מאמר שיטה

מערכת ניתוח תאים היברידית להערכת שינויים מבניים והתכווצות של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי להערכת סיכון לבבי פרה-קליני

DOI:

10.3791/64283

⸱

20 באוקטובר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1innoVitro GmbH, 2Nanion Technologies GmbH

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח השינויים בתפקוד ההתכווצות ובשלמות התאים של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי הוא בעל חשיבות עצומה לפיתוח תרופות לא קליניות. מערכת היברידית של 96 תאים מטפלת בשני הפרמטרים בזמן אמת ובאופן פיזיולוגי לקבלת תוצאות אמינות ורלוונטיות לבני אדם, הנחוצות למעבר בטוח לשלבים קליניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת התכווצות הלב היא בעלת חשיבות עצומה לפיתוח טיפולים חדשים ומעברם הבטוח לשלבים קליניים. בעוד שקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) מבטיחים לשמש כמודל רלוונטי לאדם בשלבים פרה-קליניים של גילוי תרופות ופרמקולוגיה בטיחותית, בגרותם עדיין שנויה במחלוקת בקהילה המדעית ובפיתוח מתמיד. אנו מציגים טכנולוגיית התכווצות היברידית ועכבה/פוטנציאל שדה חוץ-תאי (EFP), ומוסיפים תכונות פרו-התבגרות משמעותיות לפלטפורמה 96-well-well בתקן התעשייה.

מערכת העכבה/EFP מנטרת את הפונקציונליות התאית בזמן אמת. מלבד קצב הפעימה של תאים מתכווצים, קריאות ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית מזהות שינויים מורפולוגיים הנגרמים על-ידי תרכובת, כמו צפיפות התאים ותקינות המונו-שכבתי התאית. במרכיב השני של מערכת ניתוח התאים ההיברידית, התאים מגודלים בתרבית על גבי ממברנות תואמות ביולוגית המחקות את הסביבה המכנית של רקמת לב אמיתית. סביבה פיזיולוגית זו תומכת בהבשלה של hiPSC-CMs במבחנה, מה שמוביל לתגובות התכווצות דמויות מבוגרים יותר, כולל השפעות אינוטרופיות חיוביות לאחר טיפול באיזופרוטרנול, S-Bay K8644 או omecamtiv mecarbil. פרמטרים כגון משרעת כוח הכיווץ (mN/mm2) ומשך הפעימה חושפים גם הם השפעות במורד הזרם של תרכובות בעלות השפעה על תכונות אלקטרופיזיולוגיות וטיפול בסידן.

המערכת ההיברידית מספקת את הכלי האידיאלי לניתוח תאים הוליסטי, ומאפשרת הערכת סיכון לבבי פרה-קלינית מעבר לפרספקטיבות הנוכחיות של מבחנים מבוססי תאים רלוונטיים לבני אדם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחת המטרות העיקריות של פיתוח תרופות מודרניות היא שיפור שיעור ההצלחה מספסל למיטה של טיפולים חדשים בצנרת גילוי התרופות. בדיקות פרמקולוגיות בטיחותיות של תרופות חדשות אלה מגלות לעתים קרובות תגובות שליליות של תרופות במערכת הלב וכלי הדם, המהוות כמעט רבע משיעור ההתשה של התרופה בשלבים פרה-קליניים1. הפיתוח והאינטגרציה של מתודולוגיות גישה חדשות (NAMs) ממלאים תפקיד מפתח במודרניזציה של הערכה פרה-קלינית, במיוחד איברי סוללות ליבה כמו הלב. מאחר שמתודולוגיות אלה הן גישות נטולות בעלי חיים, השימוש במודלים של תאים מבוססי אדם כמו קרדיומיוציטים (CMs) ממוצא תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הפך לסוס העבודה בעשור האחרון עבור ההערכה המודרנית של סוגיות פרמקולוגיות וטוקסיקולוגיות בטיחותיות2. מערכות בדיקה הנמצאות בשימוש נרחב עבור חקירות כאלה הן מערך מיקרואלקטרודות (MEA) וגישות ניסיוניות מבוססות צבע רגישות למתח3.

אף על פי כן, חוסר הבשלות הפנוטיפית והתפקודית הנטענת של סוג תא זה מציב מכשולים בדרכו של מודל תא אידיאלי המבוסס על בני אדם, עם פוטנציאל לצמצם פערים תרגומיים בין מחקרים לא קליניים וקליניים4.

