציגים דפוסי ביטוי גנים משתנים. הידע על האופן שבו שינויים בביטוי גנים מווסתים נדידה ופלישה של תאי גידול חיוני להבנת מנגנוני חדירת תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות וגרורות. בעבר, הוכח כי הפלת גנים ואחריה מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם, מאפשרת לזהות את הגנים הדרושים לנדידת תאי הגידול ולפלישתם. לאחרונה, חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 הגבירו את העניין בשימוש ב- mRNA סינתטי למטרות טיפוליות. כאן, השיטה באמצעות mRNA סינתטי תוקנה כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי יתר של גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מחקר זה מדגים כי ביטוי גנים מוגבר עם טרנספקציה סינתטית של mRNA ואחריו מדידה בזמן אמת מבוססת עכבה עשויים לסייע בזיהוי הגנים המעודדים נדידת תאי גידול ופלישה. נייר שיטה זה מספק פרטים חשובים על ההליכים לבחינת ההשפעה של ביטוי גנים שונה על נדידת תאי הגידול ופלישתם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תנועתיות תאי הגידול ממלאת תפקיד מכריע בגרורות 1,2. התפשטות תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות ומרוחקות מקשה על הטיפול בסרטן ותורמת להישנות 3,4. לכן, חיוני להבין את מנגנוני תנועתיות תאי הגידול ולפתח אסטרטגיות טיפוליות רלוונטיות. מאחר שלתאי גידול רבים יש שינויים בפרופילי ביטוי הגנים, חיוני להבין אילו שינויים בפרופיל ביטוי הגנים מובילים לשינוי בתנועתיות תאי הגידול 5,6.

מספר בדיקות פותחו כדי למדוד נדידת תאים במבחנה. חלק מהבדיקות מספקות מידע מוגבל בלבד מכיוון שהן מאפשרות מדידות רק בנקודות זמן ספציפיות, בעוד שאחרות מציעות מידע מקיף על תנועתיות תאי הגידול בזמן אמת7. למרות שרבים ממבחני תנועתיות התא הללו יכולים לספק תוצאות כמותיות בזמן נתון או בנקודת הקצה, הם אינם מספקים מידע מפורט מספיק על שינויים דינמיים בקצב נדידת התאים במהלך תקופת הניסוי. בנוסף, ייתכן שיהיה קשה לבחון שינויים אפשריים בקצב נדידת התאים בהתאם לתכנון הניסוי, סוגי התאים ומספרי התאים. יתר על כן, ניתן לחקור את ההשפעות של טיפולים לא מסובכים על ידי כימות פשוט של מבחני תנועתיות מסורתיים, אך ייתכן שיהיה צורך בכימות מתוחכם יותר כדי לחקור את ההשפעות המורכבות של טיפולים משולבים שונים8.

פותח מכשיר לניטור הזרם החשמלי של צלחת מיקרוטיטר המכוסה היטב במיקרואלקטרודות9. היצמדות התאים לפני השטח של הבאר מעכבת את זרימת האלקטרונים, והעכבה מתואמת עם הקישור הכמותי והאיכותי של התאים. נוכחות המיקרואלקטרודות על קרקעית הבאר מאפשרת מדידה של הידבקות תאים, התפשטות והתפשטות. נוכחות המיקרואלקטרודות מתחת לקרום מיקרו-נקבובי של החדר העליון מאפשרת מדידה של נדידת תאים ופלישה לתוך החדר התחתון, כאשר החדר העליון מצופה בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) כדי לאפשר פלישה10.

בעבר, הוכח כי מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם מספקות נתונים בזמן אמת במהלך הניסוי כולו, כמו גם השוואות וכימות מיידיות בתנאי ניסוי שונים11. במאמר שיטה זה, הושרה הפלת גנים כדי לבחון את תפקידם של חלבונים בעלי עניין בנדידת תאי גידול ופלישה. מכיוון שאפקט הפלה גנטי מלא בתנאי הניסוי שנבדקו לקח 3-4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם רנ"א מפריע קטן (siRNAs)8, התאים צופו מחדש לאחר האלקטרופורציה ונקצרו מחדש 3 ימים לאחר מכן לצורך מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם.

