מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

תנועתיות תאי הגידול ממלאת תפקיד מכריע בגרורות ^1,2. התפשטות תאי הגידול לרקמות בריאות שכנות ומרוחקות מקשה על הטיפול בסרטן ותורמת להישנות ^3,4. לכן, חיוני להבין את מנגנוני תנועתיות תאי הגידול ולפתח אסטרטגיות טיפוליות רלוונטיות. מאחר שלתאי גידול רבים יש שינויים בפרופילי ביטוי הגנים, חיוני להבין אילו שינויים בפרופיל ביטוי הגנים מובילים לשינוי בתנועתיות תאי הגידול ^5,6.

מספר בדיקות פותחו כדי למדוד נדידת תאים במבחנה. חלק מהבדיקות מספקות מידע מוגבל בלבד מכיוון שהן מאפשרות מדידות רק בנקודות זמן ספציפיות, בעוד שאחרות מציעות מידע מקיף על תנועתיות תאי הגידול בזמן אמת⁷. למרות שרבים ממבחני תנועתיות התא הללו יכולים לספק תוצאות כמותיות בזמן נתון או בנקודת הקצה, הם אינם מספקים מידע מפורט מספיק על שינויים דינמיים בקצב נדידת התאים במהלך תקופת הניסוי. בנוסף, ייתכן שיהיה קשה לבחון שינויים אפשריים בקצב נדידת התאים בהתאם לתכנון הניסוי, סוגי התאים ומספרי התאים. יתר על כן, ניתן לחקור את ההשפעות של טיפולים לא מסובכים על ידי כימות פשוט של מבחני תנועתיות מסורתיים, אך ייתכן שיהיה צורך בכימות מתוחכם יותר כדי לחקור את ההשפעות המורכבות של טיפולים משולבים שונים⁸.

פותח מכשיר לניטור הזרם החשמלי של צלחת מיקרוטיטר המכוסה היטב במיקרואלקטרודות⁹. היצמדות התאים לפני השטח של הבאר מעכבת את זרימת האלקטרונים, והעכבה מתואמת עם הקישור הכמותי והאיכותי של התאים. נוכחות המיקרואלקטרודות על קרקעית הבאר מאפשרת מדידה של הידבקות תאים, התפשטות והתפשטות. נוכחות המיקרואלקטרודות מתחת לקרום מיקרו-נקבובי של החדר העליון מאפשרת מדידה של נדידת תאים ופלישה לתוך החדר התחתון, כאשר החדר העליון מצופה בחלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) כדי לאפשר פלישה¹⁰.

בעבר, הוכח כי מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם מספקות נתונים בזמן אמת במהלך הניסוי כולו, כמו גם השוואות וכימות מיידיות בתנאי ניסוי שונים¹¹. במאמר שיטה זה, הושרה הפלת גנים כדי לבחון את תפקידם של חלבונים בעלי עניין בנדידת תאי גידול ופלישה. מכיוון שאפקט הפלה גנטי מלא בתנאי הניסוי שנבדקו לקח 3-4 ימים לאחר אלקטרופורציה עם רנ"א מפריע קטן (siRNAs)⁸, התאים צופו מחדש לאחר האלקטרופורציה ונקצרו מחדש 3 ימים לאחר מכן לצורך מדידה מבוססת עכבה בזמן אמת של נדידת תאי הגידול ופלישתם.

הרגולטור CT10 של קינאז (Crk) ודמוי Crk (CrkL) הם חלבוני מתאם המתווכים אינטראקציות חלבון-חלבון במורד הזרם של מסלולים שונים של קולטן גורם גדילה קינאז ומסלולים לא קולטנים טירוזין קינאז¹². רמות גבוהות של חלבוני Crk ו-CrkL תורמות לפרוגנוזה גרועה במספר סוגי סרטן בבני אדם, כולל גליובלסטומה¹³. עם זאת, לא ברור כיצד חלבוני Crk ו-CrkL גבוהים מובילים לפרוגנוזה גרועה. לכן, חשוב להגדיר את ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על תפקודי תאי הגידול. בעבר, בוצע מחקר הפלה גנטית כדי להדגים כי רמות אנדוגניות של חלבוני Crk ו- CrkL נדרשות עבור נדידת תאי גליובלסטומה ופלישה⁸. כאן, פותחה מערכת בדיקה שונה כדי להתמודד עם ההשפעה של ביטוי יתר Crk ו- CrkL על נדידת תאי הגידול ופלישה.