מחקר עצום נערך לאורך השנים כדי להבין את הסיבה לפנוטיפ הלא בוגר המשתמע ולמצוא דרכים לדחוף את תהליך ההבשלה של iPSC-CMs אנושיים במבחנה.

בהיעדר רמזי התבגרות לבביים כגון זמני תרבית תאים ממושכים, היעדר סוגי תאים אחרים בסביבה או היעדר גירוי הורמונלי הודגם כמשפיעים על תהליך ההבשלה5. כמו כן, הסביבה הלא פיזיולוגית של צלחות תרבית תאים רגילות זוהתה כגורם משמעותי המעכב את ההבשלה של iPSC-CMs אנושיים, בשל נוקשות המצע הפיזיולוגי החסר של הלב האנושי המקומי 5,6.

מערכות בדיקה שונות עם דגש על תנאים פיזיולוגיים מקומיים פותחו כדי להתמודד עם בעיה זו, כולל מערכות תרבית תאים תלת-ממדיות שבהן התאים מיושרים באופן תלת-ממדי כדי להידמות לארכיטקטורת הלב המקומית במקום לתרביות תאים דו-ממדיות טיפוסיות7. למרות שהתבגרות משופרת מתקבלת באמצעות בדיקות תלת-ממדיות, הצורך בכוח עבודה מיומן והתפוקה הנמוכה של מערכות אלה מעכבים שימוש רב בכך בתהליך פיתוח התרופות, שכן הזמן והעלות ממלאים תפקיד בסיסי בהערכת טיפולים חדשים ברמה הפיננסית8.

קריאות חשובות להערכה פרמקולוגית וטוקסיקולוגית בטיחותית של טיפולים חדשים הן שינויים במאפיינים תפקודיים ומבניים של iPSC-CMs אנושיים, שכן תגובות שליליות הנגרמות על ידי תרכובות של מערכת הלב וכלי הדם משפיעות בדרך כלל על אחד או שניהם ממאפיינים אלה 1,9. דוגמאות ידועות לתגובות שליליות רחבות כאלה הן תרופות אנטי סרטניות ממשפחת האנתרציקלין. כאן, השפעות תפקודיות ומבניות שליליות מסוכנות על מערכת הלב וכלי הדם מדווחות באופן נרחב במהלך ואחרי טיפול בסרטן בחולים, כמו גם עם בדיקות מבוססות תאי מבחנה 10,11.

במחקר הנוכחי, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה להערכת תופעות לוואי של תרכובות פונקציונליות ומבניות על hiPSC-CMs. המתודולוגיה כוללת ניתוח של כוח התכווצות קרדיומיוציטים וניתוח עכבה / פוטנציאל שדה חוץ-תאי (EFP). כוח ההתכווצות נמדד בתנאים מכניים פיזיולוגיים, כאשר התאים מתרבית על מצעי סיליקון רכים (33 kPa), המשקפים את הסביבה המכנית של רקמת הלב האנושית המקומית.

המערכת מצוידת בלוחות 96 באר לניתוח תפוקה גבוהה של iPSC-CMs אנושיים למחקרים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים פרה-קליניים לבטיחות לב, ובכך מספקת יתרון לגישות תלת-ממדיות המשמשות כיום כמו לנגנדורף לב או פרוסות לב12,13.

בפירוט, המערכת ההיברידית מורכבת משני מודולים, או להערכת התכווצות הלב בתנאים פיזיולוגיים או לניתוח רעילות מבנית תאית בזמן אמת 6,14. שני המודולים עובדים עם לוחות מיוחדים בעלי תפוקה גבוהה של 96 בארות להשגת נתונים מהירה וחסכונית.