הרגולטור CT10 של קינאז (Crk) ודמוי Crk (CrkL) הם חלבוני מתאם המתווכים אינטראקציות חלבון-חלבון במורד הזרם של מסלולים שונים של קולטן גורם גדילה קינאז ומסלולים לא קולטנים טירוזין קינאז12. רמות גבוהות של חלבוני Crk ו-CrkL תורמות לפרוגנוזה גרועה במספר סוגי סרטן בבני אדם, כולל גליובלסטומה13. עם זאת, לא ברור כיצד חלבוני Crk ו-CrkL גבוהים מובילים לפרוגנוזה גרועה. לכן, חשוב להגדיר את ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על תפקודי תאי הגידול. בעבר, בוצע מחקר הפלה גנטית כדי להדגים כי רמות אנדוגניות של חלבוני Crk ו- CrkL נדרשות עבור נדידת תאי גליובלסטומה ופלישה8. כאן, פותחה מערכת בדיקה שונה כדי להתמודד עם ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על נדידת תאי הגידול ופלישה.

לאחרונה, הסינתזה במבחנה של mRNA ויישומיו הטיפוליים משכו תשומת לב מחודשת עקב פיתוח חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 (נסקר על ידי Verbeke et al.14). בנוסף, התקדמות יוצאת דופן נעשתה בשימוש mRNA סינתטי בסרטן ומחלות אחרות15,16. אלקטרופורציה של תאים היא שיטה יעילה להעברת mRNA סינתטי ולהשראת שינוי גנטי חולף (נבדק על ידי Campillo-Davo et al.17), והשימוש ב-mRNA סינתטי מאפשר ביטוי גנים מהיר ויעיל בפיברובלסטים אימורטליים18. מאמר שיטה זה משלב ביטוי יתר של גנים באמצעות mRNA סינתטי עם אנליזות תאים בזמן אמת כדי לחקור נדידה ופלישה של תאי גידול. עם זאת, סכמת הניסוי המשמשת עבור siRNA אינה פועלת עם transfection mRNA סינתטי, כמו רמת חלבונים אקסוגניים עולה במהירות ויורדת בהדרגה עם transfection mRNA סינתטי18. לכן, השיטה שונתה כדי לבצע ניתוח בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה מיד לאחר transfection מבלי בנוסף תרבית את התאים.

מאמר שיטה זה מדגים כי שילוב מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת עם טרנספקציה של תאי גידול עם mRNA סינתטי מספק ניתוח מהיר ומקיף של ההשפעות של upregulation גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מאמר שיטה זה מתאר נהלים מפורטים למדידת האופן שבו הגירה ופלישה של תאי גליובלסטומה מושפעים מביטוי יתר של Crk ו- CrkL. על ידי בחינת ההשפעות תלויות הריכוז של mRNA סינתטי על נדידת תאי גידול, המאמר מתאר בבירור כיצד עלייה ברמות החלבון מעודדת נדידת תאי גידול. בנוסף, מוצגת גישה של שינוי ריכוז ג'ל ECM כדי להעריך את ההשפעות של שינויים בביטוי גנים על פלישת תאי גידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של mRNA