לאחרונה, הסינתזה במבחנה של mRNA ויישומיו הטיפוליים משכו תשומת לב מחודשת עקב פיתוח חיסוני mRNA נגד SARS-CoV-2 (נסקר על ידי Verbeke et ^al.14). בנוסף, התקדמות יוצאת דופן נעשתה בשימוש mRNA סינתטי בסרטן ומחלות אחרות^15,16. אלקטרופורציה של תאים היא שיטה יעילה להעברת mRNA סינתטי ולהשראת שינוי גנטי חולף (נבדק על ידי Campillo-Davo et al.17), והשימוש ב-mRNA סינתטי מאפשר ביטוי גנים מהיר ויעיל בפיברובלסטים אימורטליים¹⁸. מאמר שיטה זה משלב ביטוי יתר של גנים באמצעות mRNA סינתטי עם אנליזות תאים בזמן אמת כדי לחקור נדידה ופלישה של תאי גידול. עם זאת, סכמת הניסוי המשמשת עבור siRNA אינה פועלת עם transfection mRNA סינתטי, כמו רמת חלבונים אקסוגניים עולה במהירות ויורדת בהדרגה עם transfection mRNA סינתטי¹⁸. לכן, השיטה שונתה כדי לבצע ניתוח בזמן אמת של נדידת תאים ופלישה מיד לאחר transfection מבלי בנוסף תרבית את התאים.

מאמר שיטה זה מדגים כי שילוב מדידות מבוססות עכבה בזמן אמת עם טרנספקציה של תאי גידול עם mRNA סינתטי מספק ניתוח מהיר ומקיף של ההשפעות של upregulation גנים על נדידת תאי הגידול ופלישה. מאמר שיטה זה מתאר נהלים מפורטים למדידת האופן שבו הגירה ופלישה של תאי גליובלסטומה מושפעים מביטוי יתר של Crk ו- CrkL. על ידי בחינת ההשפעות תלויות הריכוז של mRNA סינתטי על נדידת תאי גידול, המאמר מתאר בבירור כיצד עלייה ברמות החלבון מעודדת נדידת תאי גידול. בנוסף, מוצגת גישה של שינוי ריכוז ג'ל ECM כדי להעריך את ההשפעות של שינויים בביטוי גנים על פלישת תאי גידול.

1. סינתזה של mRNA

הערה: עבור סינתזת mRNA, כל הריאגנטים והציוד חייבים להיות מטופלים במיוחד כדי להשבית את RNases לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. ליניאריזציה של DNA
   הערה: cDNA עכברי של CrkI ו- CrkL שוכפלו לווקטור הביטוי pFLAG-CMV-5a כדי להוסיף את תג האפיטופ FLAG במסוף C ושכפלו לווקטור pcDNA3.1/myc-His כדי לשלב את מקדם T7, כפי שתואר קודם לכן ^18,19.
   1. הוסף 10 μL של חיץ תגובה 10x, 1.5 μL של PmeI (10,000 יחידות / מ"ל), ו 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לצינור מיקרוצנטריפוגה כדי ליניאריזציה של DNA פלסמיד עם אנזים הגבלה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -100 μL.
   2. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה.
   3. יש לסחרור, ולהוסיף 5 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) ו-1 μL של פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל, דרגת RNA) לתערובת התגובה. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור בטמפרטורה של 50°C למשך 30 דקות.
   4. מתחת למכסה המנוע, הוסף 100 μL של השלב התחתון של פנול:כלורופורם:אלכוהול איזואמיל לתערובת תגובת פלסמיד למיצוי. מערבולת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 18,800 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את השלב העליון לצינור חדש.
   5. חזור על שלב 1.1.4 עם כלורופורם:אלכוהול איזואמיל בשעה 24:1.
   6. בצינור החדש, להביא את נפח התגובה ל 300 μL על ידי הוספת 200 μL של מים ללא nuclease, ולאחר מכן להוסיף 30 μL של 3 M נתרן אצטט ו 600 μL של 100% אתנול.
   7. מערבבים על ידי מערבולת, ולאחר מכן מניחים ב -20 ° C למשך 30-60 דקות עבור משקעים אתנול של ה- DNA.
   8. צנטריפוגה ב 18,800 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של 70% אתנול. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין.
   9. יבש עם מכסה פתוח במשך 2 דקות, להוסיף 30 μL של מים ללא nuclease, ולהשהות מחדש את גלולת DNA.
   10. קבע את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
   11. אמת את הגודל והכמות של ה- DNA הליניארי באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
2. סינתזת RNA באמצעות T7 RNA פולימראז
   1. הוסף 2 μL כל אחד של 10x מאגר שעתוק, ATP, GTP, UTP, CTP ו- T7 ו- 1 מיקרוגרם של DNA ליניארי לצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף מים ללא נוקלאז כדי להביא את נפח התגובה ל -20 μL.
   2. יש לערבב על ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים לסינתזה של RNA.
   3. יש לסובב כלפי מטה, להוסיף 1 μL של DNase (2 U/μL), ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות כדי להסיר את הדנ"א של התבנית.
3. משקעים ליתיום כלורי של RNA
   1. הוסף 10 μL של ליתיום כלורי (7.5 M) לתערובת התגובה. ערבבו על ידי הקשה, סחררו כלפי מטה ודגרו על תערובת התגובה בטמפרטורה של -20°C למשך 30 דקות.
   2. צנטריפוגה ב-18,800 × גרם למשך 20 דקות ב-4°C, יש להשליך את הסופרנטנט ולשטוף את הגלולה ב-500 μL של 70% אתנול. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין.
   3. יבש עם מכסה פתוח במשך 2 דקות, להוסיף 30 μL של מים ללא nuclease, ולהשהות מחדש את גלולת RNA.
4. מכסה
   1. חממו את דגימת הרנ"א בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן הניחו אותה על קרח לקירור.
   2. הוסף 5 μL כל אחד של 10x capping buffer, 10 mM GTP ו-1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM), 2 μL כל אחד של תערובת אנזימי מכסה ותערובת אנזימים O-methyltransferase, ו-1.25 μL של מעכב RNase. יש לערבב על-ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
5. זנב Poly(A)
   1. סובב את הדגימה ולאחר מכן הוסף 6 μL של מים נטולי nuclease, 20 μL של 5x E-PAP buffer, 10 μL של 25 mM MnCl₂, 10 μL של 10 mM ATP, ו 4 μL של E-PAP poly(A) אנזים זנב. יש לערבב על-ידי הקשה, לסובב כלפי מטה ולדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים.
6. משקעי ליתיום כלורי וכימות ה-mRNA הסינתטי
   1. הוסף 50 μL של ליתיום כלורי (7.5 M), ובצע משקעים ליתיום כלורי כמתואר בשלבים 1.3.1-1.3.3.
   2. למדוד את ריכוז ה-mRNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
   3. ודא את הגודל והכמות של mRNA באמצעות פורמלדהיד (1%-2%) אגרוז (1%) אלקטרופורזה בג'ל.

