כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מודל עכבר של ליקוי שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). כדי ליצור את NIHL, פיתחנו מכשיר חדש ופשוט העשוי מפלסטיק גלי, כלוב מלכודת חולדות ורמקול. תגובת גזע המוח השמיעתי והדמיית אימונופלואורסצנטיות שימשו להערכת תפקוד השמיעה והנזק לתאי השערה החיצוניים, בהתאמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודל בעל חיים של ליקוי שמיעה הנגרם מרעש (NIHL) שימושי עבור פתולוגים, מטפלים, פרמקולוגים וחוקרי שמיעה כדי להבין לעומק את המנגנון של NIHL, ולאחר מכן לייעל את אסטרטגיות הטיפול המתאימות. מחקר זה נועד ליצור פרוטוקול משופר לפיתוח מודל עכבר של NIHL. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים. עכברים לא מורדמים נחשפו לרעשים חזקים (1 ו -6 קילוהרץ, שהוצגו בו זמנית ב 115-125 dB SPL-A) ברציפות במשך 6 שעות ביום במשך 5 ימים רצופים. תפקוד השמיעה הוערך יום ושבוע לאחר החשיפה לרעש, באמצעות תגובת גזע המוח השמיעתית (ABR). לאחר מדידת ABR, העכברים הוקרבו, ואיבריהם של קורטי נאספו עבור צביעה immunofluorescence. ממדידות התגובה השמיעתית של גזע המוח (ABR), נצפה ליקוי שמיעה משמעותי יום אחד לאחר החשיפה לרעש. לאחר שבוע אחד, סף השמיעה של עכברי הניסוי ירד ל~80 dB SPL, שעדיין היה רמה גבוהה משמעותית מעכברי הביקורת (~ 40 dB SPL). מתוצאות ההדמיה האימונופלואורסצנטית, תאי השערה החיצוניים (OHC) הוכחו כפגומים. לסיכום, יצרנו מודל של NIHL באמצעות עכברי C57BL/6J זכרים. מכשיר חדש ופשוט ליצירה והעברה של רעש צליל טהור פותח ולאחר מכן נעשה בו שימוש. מדידות כמותיות של ספי שמיעה ואישור מורפולוגי של נזקי OHC הראו שניהם כי הרעש המופעל גרם בהצלחה לאובדן שמיעה צפוי.
מבוא
כ-1.3 מיליארד אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה כתוצאה מחשיפה לרעש1. במחקר זה, שאפנו לבסס תהליך ברור שלב אחר שלב לגרימת ואישור אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). NIHL נובע מניוון/הרס של תאי השערה (HCs) ונוירוני גנגליון ספירליים (SGNs), נזק בסטריאוסיליה של HC ו/או אובדן סינפסות בין HCs פנימיים של השבלול לבין SGNs. חריגות כאלה עלולות לגרום גם לטינטון ולפגיעה בתפיסת הדיבור (במיוחד בסביבה אקוסטית מורכבת) מלבד NIHL. תפקודים חברתיים, פסיכולוגיים וקוגניטיביים עשויים להיות מושפעים ברצף מליקויים פיזיולוגיים אלה 2,3,4,5,6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של Mackay Medical College. עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות נרכשו ממרכז חיות המעבדה הלאומי (העיר טאיפיי החדשה, טייוואן). כל העכברים גודלו ושוכנו בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של בעלי חיים.
1. השראת NIHL בעכברים
- הכינו את הכלוב לעכברי הניסוי
- לשם כך, השתמשו בכלוב מלכודת חולדות במידות של 14 ס"מ × 17 ס"מ ×-24 ס"מ. חתכו ארבע חתיכות של לוחות פלסטיק גלי לגדלים מתאימים, כך שיתאימו לכלוב (13 ס"מ × 23 ס"מ ו-13 ס"מ × 16 ס"מ).