הערה: עבור סינתזת mRNA, כל הריאגנטים והציוד חייבים להיות מטופלים במיוחד כדי להשבית את RNases לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. ליניאריזציה של DNA
    הערה: cDNA עכברי של CrkI ו- CrkL שוכפלו לווקטור הביטוי pFLAG-CMV-5a כדי להוסיף את תג האפיטופ FLAG במסוף C ושכפלו לווקטור pcDNA3.1/myc-His כדי לשלב את מקדם T7, כפי שתואר קודם לכן 18,19.
    1. הוסף 10 μL של חיץ תגובה 10x, 1.5 μL של PmeI (10,000 יחידות / מ"ל), ו 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לצינור מיקרוצנטריפוגה כדי ליניאריזציה של DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -100 μL.
    2. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
    3. יש לסחרור, ולהוסיף 5 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו-1 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל, דרגת RNA) לתערובת התגובה. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור בטמפרטורה של 50°C למשך 30 דקות.
    4. מתחת למכסה המנוע, הוסף 100 μL של השלב התחתון של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל לתערובת תגובת פלסמיד למיצוי. מערבולת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 18,800 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את השלב העליון לצינור חדש.
    5. חזור על שלב 1.1.4 עם כלורופורם:אלכוהול איזואמיל בשעה 24:1.
    6. בצינור החדש, להביא את נפח התגובה ל 300 μL על ידי הוספת 200 μL של מים ללא nuclease, ולאחר מכן להוסיף 30 μL של 3 M נתרן אצטט ו 600 μL של 100% אתנול.
    7. מערבבים על ידי מערבולת, ולאחר מכן מניחים ב -20 ° C למשך 30-60 דקות עבור משקעים אתנול של ה- DNA.
    8. צנטריפוגה ב 18,800 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין.
    9. יבש עם מכסה פתוח במשך 2 דקות, להוסיף 30 μL של מים ללא nuclease, ולהשהות מחדש את גלולת DNA.
    10. קבע את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
    11. אמת את הגודל והכמות של ה- DNA הליניארי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
  2. סינתזת RNA באמצעות T7 RNA פולימראז
    1. הוסף 2 μL כל אחד של 10x מאגר שעתוק, ATP, GTP, UTP, CTP ו- T7 ו- 1 מיקרוגרם של DNA ליניארי לצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -20 μL.
    2. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים לסינתזה של RNA.
    3. יש לסובב כלפי מטה, להוסיף 1 μL של DNase (2 U/μL), ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות כדי להסיר את הדנ"א של התבנית.
  3. משקעים ליתיום כלורי של RNA
    1. הוסף 10 μL של ליתיום כלורי (7.5 M) לתערובת התגובה. ערבבו על ידי הקשה, סחררו כלפי מטה ודגרו על תערובת התגובה בטמפרטורה של -20°C למשך 30 דקות.
    2. צנטריפוגה ב-18,800 × גרם למשך 20 דקות ב-4°C, יש להשליך את הסופרנטנט ולשטוף את הגלולה ב-500 μL של 70% אתנול. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין.
    3. יבש עם מכסה פתוח במשך 2 דקות, להוסיף 30 μL של מים ללא nuclease, ולהשהות מחדש את גלולת RNA.
  4. מכסה
    1. חממו את דגימת הרנ"א בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו אותה על קרח לקירור.
    2. הוסף 5 μL כל אחד של 10x capping buffer, 10 mM GTP ו-1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM), 2 μL כל אחד של תערובת אנזימי מכסה ותערובת אנזימים O-methyltransferase, ו-1.25 μL של מעכב RNase. יש לערבב על-ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
  5. זנב Poly(A)
    1. סובב את הדגימה ולאחר מכן הוסף 6 μL של מים נטולי nuclease, 20 μL של 5x E-PAP buffer, 10 μL של 25 mM MnCl2, 10 μL של 10 mM ATP, ו 4 μL של E-PAP poly(A) אנזים זנב. יש לערבב על-ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.
  6. משקעי ליתיום כלורי וכימות ה-mRNA הסינתטי
    1. הוסף 50 μL של ליתיום כלורי (7.5 M), ובצע משקעים ליתיום כלורי כמתואר בשלבים 1.3.1-1.3.3.
    2. למדוד את ריכוז ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
    3. ודא את הגודל והכמות של mRNA באמצעות פורמלדהיד (1%-2%) אגרוז (1%) אלקטרופורזה בג'ל.

2. ציפוי ג'ל מטריצה חוץ-תאית (ECM) של לוחות הפלישה והנדידה של התא (CIM)

הערה: לוח פלישה ונדידת תאים (CIM) הוא לוח 16 בארות המיוצר באופן מסחרי לניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה. עבור בדיקת הפלישה לתאים, לצפות לוחות CIM עם ג'ל ECM, כפי שתואר קודם אבל עם כמה שינויים11.