2. ציפוי ג'ל מטריצה חוץ-תאית (ECM) של לוחות הפלישה והנדידה של התא (CIM)

הערה: לוח פלישה ונדידת תאים (CIM) הוא לוח 16 בארות המיוצר באופן מסחרי לניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה. עבור בדיקת הפלישה לתאים, לצפות לוחות CIM עם ג'ל ECM, כפי שתואר קודם אבל עם כמה שינויים¹¹.

1. הסר aliquot של ציר ג'ל ECM מהמקפיא ולשמור אותו על קרח.
2. לדלל את ג'ל ECM (10 מ"ג / מ"ל) לריכוז עבודה (100 מיקרוגרם / מ"ל) על ידי ערבוב 990 μL של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) (ללא סרום או אנטיביוטיקה) עם 10 μL של ג'ל ECM בצינור מיקרוצנטריפוגה. מערבבים על ידי פיפטינג עדין.
3. הוסף 60 μL של ג'ל ECM מדולל לכל אחת מ -16 הבארות של החדר העליון של צלחת CIM. יש ליישם את שיטת הצנרת ההפוכה תוך הימנעות מבועות אוויר^20,21.
   הערה: מטב את ריכוז ג'ל ECM עבור כל קו תאים. עבור קווי תאי גליובלסטומה, 0.1 מיקרוגרם / μL עד 1 מיקרוגרם / μL ג'ל ECM שימש לאופטימיזציה.
4. הניחו את החדר העליון של צלחת CIM עם כיסוי הצלחת על יריעת פלסטיק מגנה בתוך אינקובטור CO₂ למשך כ-4 שעות ליצירת שכבת ג'ל.
   זהירות: במהלך ציפוי צלחת CIM בג'ל ECM, האלקטרודות של החדר העליון של צלחת CIM לא אמורות להיות במגע ישיר עם ידיו של הנסיין או עם משטחי הציוד, כולל ארון הבטיחות הביולוגית או אינקובטור CO₂ .

3. הכנת תאי הגידול

הערה: כל חומרי תרבית התאים חייבים להישמר סטריליים. קצור וחשמל את תאי הגידול תחת ארון בטיחות ביולוגי עם ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כפי שתואר קודם לכן אך עם כמה שינויים¹¹.