- כדי למנוע מהעכברים לחתוך את רגליהם על ידי רשת הרשת, הניחו שתיים מהחתיכות בחלק התחתון ובצד האחורי, בהתאמה. הניחו את שני ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שינוי בסף השמיעה של ABR
סף השמיעה של העכברים נמדד באמצעות ABR מתפרץ טון יום אחד או שבוע לאחר החשיפה לרעש. נצפתה עלייה משמעותית בסף השמיעה בכל שלושת התדרים שנבדקו (12 קילוהרץ: 84.29 ± 2.77 dB SPL; 24 קילוהרץ: 91.43 ± 0.92 dB SPL; 32 קילוהרץ: 98.57 ± 1.43 dB SPL) יום אחד לאחר החשיפה לרעש (כלומר, היום השישי). התאוששות שמיעה חלקית התרחשה שבוע לאחר החשיפה לרעש (כלומר, היום ה-13), אך ספי השמיעה עדיין היו גבוהים ביותרמ-30 dB בכל התדרים (12 kHz: 72.86 ± 2.86 dB SPL; 24 kHz: 84.29 ± 2.77 .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ניתן לחלק את NIHL לשני סוגים: NIHL זמני, אשר מראה שינוי זמני של סף השמיעה, ו- NIHL קבוע, אשר מתבטא בשינוי סף שמיעה קבוע. ליקוי השמיעה שראינו ביוםהשישי (יום אחד לאחר החשיפה לרעש) הוא ככל הנראה שילוב של שני סוגים אלה. במקרה זה, סף השמיעה יראה התאוששות הדרגתית לאורך זמן בשל המרכיב הזמני של ליקוי שמיעה. במחקרים הניסיוניים הראשוניים שלנו, התוצאות שהתקבלו עם אותו מערך ובעלי חיים, ליקוי השמיעה שנוצר על ידי חשיפה לרעש של יומיים התאושש לחלוטין תוך שבועיים, מה שמצביע על כך ש- NIHL קבוע לא נוצר בפועל. להיפך, במחקר זה, לי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגוד עניינים לחשוף.
תודות
אנו מודים למענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST) של ממשלת טייוואן (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), ולמענקי מחקר פנימיים מהמכללה הרפואית Mackay (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| סט מיקרופון סטנדרטי בשדה חופשי CCP 1/4 אינץ' | GRAS | 428158 | לחשיפה לרעש |
| מודול קלט מגבר, AMI100D | BIOPAC | לתגובת גזע המוח השמיעתי | |
| מגבר ביו, BIO100C | BIOPAC | לתגובת גזע המוח השמיעתית | |
| סרום בקר אלבומין | SIGMA | A9647 | תוכנת צביעה אימונופלואורסצנטית |
| Cellens | אולימפוס מדעי | רכישת תמונה | |
| פלסטיק | |||
| DAPI fluoromount | SouthernBiotech | 0100-20 | צביעה אימונופלואורסצנטית |
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית | SIGMA | E5134 | הסרת אבדן |
| מגבר תגובה מעורר, ERS100C | BIOPAC | לתגובת | |
| גזע המוח השמיעתיתפורמלדהיד | APLHA | F030410 | קיבוע של |
| מערכת שבלול לרכישת נתונים בעלי ביצועים גבוהים, MP160 | BIOPAC | לתגובת גזע המוח השמיעתי | |
| כבל מאריך מודולרי, MEC110C | BIOPAC | לתגובת גזע המוח השמיעתית | |
| Myo7A נוגדן ראשוני | פרוטאוס | 25-6790 | נוגדן משני צביעה אימונופלואורסצנטית |
| Myo7A | Jackson immunoresearch | 711-545-152 | לצביעה אימונופלואורסצנטית |
| , חד קוטבית 12 mmTp, EL452 | BIOPAC | לתגובת גזע המוח השמיעתי | |
| נוגדן פלואידין | Alexa Fluor | A12381 | אימונופלואורסצנטי מכתים |
| מי מלח עם חוצץ פוספט | SIGMA | P4417 | |
| כלוב | 14 ס"מ x 17 ס"מ x 24 ס"מ | ||
| ROMPUN- הזרקת קסילזין, תמיסה | מגבר סאונד Bayer HealthCare, LLC | ||
| , MT-1000 | unika | לחשיפה לרעש | |
| מחולל סאונד/מנתח/שונות, FW-02 | CLIO | 620300719 | לחשיפה לרעש |
| תא אטום לרעש | IEA טכנולוגיה אלקטרו-אקוסטית | לחשיפה לרעש ורמקול ABR | |
| אלקטרו-אקוסטית של IEA | חשיפה לרעש | ||
| , STM100C | BIOPAC | לתגובת גזע המוח השמיעתית | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | צינוריות צביעה אימונופלואורסצנטית |
| , OUT101 | BIOPAC | לתגובת גזע המוח השמיעתי | |
| מיקרוסקופ זקוף, רכישת תמונה BX53 | Olympus | ||
| זולטיל | וירבאק |
מקורות
- World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
- Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