  1. הסר aliquot של ציר ג'ל ECM מהמקפיא ולשמור אותו על קרח.
  2. לדלל את ג'ל ECM (10 מ"ג / מ"ל) לריכוז עבודה (100 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי ערבוב 990 μL של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) (ללא סרום או אנטיביוטיקה) עם 10 μL של ג'ל ECM בצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבבים על ידי פיפטינג עדין.
  3. הוסף 60 μL של ג'ל ECM מדולל לכל אחת מ -16 הבארות של החדר העליון של צלחת CIM. יש ליישם את שיטת הצנרת ההפוכה תוך הימנעות מבועות אוויר20,21.
    הערה: מטב את ריכוז ג'ל ECM עבור כל קו תאים. עבור קווי תאי גליובלסטומה, 0.1 מיקרוגרם / μL עד 1 מיקרוגרם / μL ג'ל ECM שימש לאופטימיזציה.
  4. הניחו את החדר העליון של צלחת CIM עם כיסוי הצלחת על יריעת פלסטיק מגנה בתוך אינקובטור CO2 למשך כ-4 שעות ליצירת שכבת ג'ל.
    זהירות: במהלך ציפוי צלחת CIM בג'ל ECM, האלקטרודות של החדר העליון של צלחת CIM לא אמורות להיות במגע ישיר עם ידיו של הנסיין או עם משטחי הציוד, כולל ארון הבטיחות הביולוגית או אינקובטור CO2 .

3. הכנת תאי הגידול

הערה: כל חומרי תרבית התאים חייבים להישמר סטריליים. קצור וחשמל את תאי הגידול תחת ארון בטיחות ביולוגי עם ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כפי שתואר קודם לכן אך עם כמה שינויים11.

  1. תרבית תאי הגידול
    1. תרבית תאי U-118MG ב-10 מ"ל DMEM המכילים 5% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה לכל צלחת תרבית רקמת פוליסטירן בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ ב-37°C באינקובטור 5% CO2 (מצב תרבית).
  2. דלדול בסרום של תאי הגידול
    הערה: יש למזער את החשיפה של התאים לכימואטרקנטים הנמצאים ב- FBS לפני נדידת התאים ומבחני הפלישה באמצעות ריכוז גבוה של FBS.
    1. הסר את המדיום הישן, והוסף 10 מ"ל של DMEM שחומם מראש המכיל 0.5% FBS ו 1% אנטיביוטיקה לכל צלחת (בינוני בסרום נמוך).
    2. חזור על שלב 3.2.1.
    3. לדגור על התאים ב 37 ° C ב 5% CO2 אינקובטור במשך 4 שעות או יותר.
  3. קצירת תאי הגידול
    1. הסר את התווך הישן, הוסף 8 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) שחומם מראש לכל מנה, הסר את DPBS, הוסף 0.05% טריפסין-EDTA שחומם מראש (2 מ"ל לצלחת) כדי לכסות את פני השטח, ודגר באינקובטור CO2 במשך 30 שניות.
    2. שאפו בזהירות את הטריפסין-EDTA, הוסיפו מדיום נמוך בסרום (7 מ"ל/צלחת), ולאחר מכן אספו תאים לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל או 15 מ"ל.
    3. Aliquot נפח קטן של תאים, ולהשתמש מונה תאים אוטומטי כף יד כדי לספור את התאים.
    4. חשב את מספר התאים הכולל ואת הנפח הדרוש עבור 10,000 תאים/μL.
    5. סובב את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 100 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוף את supernatant, להוסיף את נפח מחושב של DMEM המכיל 0.5% FBS (ללא אנטיביוטיקה), ובעדינות להשעות מחדש את גלולת התא.
    6. מעבירים 110 μL של תרחיף התא, המכיל 1.1 מיליון תאים, לצינור מיקרוצנטריפוגה לכל טיפול.
    7. חזור על שלב 3.3.6 כדי להעביר את התאים לארבע צינורות מיקרוצנטריפוגות עבור ארבעה טיפולים שונים.
      הערה: צלחת CIM יש בסך הכל 16 בארות. תכנן ארבעה טיפולים שונים להשוואה, כך שניתן יהיה להקצות ארבע בארות של צלחת CIM לכל טיפול. השתמש בתאים המחושלים לניסויים הבאים: ניתוחי כתמים מערביים (0.3 מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמה של 35 מ"מ), ארבע בארות של מבחני נדידת תאים בזמן אמת (0.1 מיליון תאים / באר), וארבע בארות של מבחני פלישת תאים בזמן אמת (0.1 מיליון תאים / באר) עבור כל טיפול. התאם את מספר התאים שיש לחשמל אם תכנון הניסוי משתנה.