1. תרבית תאי הגידול
   1. תרבית תאי U-118MG ב-10 מ"ל DMEM המכילים 5% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה לכל צלחת תרבית רקמת פוליסטירן בגודל 100 מ"מ x 20 מ"מ ב-37°C באינקובטור 5% CO₂ (מצב תרבית).
2. דלדול בסרום של תאי הגידול
   הערה: יש למזער את החשיפה של התאים לכימואטרקנטים הנמצאים ב- FBS לפני נדידת התאים ומבחני הפלישה באמצעות ריכוז גבוה של FBS.
   1. הסר את המדיום הישן, והוסף 10 מ"ל של DMEM שחומם מראש המכיל 0.5% FBS ו 1% אנטיביוטיקה לכל צלחת (בינוני בסרום נמוך).
   2. חזור על שלב 3.2.1.
   3. לדגור על התאים ב 37 ° C ב 5% CO₂ אינקובטור במשך 4 שעות או יותר.
3. קצירת תאי הגידול
   1. הסר את התווך הישן, הוסף 8 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) שחומם מראש לכל מנה, הסר את DPBS, הוסף 0.05% טריפסין-EDTA שחומם מראש (2 מ"ל לצלחת) כדי לכסות את פני השטח, ודגר באינקובטור CO₂ במשך 30 שניות.
   2. שאפו בזהירות את הטריפסין-EDTA, הוסיפו מדיום נמוך בסרום (7 מ"ל/צלחת), ולאחר מכן אספו תאים לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל או 15 מ"ל.
   3. Aliquot נפח קטן של תאים, ולהשתמש מונה תאים אוטומטי כף יד כדי לספור את התאים.
   4. חשב את מספר התאים הכולל ואת הנפח הדרוש עבור 10,000 תאים/μL.
   5. סובב את התאים על ידי צנטריפוגה אותם ב 100 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוף את supernatant, להוסיף את נפח מחושב של DMEM המכיל 0.5% FBS (ללא אנטיביוטיקה), ובעדינות להשעות מחדש את גלולת התא.
   6. מעבירים 110 μL של תרחיף התא, המכיל 1.1 מיליון תאים, לצינור מיקרוצנטריפוגה לכל טיפול.
   7. חזור על שלב 3.3.6 כדי להעביר את התאים לארבע צינורות מיקרוצנטריפוגות עבור ארבעה טיפולים שונים.
      הערה: צלחת CIM יש בסך הכל 16 בארות. תכנן ארבעה טיפולים שונים להשוואה, כך שניתן יהיה להקצות ארבע בארות של צלחת CIM לכל טיפול. השתמש בתאים המחושלים לניסויים הבאים: ניתוחי כתמים מערביים (0.3 מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמה של 35 מ"מ), ארבע בארות של מבחני נדידת תאים בזמן אמת (0.1 מיליון תאים / באר), וארבע בארות של מבחני פלישת תאים בזמן אמת (0.1 מיליון תאים / באר) עבור כל טיפול. התאם את מספר התאים שיש לחשמל אם תכנון הניסוי משתנה.

4. אלקטרופורציה של תאי הגידול

1. כדי להסיר את התווך, הוסף 1 מ"ל של DPBS לתרחיף התא בכל צינור, סובב את תרחיף התא שלוש פעמים במשך 10 שניות בכל פעם תוך סיבוב הצינור 180° כל 10 שניות באמצעות מיני צנטריפוגה, והסר את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה.
   הערה: חשוב ליצור כדורית תא קומפקטית אך ניתנת להשעיה בקלות.
2. הוסף 110 μL של חיץ תרחיף R לגלולת התא כדי לקבל 0.1 מיליון תאים ב 10 μL.
3. הוסף mRNA סינתטי לכדורית התא כדי לקבל ריכוז של 0.2-20 ng/μL בהתאם לרמת הביטוי הרצויה. ערבבו והשהו מחדש את כדורית התא בעדינות על ידי הקשה או פיפטינג עדין.
   הערה: השתמש בריכוזים שונים של mRNA סינתטי, בחן את ביטוי החלבון באמצעות ניתוח כתמים מערביים, וקבע את ריכוז ה- mRNA הסינתטי המוביל לרמת הביטוי הרצויה על מנת לחקור את הקשר הספציפי בין ביטוי החלבון לבין ההשפעות הביולוגיות.
4. אלקטרופורטאט 10 μL של תרחיף התא עם מערכת אלקטרופורציה ב 1,350 V למשך 10 אלפיות השנייה עם שלוש פעימות בכל פעם.
5. העבר את התאים המחושלים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש עם 1.1 מ"ל DMEM המכיל 0.5% FBS.
6. חזור על האלקטרופורציה עד ששאר תרחיף התא מתחשמל. שלב את התאים המחושלים בצינור המיקרוצנטריפוגה כדי לקבל 1.1 מיליון תאים ב -1.1 מ"ל.
   הערה: ניתן להשתמש בקצוות אלקטרופורציה של 100 μL ו- 10 μL כדי לחשמל נפח גדול של תאים, אך עצות האלקטרופורציה עבור 10 μL ו- 100 μL כלולות בשתי ערכות נפרדות ויש לרכוש אותן בנפרד. חיץ המתלים R כלול בשתי הערכות.
7. עם השלמת כל האלקטרופורציות המתאימות, השהה מחדש בעדינות את התאים המאוגרים.
8. צלחת 0.3 מיליון תאים בצלחת תרבית רקמת פוליסטירן 35 מ"מ x 10 מ"מ עם 2 מ"ל DMEM המכיל 5% FBS, ותרבית את התאים במשך יום אחד בתנאי התרבית להכנת ליזט התא הכולל וניתוח כתמים מערביים.
9. שמור את שאר התאים המתחשמלים בטמפרטורת החדר עד שמערכת ניתוח התאים בזמן אמת תהיה מוכנה.