ללא צורך במבנה תלת-ממדי, מודול ההתכווצות משתמש בלוחות מיוחדים המכילים קרומי סיליקון גמישים כמצע לתאים במקום הזכוכית הנוקשה או הפלסטיק שמהם מורכבות בדרך כלל לוחות תרבית תאים רגילים. הממברנות משקפות תכונות לב ביומכניות אנושיות טיפוסיות ולכן מחקות תנאי in vivo באופן בעל תפוקה גבוהה. בעוד ש-iPSC-CMs אנושיים נכשלים לעתים קרובות בהצגת התנהגות קרדיומיוציטים של מבוגרים בנוגע לאינוטרופיה חיובית הנגרמת על-ידי תרכובות במבחנים אחרים המבוססים על תאים14, ניתן להעריך תגובה דמוית מבוגר יותר כאשר התאים מתרבית על הלוחות של מודול ההתכווצות. במחקרים קודמים, הוכח כי iPSC-CMs מציגים השפעות אינוטרופיות חיוביות על טיפול בתרכובות כגון איזופרוטרנול, S-Bay K8644, או omecamtiv mecarbil 6,15. כאן ניתן להעריך פרמטרים רבים של התכווצות, כגון פרמטרים ראשוניים כמו משרעת כוח הכיווץ (mN/mm2), משך פעימה וקצב פעימה, כמו גם פרמטרים משניים של מחזור הכיווץ כמו שטח מתחת לעקומה, מדרונות כיווץ והרפיה, וריאציות קצב פעימה והפרעות קצב (איור משלים 1)16 . שינויים הנגרמים על ידי תרופות בכל הפרמטרים מוערכים באופן לא פולשני על ידי חישת מרחק קיבולית. הנתונים הגולמיים מנותחים לאחר מכן על ידי תוכנה מיוחדת.

מודול הרעילות המבנית מוסיף את העכבה הייחודית שלו ואת פרמטרי EFP כקריאה לרעילות תאית מבנית ולניתוח תכונות אלקטרופיזיולוגיות17,18. טכנולוגיית ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית חושפת שינויים המושרים על-ידי תרכובות בצפיפות התא או בתקינות התא והחד-שכבתית המנוטרים בזמן אמת, כפי שמוצג עם iPSC-CMs אנושיים שטופלו בתרכובות קרדיוטוקסיות ידועות13. עם קריאות עכבה בתדרים שונים (1-100 קילוהרץ) ניתן לנתח תגובה פיזיולוגית נוספת, וכך ניתן להשיג שינויים בטופוגרפיה של הממברנה, תא-תא או צמתים של מטריצת תא. הקלטת ה-EFP הנוספת של iPSC-CMs אנושיים מאפשרת גם ניתוח של השפעות אלקטרופיזיולוגיות הנגרמות על ידי טיפול תרכובת, כפי שהוכח לאור מחקר CiPA17,19.

במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-iPSC-CMs אנושיים, שטופלו באפירוביצין ודוקסורוביצין, שניהם מתוארים היטב כאנתרציקלין קרדיוטוקסי, וארלוטיניב, מעכב טירוזין קינאז (TKI) עם סיכון נמוך למדי לרעילות לב וכלי דם. הערכה כרונית עם אפירוביצין, דוקסורוביצין וארלוטיניב בוצעה במשך 5 ימים. התוצאה מראה שינויים קלים בהתכווצות ובעכבת הבסיס כאשר תאים טופלו בארלוטיניב, אך ירידה רעילה תלוית זמן ומינון במשרעת ההתכווצות ובעכבת הבסיס כאשר טופלו באפירוביצין ודוקסורוביצין בהתאמה. מדידות חריפות בוצעו עם חוסם תעלות הסידן ניפדיפין והראו ירידה באמפליטודת הכיווץ, משך פוטנציאל השדה ועכבת הבסיס, מה שהדגים תופעות לוואי קרדיוטוקסיות של תרכובת זו ברמה התפקודית כמו גם המבנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: זרימת העבודה למדידת כיווץ ועכבה/EFP ניתנת באיור משלים 2.

1. ציפוי צלחת

  1. פתחו את האריזה האטומה בוואקום והוציאו את צלחת 96 הבארות. נהלי הטיפול בלוחות 96 בארות של שני המודולים זהים. השאירו את לוחית הכיווץ מכוסה על ידי מגן הממברנה המסופק בנוסף עד למדידה במודול ההתכווצות.
  2. מצפים את הצלחות הגמישות של 96 באר לזריעת קרדיומיוציטים.
    1. הכן תמיסת ציפוי ג'ל EHS מדוללת על ידי העברת 2.75 מ"ל של תמיסה מוכנה לשימוש בג'ל EHS בצינור צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן הוסיפו 8.25 מ"ל של DPBS עם Ca 2+ ו-Mg2+. מערבבים את הפתרון בזהירות.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בפיברונקטין גם לציפוי הבארות: הכן תמיסת ציפוי פיברונקטין בגודל 13 מ"ל בצינור צנטריפוגה סטרילי על ידי דילול 650 μL של תמיסת מלאי פיברונקטין (1 מיקרוגרם/מ"ל) ב-13 מ"ל של DPBS עם Ca 2+ ו-Mg2+, וכתוצאה מכך תמיסת עבודה של 50 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים את הפתרון בזהירות.
  3. העבירו את תמיסת הציפוי למאגר ריאגנטים סטרילי המוצב ברובוט האוטומציה של המעבדה.
  4. הוסף 100 μL של פתרון הציפוי לכל באר עם רובוט אוטומציה במעבדה באמצעות התוכנית "ADD100μL". החזירו את המכסה לצלחת 96 הבארות ודגרו במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: התוכנית עבור רובוט האוטומציה של המעבדה צריכה להיות מוגדרת מראש באופן ידני מראש.