4. אלקטרופורציה של תאי הגידול

  1. כדי להסיר את התווך, הוסף 1 מ"ל של DPBS לתרחיף התא בכל צינור, סובב את תרחיף התא שלוש פעמים במשך 10 שניות בכל פעם תוך סיבוב הצינור 180° כל 10 שניות באמצעות מיני צנטריפוגה, והסר את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה.
    הערה: חשוב ליצור כדורית תא קומפקטית אך ניתנת להשעיה בקלות.
  2. הוסף 110 μL של חיץ תרחיף R לגלולת התא כדי לקבל 0.1 מיליון תאים ב 10 μL.
  3. הוסף mRNA סינתטי לכדורית התא כדי לקבל ריכוז של 0.2-20 ng/μL בהתאם לרמת הביטוי הרצויה. ערבבו והשהו מחדש את כדורית התא בעדינות על ידי הקשה או פיפטינג עדין.
    הערה: השתמש בריכוזים שונים של mRNA סינתטי, בחן את ביטוי החלבון באמצעות ניתוח כתמים מערביים, וקבע את ריכוז ה- mRNA הסינתטי המוביל לרמת הביטוי הרצויה על מנת לחקור את הקשר הספציפי בין ביטוי החלבון לבין ההשפעות הביולוגיות.
  4. אלקטרופורטאט 10 μL של תרחיף התא עם מערכת אלקטרופורציה ב 1,350 V למשך 10 אלפיות השנייה עם שלוש פעימות בכל פעם.
  5. העבר את התאים המחושלים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש עם 1.1 מ"ל DMEM המכיל 0.5% FBS.
  6. חזור על האלקטרופורציה עד ששאר תרחיף התא מתחשמל. שלב את התאים המחושלים בצינור המיקרוצנטריפוגה כדי לקבל 1.1 מיליון תאים ב -1.1 מ"ל.
    הערה: ניתן להשתמש בקצוות אלקטרופורציה של 100 μL ו- 10 μL כדי לחשמל נפח גדול של תאים, אך עצות האלקטרופורציה עבור 10 μL ו- 100 μL כלולות בשתי ערכות נפרדות ויש לרכוש אותן בנפרד. חיץ המתלים R כלול בשתי הערכות.
  7. עם השלמת כל האלקטרופורציות המתאימות, השהה מחדש בעדינות את התאים המאוגרים.
  8. צלחת 0.3 מיליון תאים בצלחת תרבית רקמת פוליסטירן 35 מ"מ x 10 מ"מ עם 2 מ"ל DMEM המכיל 5% FBS, ותרבית את התאים במשך יום אחד בתנאי התרבית להכנת ליזט התא הכולל וניתוח כתמים מערביים.
  9. שמור את שאר התאים המתחשמלים בטמפרטורת החדר עד שמערכת ניתוח התאים בזמן אמת תהיה מוכנה.

5. הגדרת מנתח התאים בזמן אמת, התוכנית ולוחות CIM

הערה: הכן את מנתח התאים בזמן אמת ושני לוחות CIM, כמתוארלעיל 11.