5. הגדרת מנתח התאים בזמן אמת, התוכנית ולוחות CIM

הערה: הכן את מנתח התאים בזמן אמת ושני לוחות CIM, כמתואר^{לעיל 11}.

1. שיווי משקל של מנתח תאים בזמן אמת
   1. העבר את מנתח התאים בזמן אמת לאינקובטור_CO2 מספר שעות לפני השימוש כדי לאזן את המערכת בתנאי התרבית.
2. הגדרת תוכנית הניתוח
   1. פתח את תוכנית הניתוח על ידי לחיצה כפולה על סמל תוכנת ניתוח התאים בזמן אמת בשולחן העבודה.
   2. לאחר שהאפשרות Default Experiment Pattern Setup פתוחה, בחר באפשרות להפעלת שלושה ניסויים בנפרד.
      הערה: לכל עריסה יש חלון נפרד. ישנן כרטיסיות שונות להגדרת מרווח המדידה ומשך, ניתוח נתונים ותנאי ניסוי אחרים.
   3. פתח כל עריסה על ידי לחיצה על הכרטיסייה מספר .
   4. לחץ על הכרטיסייה הערות ניסוי , בחר את התיקיה שבה הנתונים יישמרו והזן את שם הניסוי.
   5. לחץ על הכרטיסייה פריסה , הגדר בארות מרובעות עבור כל תנאי טיפול על ידי בחירת ארבע בארות בכל פעם והזנת פרטי הדגימה ולאחר מכן לחץ על החל.
   6. לחץ על הכרטיסייה לוח זמנים | הוסף שלב כדי להגדיר את המצב הדו-שלבי של מדידות עכבת התא. לאחר מכן, לחץ על החל כדי להגדיר את הצעד הראשון.
   7. לחץ על הוסף שלב שוב, הזן 10 דקות עבור מרווח הזמן ו 48 שעות עבור משך עבור הגירה ופלישה, ולחץ על החל כדי להגדיר את השלב השני.
      הערה: השלב הראשון כולל מדידה חד-פעמית של קו הבסיס (טאטוא אחד במרווח של דקה). השלב השני מודד את עכבת התא עבור הניסוי (לדוגמה, 289 טאטוא עם מרווח של 10 דקות במשך 48 שעות) בעריסה. התאם את המרווח ומשך הזמן בהתאם לתכנון הניסוי.
   8. עבור לעריסה הבאה והגדר אותה על-ידי חזרה על שלבים 5.2.3-5.2.7.
3. הכנת לוחות CIM
   1. שעה לפני תחילת מדידת עכבת התא, מלא את הבארות של החדר התחתון של צלחת CIM עם 160 μL של DMEM המכיל 10% סרום או chemoattractants אחרים.
   2. הרכיבו את החדר העליון המכיל את הבארות מצופות הג'ל ECM (לפלישה) או בארות לא מצופות (להגירה) עם החדר התחתון.
   3. הוסף 50 μL של מדיום נמוך בסרום לבארות של החדר העליון של צלחת CIM עבור בדיקת נדידת תאים, ומקם את צלחת CIM בעריסה של המערכת.
   4. לחץ על הכרטיסייה הודעה וודא שההודעה חיבורים בסדר מוצגת. לוח CIM מוכן כעת לניסוי.
   5. דגרו מראש על צלחת CIM שהורכבה באינקובטור CO₂ למשך 30-60 דקות לפני ניתוח התאים בזמן אמת כדי להתאים את צלחת CIM למצב התרבית.