2. זריעה של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי לצלחות גמישות של 96 בארות (יום 0)

  1. הפשרת התאים בהתאם להנחיות היצרן.
  2. ספרו את התאים באמצעות תא ספירה ידני והתאימו את התאים במדיום הציפוי המומלץ בהתאם להוראות יצרן התאים (למשל, 1 x 105 תאים /באר), וכתוצאה מכך 11 x 106 תאים / 11 מ"ל לזריעת צלחת שלמה של 96 בארות.
  3. הסר את תמיסת הג'ל EHS מהבארות באמצעות רובוט האוטומציה של המעבדה באמצעות התוכנית "REMOVE100μL". הסר את מאגר הריאגנטים המכיל את תמיסת הציפוי המחולקת מהרובוט.
  4. העבירו את מתלה התאים (11 מ"ל בסך הכל) למאגר ריאגנטים סטרילי הממוקם ברובוט האוטומציה של המעבדה וזרעו את התאים עם 100 μL/well באמצעות התוכנית "CELLS_ADD100 μL".
  5. מיד לאחר זריעת התאים, העבירו את צלחת 96 הבאר הגמישה לתוך האינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, מבוקר לחות) ותנו לתאים לשקוע בן לילה.

3. החלפה בינונית של צלחות 96-באר גמישות (יום 1)

  1. מחממים לפחות 22 מ"ל של תחזוקת קרדיומיוציטים בינוניים לצלחת ל-37 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, 18-24 שעות לאחר זריעת הצלחות.
  2. העבירו את המדיום הטרי (לפחות 22 מ"ל) למאגר ריאגנטים סטרילי והשאירו אותו ממש ליד רובוט האוטומציה של המעבדה. מניחים מאגר ריאגנטים ריק ברובוט ומבצעים הסרה בינונית עם התוכנית "REMOVE100μL". לאחר מכן, החליפו את מאגר הריאגנטים המכיל את מדיום הפסולת עם מאגר הריאגנטים המכיל את המדיום הטרי וחלקו 200 מיקרוליטר של המדיום הטרי לבאר עם התוכנית "ADD100μL". בצע שלב זה פעמיים כדי להגיע ל-200 μL/well.
  3. מיד לאחר חילופי בינוני, להעביר את הצלחת בחזרה לתוך האינקובטור.
  4. יש לבצע החלפה בינונית (200 μL/well) אחת ליומיים עד להוספת התרכובת.

4. החלפה בינונית סופית לפני תוספת המתחם (יום 5-7)

  1. יש לבצע שינוי בינוני סופי 4-6 שעות לפני הוספת התרכובת.
  2. יש לחמם לפחות 22 מ"ל של חיץ בדיקה עבור צלחת גמישה אחת של 96 בארות. מאגר הבדיקה מורכב מאמצעי תחזוקה או נגזרות שלו (לדוגמה, מדיה נמוכה /ללא סרום, מדיה חופשית אדומה פנול או מאגרים איזוטוניים אחרים).
  3. מעבירים את המדיום הטרי למאגר ריאגנטים סטרילי ומשאירים אותו ממש ליד רובוט האוטומציה של המעבדה. מניחים מאגר ריאגנטים ריק ברובוט ומבצעים הסרה בינונית. לאחר מכן, החליפו את מאגר הריאגנטים המכיל את מדיום הפסולת עם מאגר הריאגנטים המכיל את המדיום הטרי וחלקו 200 μL/well של המדיום הטרי.
  4. מיד לאחר חילופי בינוני, להעביר את הצלחת הגמישה בחזרה לתוך האינקובטור.