  1. שיווי משקל של מנתח תאים בזמן אמת
    1. העבר את מנתח התאים בזמן אמת לאינקובטורCO2 מספר שעות לפני השימוש כדי לאזן את המערכת בתנאי התרבית.
  2. הגדרת תוכנית הניתוח
    1. פתח את תוכנית הניתוח על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת ניתוח התאים בזמן אמת בשולחן העבודה.
    2. לאחר שהאפשרות Default Experiment Pattern Setup פתוחה, בחר באפשרות להפעלת שלושה ניסויים בנפרד.
      הערה: לכל עריסה יש חלון נפרד. ישנן כרטיסיות שונות להגדרת מרווח המדידה ומשך, ניתוח נתונים ותנאי ניסוי אחרים.
    3. פתח כל עריסה על ידי לחיצה על הכרטיסייה מספר .
    4. לחץ על הכרטיסייה הערות ניסוי , בחר את התיקיה שבה הנתונים יישמרו והזן את שם הניסוי.
    5. לחץ על הכרטיסייה פריסה , הגדר בארות מרובעות עבור כל תנאי טיפול על ידי בחירת ארבע בארות בכל פעם והזנת פרטי הדגימה ולאחר מכן לחץ על החל.
    6. לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים | הוסף שלב כדי להגדיר את המצב הדו-שלבי של מדידות עכבת התא. לאחר מכן, לחץ על החל כדי להגדיר את הצעד הראשון.
    7. לחץ על הוסף שלב שוב, הזן 10 דקות עבור מרווח הזמן ו 48 שעות עבור משך עבור הגירה ופלישה, ולחץ על החל כדי להגדיר את השלב השני.
      הערה: השלב הראשון כולל מדידה חד-פעמית של קו הבסיס (טאטוא אחד במרווח של דקה). השלב השני מודד את עכבת התא עבור הניסוי (לדוגמה, 289 טאטוא עם מרווח של 10 דקות במשך 48 שעות) בעריסה. התאם את המרווח ומשך הזמן בהתאם לתכנון הניסוי.
    8. עבור לעריסה הבאה והגדר אותה על-ידי חזרה על שלבים 5.2.3-5.2.7.
  3. הכנת לוחות CIM
    1. שעה לפני תחילת מדידת עכבת התא, מלא את הבארות של החדר התחתון של צלחת CIM עם 160 μL של DMEM המכיל 10% סרום או chemoattractants אחרים.
    2. הרכיבו את החדר העליון המכיל את הבארות מצופות הג'ל ECM (לפלישה) או בארות לא מצופות (להגירה) עם החדר התחתון.
    3. הוסף 50 μL של מדיום נמוך בסרום לבארות של החדר העליון של צלחת CIM עבור בדיקת נדידת תאים, ומקם את צלחת CIM בעריסה של המערכת.
    4. לחץ על הכרטיסייה הודעה וודא שההודעה חיבורים בסדר מוצגת. לוח CIM מוכן כעת לניסוי.
    5. דגרו מראש על צלחת CIM שהורכבה באינקובטור CO2 למשך 30-60 דקות לפני ניתוח התאים בזמן אמת כדי להתאים את צלחת CIM למצב התרבית.

6. ניתוח תאים בזמן אמת וייצוא נתונים

הערה: בצע קריאה בסיסית, זריעת תאים, מדידת עכבת תאים וייצוא נתונים כמתוארלעיל 11.