6. ניתוח תאים בזמן אמת וייצוא נתונים

הערה: בצע קריאה בסיסית, זריעת תאים, מדידת עכבת תאים וייצוא נתונים כמתואר^{לעיל 11}.

1. קריאה בסיסית
   הערה: יש לקרוא את קו הבסיס לאחר התאקלמות לוח CIM ולפני הוספת התאים לבארות החדר העליון.
   1. לחץ על לחצן התחל עבור כל עריסה. כשהחלון Save As מופיע, שמור את הקובץ הניסיוני כדי לבצע את הקריאה הבסיסית.
2. זריעת תאים
   1. הסר את צלחת CIM מהעריסה והנח אותה בארון הבטיחות הביולוגית על מחזיק הצלחת.
   2. הוסף 100 μL (המכיל 100,000 תאים) של תאים מחושמלים לבארות של החדר העליון של לוח CIM בהתאם לתוכנית ביחידת הבקרה. יש ליישם את שיטת הפיטינג ההפוך תוך הימנעות מבועות אוויר.
   3. השאירו את צלחת CIM מתחת לארון הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לוודא שהתאים מתפשטים באופן שווה על קרקעית הבאר.
3. מדידת עכבת תאים
   1. העבר את צלחת CIM שהורכבה במלואה בחזרה לעריסה המתאימה. לחץ על לחצן התחל העריסה כדי להתחיל את מדידת עכבת התא לשלב השני.
   2. לחץ על הכרטיסייה מגרש ולאחר מכן לחץ על הלחצן הוסף הכל ובחר בתיבות ממוצע ו - STD DEV כדי להציג את הנתונים באופן חזותי בזמן אמת.
      הערה: אפשרות ברירת המחדל להתוויה היא Time עבור ציר x ואינדקס תאים עבור ציר y. המקטע 'בחירת התווייה ' מאפשר למשתמש לבחור אפשרויות חלופיות לציר y: אינדקס תאים מנורמל או אינדקס תא דלתא. לאחר ביצוע הטאטוא הסופי, הניסוי הושלם, והתוצאות נשמרות באופן אוטומטי.
4. ייצוא הנתונים לניתוח
   1. לחץ על הכרטיסייה מגרש ובחר את התיבות ממוצע ו - STD DEV כדי להעתיק את הנתונים עבור כל באר בנפרד.
   2. לחץ לחיצה ימנית על אזור ההתווייה ובחר העתק נתונים בתבנית רשימה.
   3. פתח קובץ גיליון אלקטרוני ריק, הדבק את הנתונים ולאחר מכן שמור את הקובץ.
   4. חזור לתוכנית הניתוח, לחץ על הכרטיסייה צלחת עבור כל עריסה ובחר שחרור כדי לסגור את הניסוי עבור העריסה.
   5. חזור לקובץ הגיליון האלקטרוני והתאם את זמן הנתונים הגולמיים כך ששעת ההתחלה בשלב השני תהפוך לשעת ההתחלה בפועל של המדידה.

חלבוני Crk ו-CrkL ממלאים תפקידים חשובים בתנועתיות של סוגי תאים רבים, כולל תאי עצב22, תאי T23, פיברובלסטים 18,19 ומגוון תאי גידול13. מאחר שחלבוני Crk ו-CrkL דווחו כבעלי רמות גבוהות בגליובלסטומה24,25,26, נחקרו במחקר זה ההשפעות של ביטוי יתר של CrkI, גרסה של Crk, על נדידת תאי גליובלסטומה. תאי U-118MG עברו אלקטרופוזציה בריכוזים שונים של mRNA סינתטי מסוג CrkI ונותחו עבור רמות חלבון ונדידת תאים. האלקטרופורציה של תאי גליובלסטומה U-118MG עם ריכוזים משתנים של mRNA סינתטי CrkI הביאה לעלייה תלוית ריכוז בחלבון CrkI המתויג על ידי FLAG יום אחד לאחר הטרנספקציה (איור 1A). בעוד 0.2 ng/μL ו-2 ng/μL mRNA הובילו לביטוי צנוע או בלתי ניתן לגילוי של חלבון CrkI האקסוגני, 20 ng/μL mRNA הביא לרמת ביטוי גבוהה בהרבה מחלבון CrkI אנדוגני.