5. תוספת מורכבת ורישום נתונים (יום 5-7)

הערה: תוכנית מדידה לדוגמה לניסוי ניתנת באיור משלים 3.

  1. הכינו תמיסת עבודה לכל תרכובת בריכוז של פי 4 במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית באמצעות צלחת קידוח סטרילית רגילה בעומק 96. הפתרון המורכב מבוסס על מאגר הבדיקה המשמש בשלב 4. מעבירים את צלחת הבאר בעומק 96 המכילה את התמיסה המורכבת למשך שעה אחת לפחות לתוך האינקובטור כדי להתאים אותה לאותו מצב כמו הלוח הגמיש.
    הערה: הריכוז הגבוה פי 1 של כל תרופה המשמשת לכל ניסוי מסופק באיורים ובאגדות.
  2. העבר את הלוחית למכשיר המדידה המתאים שעה אחת לפני ביצוע מדידה בסיסית.
  3. פתח את Edit Protocol בתוכנת הבקרה (חלק ממערכת ניתוח התאים ההיברידית) ובחר את מצב המדידה המתאים כיווץ או עכבה/EFP.
  4. הגדר את משך הטאטוא (אורך של מדידה אחת; לדוגמה, 30 שניות) ואת מרווח החזרה (זמן בין מדידות; למשל, 5 דקות) ושמור את מספר הפרוטוקול.
  5. בחר התחל פרוטוקול > המשך ומלא את השדות המבוקשים.
  6. לבסוף, בחר התחל מדידה. בצע לפחות שלוש מדידות בסיסיות (טאטוא) במרווחים של 5 דקות זמן קצר לפני הוספת התרכובת.
    הערה: נתונים לדוגמה של מדידת בסיס של התכווצות באמצעות מודול ההתכווצות לפני תוספת מורכבת מתוארת באיור משלים 4
  7. הסר 50 μL של מאגר הבדיקה מכל באר מבלי להסיר את צלחת 96 הבאר הגמישה ממכשיר המדידה.
  8. הוסף 50 μL של תמיסת תרכובת מרוכזת פי 4 לכל באר של הצלחת, על פי תוכנית המדידה.
  9. בחר הוסף סמן אזור והגדר את פריסת הלוח המורכב ואת עוצמת הקול של התמיסה המורכבת לאחר הוספת המורכבת.
  10. לבסוף, בחר המשך עם מדידה סטנדרטית או המשך עם סדרות מדידה בהתאם לתוכנית הניסוי.

6. ניתוח נתונים

  1. עם תוכנת הקלטה, למדוד גורף, שאורכו ומרווח החזרה שלו מוגדרים על ידי המשתמש.
  2. באמצעות תוכנת ניתוח, לכוד את צורת האות על ידי קריאת פרמטרים כמו משרעת, קצב פעימה, רוחב פולס וכן הלאה, באופן אוטומטי.
    הערה: אות ממוצע הכולל את סטיית התקן, מה שמכונה פעימה ממוצעת, מחושב באופן אוטומטי בהתבסס על הנתונים של מטאטא אחד. המשתמש יכול להגדיר את הפרמטרים של התכווצות/IMP/EFP שהתוכנה מחשבת ומציגת.
  3. בעזרת תוכנת ניתוח מחשבים את עקומת המינון-תגובה ואת IC50/EC50 עבור כל תרכובת.
    הערה: הנתונים הגולמיים ותוצאות הניתוח שנוצרו באמצעות תוכנת הניתוח ניתנים לייצוא בקלות במגוון פורמטים. לבסוף, דוחות הנתונים נוצרים באופן אוטומטי כדי לסכם ולאחסן בארכיון את תוצאות הניסוי. תיאור מקיף של מה וכיצד נמדד אות EFP נדון ב 17.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההשפעות של מעכב קינאז ארלוטיניב על ההתכווצות של hiPSC-CMs מוצגות באיור 1. התאים טופלו בריכוזים שנעו בין 10 ננומטר ל-10 מיקרומטר במשך 5 ימים ונרשמו פרמטרים של פעימות מדי יום. לארלוטיניב, EGFR (קולטן גורם גדילה אפידרמלי) ומעכב טירוזין קינאז עם סיכון נמוך יחסית לקרדיוטוקסיות, הייתה השפעה מינורית ותלוית זמן על hiPSC-CMs רק בריכוזים בטווח המיקרומולרי. בריכוז הנמוך ביותר (10 ננומטר), ארלוטיניב גרם לירידה חסרת משמעות סטטיסטית באמפליטודה במדידה הראשונה לאחר יישום תרכובת (1 שעות). בכל המדידות הבאות ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המערכת ההיברידית עכבה / EFP / התכווצות היא מתודולוגיה מקיפה להערכה פרמקולוגית וטוקסיקולוגית של בטיחות תפוקה גבוהה של התחייבויות לב לפיתוח תרופות פרה-קליניות. הוא מספק גישה מודרנית לבדיקות בטיחות פרה-קליניות ללא שימוש במודלים של בעלי חיים, אך עם יכולות תפוקה גבוהות יותר המפחיתות באופן משמעותי זמן ועלויות. למערכת זו יש פוטנציאל לשמש כגישה משלימה עבור לב לנגנדורף ומודלים אחרים של בעלי חיים להערכת רעילות תפקודית ומבנית פרה-קלינית.