  1. קריאה בסיסית
    הערה: יש לקרוא את קו הבסיס לאחר התאקלמות לוח CIM ולפני הוספת התאים לבארות החדר העליון.
    1. לחץ על לחצן התחל עבור כל עריסה. כשהחלון Save As מופיע, שמור את הקובץ הניסיוני כדי לבצע את הקריאה הבסיסית.
  2. זריעת תאים
    1. הסר את צלחת CIM מהעריסה והנח אותה בארון הבטיחות הביולוגית על מחזיק הצלחת.
    2. הוסף 100 μL (המכיל 100,000 תאים) של תאים מחושמלים לבארות של החדר העליון של לוח CIM בהתאם לתוכנית ביחידת הבקרה. יש ליישם את שיטת הפיטינג ההפוך תוך הימנעות מבועות אוויר.
    3. השאירו את צלחת CIM מתחת לארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לוודא שהתאים מתפשטים באופן שווה על קרקעית הבאר.
  3. מדידת עכבת תאים
    1. העבר את צלחת CIM שהורכבה במלואה בחזרה לעריסה המתאימה. לחץ על לחצן התחל העריסה כדי להתחיל את מדידת עכבת התא לשלב השני.
    2. לחץ על הכרטיסייה מגרש ולאחר מכן לחץ על הלחצן הוסף הכל ובחר בתיבות ממוצע ו - STD DEV כדי להציג את הנתונים באופן חזותי בזמן אמת.
      הערה: אפשרות ברירת המחדל להתוויה היא Time עבור ציר x ואינדקס תאים עבור ציר y. המקטע 'בחירת התווייה ' מאפשר למשתמש לבחור אפשרויות חלופיות לציר y: אינדקס תאים מנורמל או אינדקס תא דלתא. לאחר ביצוע הטאטוא הסופי, הניסוי הושלם, והתוצאות נשמרות באופן אוטומטי.
  4. ייצוא הנתונים לניתוח
    1. לחץ על הכרטיסייה מגרש ובחר את התיבות ממוצע ו - STD DEV כדי להעתיק את הנתונים עבור כל באר בנפרד.
    2. לחץ לחיצה ימנית על אזור ההתווייה ובחר העתק נתונים בתבנית רשימה.
    3. פתח קובץ גיליון אלקטרוני ריק, הדבק את הנתונים ולאחר מכן שמור את הקובץ.
    4. חזור לתוכנית הניתוח, לחץ על הכרטיסייה צלחת עבור כל עריסה ובחר שחרור כדי לסגור את הניסוי עבור העריסה.
    5. חזור לקובץ הגיליון האלקטרוני והתאם את זמן הנתונים הגולמיים כך ששעת ההתחלה בשלב השני תהפוך לשעת ההתחלה בפועל של המדידה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני Crk ו-CrkL ממלאים תפקידים חשובים בתנועתיות של סוגי תאים רבים, כולל תאי עצב22, תאי T23, פיברובלסטים 18,19 ומגוון תאי גידול13. מאחר שחלבוני Crk ו-CrkL דווחו כבעלי רמות גבוהות בגליובלסטומה24,25,26, נחקרו במחקר זה ההשפעות של ביטוי יתר של CrkI, גרסה של Crk, על נדידת תאי גליובלסטומה. תאי U-118MG עבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגירה ופלישה הן תכונות חשובות של תאי גידול. מדידת התנועתיות של תאי הגידול והבנת המנגנון הבסיסי השולט בתנועתיות תאי הגידול מספקים תובנות קריטיות לגבי התערבויות טיפוליות 2,27. מספר שיטות פותחו לחקר נדידת תאים7. בדיקת ריפוי פצעים באמצעות שריטות או תוספות תרבית היא שיטה פשוטה ונפוצה המספקת תמונות מנוגדות של סגירת רווח. בדיקת המעקב אחר תאים בודדים דורשת ניטור של תאים בודדים באמצעות דימות בהילוך מהיר, שעבורו ניתן לתייג את התאים בצבעים פלואורסצנט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים למרכז לכתיבה רפואית ב-Children's Mercy Kansas City על עריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי קרן A.R.T. של נטלי (ל- T.P.) ועל ידי מענק המועצה המייעצת של MCA Partners מבית החולים Children's Mercy Hospital (CMH) ומרכז הסרטן של אוניברסיטת קנזס (KUCC) (ל- T.P).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AlphaImager HPProteinSimple92-13823-00מערכת הדמיית ג'ל
אגרוז ונוגדני אלפא;-טובוליןSigmaT9026משמש לאיתור חלבון אלפא;-טובולין (דילול 1:3,000)
CIM-plate 16Agilent Technologies, Inc5665825001פלישת תאים ולוחות נדידה
CrkBD Biosciences610035משמש לזיהוי חלבוני CrkI ו-CrkII (דילול 1:1,500)
נוגדן CrkLסנטה קרוזsc-319משמש לזיהוי חלבון CrkL (דילול 1:1,500)
Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)ATCC302002מדיום תרבית תאים
תמיסת מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbeccoקורנינג21-031-CVמאגר המשמש לשטיפת תאים
סרום בקר עוברי (FBS)HycloneSH30910.03תוסף תרבית בינוני
חממת CO2 Heracell VIOS 160i חממת CO2Thermo Scientific51030285
IRDye 800CW עז נוגדן משני IgG נגד עכברLi-Cor926-32210נוגדן משני לניתוח כתמים מערביים (דילול 1:10,000)
IRDye 800CW נוגדן עז נגד ארנב IgG נוגדן משניLi-Cor926-32211נוגדן משני לניתוח כתמים מערביים  (דילול 1:10,000)
ליתיום כלוריד InvitrogenAM9480משמש למשקעי RNA
מטריצת מטריג'לג'ל קורנינג354234מטריצה חוץ-תאית (ECM)
ערכת שעתוק MEGAscript T7InvitrogenAM1334משמש לסינתזה
RNA סמני RNA מילניוםInvitrogenAM7150משמש לאלקטרופורזה של ג'ל פורמלדהיד אגרוז
מיני צנטריפוגהISC BioExpressC1301P-ISCמשמש לסובב תאים מוח
עכבר QUICK-Clone cDNATaKaRa637301מקור גנים (תוספות) לשיבוט
כימות חומצות גרעיןNanoQuantTecanM200PRO
מערכת אלקטרופורציה ניאון ThermoFisher ScientificMPK5000מערכת אלקטרופורציה 1
מערכת טרנספקציה ניאון 10 ומיקרו; ערכת LThermoFisher ScientificMPK1025ערכת אלקטרופורציה
מערכת טרנספקציה ניאון 100 ומיקרו; ערכת LThermoFisher ScientificMPK10096 ערכת אלקטרופורציה