התוצאות מבדיקת נדידת התאים באמצעות מערכת ניתוח תאים בזמן אמת הצביעו על כך שהאלקטרופורציה עם mRNA מסוג 0.2 ng/μL או 2 ng/μL CrkI mRNA לא השפיעה באופן משמעותי על נדידת התא. אולם אלקטרופורציה עם mRNA CrkI של 20 ננוגרם/מיקרוליטר הובילה לגירוי ברור של נדידת תאים, כאשר יותר תאים נדדו בין שעתיים ל-13 שעות (איור 1B). ההשוואה בין רמת החלבון CrkI לבין נדידת התאים גילתה כי נדידת תאי גליובלסטומה עוררה על ידי העלייה ברמת החלבון CrkI. נראה כי רמת החלבון CrkI צריכה להיות גבוהה מסף מסוים כדי לגרום לגירוי משמעותי של נדידת תאים. אם נדידת התאים הייתה נמדדת בדרכים שונות כדי לספור או לצפות בתאים הנודדים בנקודות זמן מסוימות, ייתכן שהיה נדרש מאמץ רב יותר כדי לזהות שינוי מסוג זה בנדידת תאים.

כדי לחקור כיצד ביטוי יתר של CrkL משפיע על פלישת תאי גליובלסטומה דרך שכבות ג'ל ECM עם ריכוזים שונים של חלבוני ECM, תאי U-118MG עברו אלקטרופורציה עם mRNA סינתטי CrkL ונותחו במונחים של רמות החלבון ופלישת התאים דרך שכבת ג'ל ECM. האלקטרופורציה של תאי גליובלסטומה U-118MG עם mRNA סינתטי של CrkL הובילה לביטוי חזק של חלבון CrkL המתויג על ידי FLAG יום אחד לאחר הטרנספקציה (איור 2A). ככל שהריכוז של חלבוני ECM עלה, הפלישה של תאי הבקרה הואטה (איור 2B). תאים בעלי ביטוי יתר של CrkL הראו גם ירידה תלוית ריכוז ג'ל ECM בפלישת תאים (איור 2C). ההשוואה בין תאי הבקרה לבין תאי ביטוי יתר של CrkL בריכוזים שונים של ג'ל ECM הצביעה על כך שביטוי יתר של CrkL בדרך כלל עורר פלישה של תאים דרך שכבת הג'ל ECM (איור 2D-G). עם זאת, ההבדל בין שתי אוכלוסיות התאים נעשה ברור בנקודות זמן שונות בהתאם לריכוז ג'ל ECM.

עבור ג'ל ECM של 0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר, גירוי CrkL בתיווך ביטוי יתר של פלישת תאים היה ברור בין 8 שעות ל-20 שעות (איור 2D), אולם ההבדל בפלישת תאים היה זניח לאחר 32 שעות. עבור ג'ל ECM של 0.2 מיקרוגרם/מיקרוליטר, ההבדל בפלישת תאים עם וללא ביטוי יתר של CrkL היה מינימלי בכל עת (איור 2E). עבור ג'ל ECM של 0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר, ההבדל בפלישת התאים היה ניכר בין 24 שעות ל-36 שעות (איור 2F). עבור ג'ל ECM של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר, השפעת ביטוי היתר של CrkL על פלישת תאים התבררה מעט לאחר 48 שעות (איור 2G). התוצאות מצביעות על כך שהחלון לזיהוי ההבדל בין תאי הבקרה לבין תאי ביטוי יתר של CrkL משתנה לזמנים מאוחרים יותר ככל שריכוז ג'ל ECM עולה. התוצאות גם מצביעות על כך ששתי אוכלוסיות התאים הושפעו באופן דיפרנציאלי מהעלייה בריכוז ג'ל ECM בנקודות זמן שונות. לדוגמה, ב-12 שעות, התאים בעלי ביטוי יתר של CrkL הראו פלישה גבוהה יותר באופן משמעותי רק ב-0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר ECM ג'ל (איור 2H). אולם לאחר 24 שעות, התאים בעלי ביטוי יתר של CrkL הראו פלישה מעט גבוהה יותר או דומה בריכוזי ג'ל ECM שנבדקו (איור 2I). לכן, חשוב לחקור הן את ההבדלים תלויי הזמן והן את ההבדלים תלויי ריכוז ג'ל ECM בפלישת תאים כדי לקבל מבט מקיף על ההבדלים בין שתי אוכלוסיות התאים עם וללא ביטוי יתר של CrkL. תוצאות אלה מראות כי שילוב ביטוי יתר חולף באמצעות mRNA סינתטי עם ניתוח תאים בזמן אמת מבוסס עכבה מספק כלי רב עוצמה לניתוח המתאם הפוטנציאלי בין ביטוי יתר של גנים לבין נדידת תאי הגידול ופלישה. בחינת ההשפעות של שינויי ריכוז ב-mRNA סינתטי ובג'ל ECM תספק מידע מדויק ומפורט יותר.