כגישה נטולת בעלי חיים, משתמשים ב-iPSC-CMs אנושיים עבור המערכת ההיבר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.L., M.Go., ו- P.L. מועסקים ב- INNOVitro GmbH, יצרנית הלוחות הגמישים. U.T., E.D., M.L., M.Ge, N.F., ו- S.S. מועסקים ב- Nanion Technologies GmbH, יצרנית המכשיר ההיברידי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמשרד הפדרלי הגרמני לענייני כלכלה ופעולה אקלימית (צים) וממשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (KMUinnovativ). אנו מודים ל- FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב) על כך שסיפקה בחביבות קרדיומיוציטים ו- Ncardia B.V. (ליידן, הולנד) על אספקת קרדיומיוציטים בחביבות, המשמשים במחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קרדיומיוציטים אנושיים מסחריים שמקורם ב-iPSC Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI)R1059
צנטריפוגה (צינורות 50 מ"ל)Thermo Fisher Scientific15878722
פיפטה מתכווננת 12 ערוצים (100-1250 μ L)Integra Biosciences4634
DPBS עם Ca2+ ו- Mg2 +GE Healthcare HyCloneSH304264.01
96 צלחת באר עמוקהThermo Fisher ScientificA43075
EHS ג'למטריקס חוץ-תאי ג'ל
FLEXcyte 96 / מכשיר היברידי CardioExcyteNanion Technologies 19 1004 1005מערכת ניתוח תאים היברידית 
FLX-96 FLEXcyte לוחות חיישןNanion Technologies20 1010
  תמיסת מלאי פיברונקטין (אופציונלי לג'לטרקס)Sigma AldrichF1141
Geltrex hESC מוסמך, מוכן לשימוש, גורם גדילה מופחת מטריצת ממברנת מרתףThermoFischer ScientificA1569601
קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-iPSC מדיום ציפוי ותחזוקהFCDIR1059
(37 & deg; C, 5% CO2)Thermo Fisher Scientific51023121
קולט אדים זרימה למינריתThermo Fisher Scientific51032678
NSP-96 CardioExcyte 96 צלחות חיישן 2.0 מ"מ שקופותNanion Technologies20 1011
קצות פיפטה (1250µ L)Integra Biosciences94420813
ReagentReservoir Integra Biosciences8096-11
פיפטה סרולוגית (למשל 25 מ"ל)Thermo Fisher Scientific16440901
פיפטה מתכווננת חד ערוצית (למשל 100-1000 μ L)Eppendorf3123000063
מערכת שאיבת ואקוםThermo Fisher Scientific15567479
אופציונלי: VIAFLO ASSISTIntegra Biosciences4500אוטומציה מעבדתית אמבט
מים רובוט (37 מעלות; ג)תרמו פישר סיינטיפיק15365877

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
  2. Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
  3. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  4. Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
  5. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  6. Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892(2020).
  7. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
  8. Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).
  9. Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
  10. Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
  11. Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
  12. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  13. Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225(2018).
  14. Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
  15. Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
  16. Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
  17. Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
  18. Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
  19. Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
  20. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  21. Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
  22. Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiac Contractility AssessmentHuman iPSC CardiomyocytesImpedance SpectroscopyExtracellular Field PotentialContractile Force MeasurementDrug Safety Pharmacology96 Well PlatformCardiomyocyte Maturation

מאמרים קשורים