מאגר ג'ל דנטורציה NorthernMaxInvitrogenAM8676משמש לאלקטרופורזה של ג'ל פורמלדהיד אגרוז
NorthernMax צבע עומס פורמלדהידInvitrogenAM8552משמש לאלקטרופורזה של ג'ל פורמלדהיד אגרוז
NorthernMax מאגר ריצהInvitrogenAM8671משמש לפורמלדהיד אגרוז ג'ל אלקטרופורזה
מים נטולי נוקלאזTeknovaW3331משמש לתגובות שונות במהלך סינתזת mRNA
Odyssey CLx ImagerLi-CorImager לניתוח כתמים מערביים
pcDNA3.1/myc-HisInvitrogenV80020הווקטור שלתוכו שובטו תוספות (עכבר CrkI ו-CrkL cDNAs)
pFLAG-CMV-5aMillipore SigmaE7523מקור תג האפיטופ FLAG
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל SigmaP2069משמש למיצוי DNA
PmeINew England BioLabsR0560Lמשמש לליניאריזציה של הפלסמידים לסינתזה של mRNA
ערכת זנב פולי (A)InvitrogenAM1350משמש לתגובת זנב פולי (A)
צלחת תרבית רקמת פוליסטירן (סגנון 100 x 20 מ"מ)קורנינג353003משמש לתרבית תאים לפני טרנספקציה
צלחת תרבית רקמת פוליסטירן (סגנון 35 x 10 מ"מ)קורנינג353001משמש לתרבית תאים שעברו טרנספטציה
Proteinase KInvitrogen25530049משמש להסרת חלבון בתערובת התגובה
Purifier Axiom Class II, Type C1Labconco Corporation304410001ארון בטיחות ביולוגית לטיפול סטרילי בתאים
מאגר השעיה RThermoFisher Scientificחיץ כלול בערכות האלקטרופורציה, MPK1025 ו-MPK10096. המאגר משמש לחידוש תאים לפני אלקטרופורציה, והרכבו הוא מידע קנייני.
RNaseZapInvitrogenAM9780פתרון טיהור RNA
שרביטMilliporeC85360מונה תאים אוטומטי כף יד 
ערכת ScriptCap 2'-O-methyltransferaseCellscriptC-SCMT0625משמשת למכסת תגובת
ScriptCap m7G מערכת מכסהCellscriptC-SCCE0625משמשת לתגובת
מכסה תמיסת נתרן דודציל סולפטInvitrogen15553-035חומר ניקוי המשמש לתגובת פרוטאינאז K
צנטריפוגה Sorvall Legend XTThermo Scientific75004532צנטריפוגה ספסלית לסיבוב תאים
Trypsin-EDTAGibco25300-054משמש לדיסוציאציה של תאים
U-118MG ATCCHTB15קו תאים דבק שמקורו בחולה גליובלסטומה אנושי
נוגדן VinculinSigmaV9131המשמש לזיהוי חלבון וינקולין (דילול 1:100,000)
xCELLigence RTCA DPAgilent Technologies, Inc380601050מכשיר המשמש לניתוח
תאים בזמן אמת1פרמטרים של אלקטרופורציה ומידע קשור אחר עבור קווי תאים שונים זמינים בדף הבית של היצרן (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).
נוגדן של מערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
  2. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  3. Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92(2020).
  4. Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
  5. Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
  6. Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
  7. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  8. Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390(2021).
  9. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
  10. Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536(2012).
  11. Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997(2020).
  12. Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
  13. Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739(2021).
  14. Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
  15. Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52(2021).
  16. Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
  17. Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396(2021).
  18. Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
  19. Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
  20. Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958(1984).
  21. Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
  22. Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
  23. Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
  24. Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
  25. Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
  26. Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
  27. Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
  28. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
  29. Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
  30. Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
  31. Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
  32. Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422(2022).
  33. Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
  34. Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
  35. Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
  36. Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
  37. Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
  38. Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ECM

מאמרים קשורים