איור 1: ההשפעות של ביטוי יתר של CrkI על נדידת תאי גליובלסטומה. תאי U-118MG עברו אלקטרופוזציה עם הריכוזים המצוינים (ng/μL) של mRNA CrkI המתויג כ-FLAG. (A) עבור ניתוחי הכתם המערבי, התאים המחושמלים עברו תרבית במשך יום אחד לפני הכנת הליזט הכולל של התא. הושוו רמות החלבון לאחר טרנספקציה עם mRNA סינתטי CrkI . נוגדנים Anti-Crk ו- Anti-CrkL שימשו לזיהוי חלבונים אנדוגניים וחלבונים המתויגים ב- FLAG ולהשוואת היחס בין החלבונים האנדוגניים לחלבונים המתויגים ב- FLAG. Vinculin ו- α-tubulin שימשו כפקדי העמסה. (B) עבור ניתוחי נדידת תאים, התאים שהתחשמלו צופו על לוח CIM ללא תרבית נוספת. ערכי אינדקס התא התקבלו מארבע בארות עבור כל דגימה, וערכי ה- SD ± הממוצע שלהם מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: השפעות של ביטוי יתר של CrkL על פלישה לתאי גליובלסטומה. תאי U-118MG התחשמלו עם H2O נטול נוקלאז או 20 ng/μL FLAG-tagged CrkL mRNA. (A) עבור ניתוחי הכתם המערבי, התאים המחושמלים עברו תרבית במשך יום אחד לפני הכנת הליזט הכולל של התא. הושוו רמות החלבונים בטרנספקציה עם mRNA סינתטי CrkL. נוגדנים Anti-Crk ו- Anti-CrkL שימשו לזיהוי חלבונים אנדוגניים וחלבונים המתויגים ב- FLAG ולהשוואת היחס בין החלבונים האנדוגניים לחלבונים המתויגים ב- FLAG. Vinculin ו- α-tubulin שימשו כפקדי העמסה. (ב-ג) לצורך ניתוח הפלישה לתאים, התאים המחושמלים צופו על צלחת CIM עם ציפוי ג'ל ECM ללא תרבית נוספת. ערכי אינדקס התא התקבלו מארבע בארות עבור כל דגימה, וערכי SD ± הממוצע שלהם מוצגים. (B) הושוו נתוני פלישת התאים מתאי הבקרה עם ריכוזי ג'ל ECM שונים. (C) הושוו נתוני הפלישה של התאים בעלי ביטוי יתר של CrkL עם ריכוזי ג'ל ECM שונים. (ד-ג) נתוני הפלישה לתאים בין תאי הבקרה לבין תאי ביטוי יתר של CrkL הושוו עבור ריכוז ג'ל ECM שצוין. (H) השוואה של פלישת התאים ב-12 שעות בין תאי הבקרה לבין תאי CrkL-overexpression. (I) השוואה של פלישת התאים ב-24 שעות בין תאי הבקרה לבין תאי CrkL-overexpression. קיצורים: ECM = מטריצה חוץ-תאית; CIM = פלישה והגירה של תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דיאגרמות סכמטיות של ההליכים הניסיוניים בעקבות הפלת גנים או ביטוי יתר של גנים . (A) ההליך הניסיוני של אנליזת תאים בזמן אמת לאחר התמרת siRNA. מכיוון שנדרשים 3-4 ימים כדי לגרום להפלה מלאה של גנים לאחר טרנספקציה של siRNA בתנאי הניסוי, התאים צופו מחדש וגודלו בתרבית במשך 3 ימים לאחר האלקטרופורציה לפני שהיו מוכנים לניתוח תאים בזמן אמת. (B) ההליך הניסיוני לאנליזת תאים בזמן אמת לאחר טרנספקציית mRNA סינתטית. מכיוון שביטוי החלבונים מהתמרה סינתטית של mRNA הוא מהיר, התאים המחושלים שימשו לניתוח תאים בזמן אמת באותו היום. שימו לב להבדל בין שני הליכי הניסוי; בעוד שאנליזת תאים בזמן אמת בוצעה 3 ימים לאחר האלקטרופורציה לפירוק גנים באמצעות siRNAs, ניתוח תאים בזמן אמת בוצע מיד לאחר האלקטרופורציה לביטוי יתר של גנים עם mRNA סינתטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.