הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64286

⸱

10 בפברואר 2023

 ,  , 
1Department of Audiology and Speech-Language Pathology, MacKay Medical College, 2Institute of Biomedical Sciences, MacKay Medical College

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מודל עכבר של ליקוי שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). כדי ליצור את NIHL, פיתחנו מכשיר חדש ופשוט העשוי מפלסטיק גלי, כלוב מלכודת חולדות ורמקול. תגובת גזע המוח השמיעתי והדמיית אימונופלואורסצנטיות שימשו להערכת תפקוד השמיעה והנזק לתאי השערה החיצוניים, בהתאמה.

תקציר

מודל בעל חיים של ליקוי שמיעה הנגרם מרעש (NIHL) שימושי עבור פתולוגים, מטפלים, פרמקולוגים וחוקרי שמיעה כדי להבין לעומק את המנגנון של NIHL, ולאחר מכן לייעל את אסטרטגיות הטיפול המתאימות. מחקר זה נועד ליצור פרוטוקול משופר לפיתוח מודל עכבר של NIHL. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים. עכברים לא מורדמים נחשפו לרעשים חזקים (1 ו -6 קילוהרץ, שהוצגו בו זמנית ב 115-125 dB SPL-A) ברציפות במשך 6 שעות ביום במשך 5 ימים רצופים. תפקוד השמיעה הוערך יום ושבוע לאחר החשיפה לרעש, באמצעות תגובת גזע המוח השמיעתית (ABR). לאחר מדידת ABR, העכברים הוקרבו, ואיבריהם של קורטי נאספו עבור צביעה immunofluorescence. ממדידות התגובה השמיעתית של גזע המוח (ABR), נצפה ליקוי שמיעה משמעותי יום אחד לאחר החשיפה לרעש. לאחר שבוע אחד, סף השמיעה של עכברי הניסוי ירד ל~80 dB SPL, שעדיין היה רמה גבוהה משמעותית מעכברי הביקורת (~ 40 dB SPL). מתוצאות ההדמיה האימונופלואורסצנטית, תאי השערה החיצוניים (OHC) הוכחו כפגומים. לסיכום, יצרנו מודל של NIHL באמצעות עכברי C57BL/6J זכרים. מכשיר חדש ופשוט ליצירה והעברה של רעש צליל טהור פותח ולאחר מכן נעשה בו שימוש. מדידות כמותיות של ספי שמיעה ואישור מורפולוגי של נזקי OHC הראו שניהם כי הרעש המופעל גרם בהצלחה לאובדן שמיעה צפוי.

מבוא

כ-1.3 מיליארד אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה כתוצאה מחשיפה לרעש1. במחקר זה, שאפנו לבסס תהליך ברור שלב אחר שלב לגרימת ואישור אובדן שמיעה הנגרם על ידי רעש (NIHL). NIHL נובע מניוון/הרס של תאי השערה (HCs) ונוירוני גנגליון ספירליים (SGNs), נזק בסטריאוסיליה של HC ו/או אובדן סינפסות בין HCs פנימיים של השבלול לבין SGNs. חריגות כאלה עלולות לגרום גם לטינטון ולפגיעה בתפיסת הדיבור (במיוחד בסביבה אקוסטית מורכבת) מלבד NIHL. תפקודים חברתיים, פסיכולוגיים וקוגניטיביים עשויים להיות מושפעים ברצף מליקויים פיזיולוגיים אלה 2,3,4,5,6.

במחקרים פרה-קליניים הקשורים ל-NIHL המבוססים על עכברים, זני העכבר הפופולריים ביותר הם CBA/CaJ 2,3,6,7 ו-C57BL/6 4,5,8. יתר על כן, העכברים הזכרים 3,4,7 נפוצים יותר מהנקבות, שכן לאסטרוגן יש השפעה מגנה על השמיעה. לכן, במחקר הזה השתמשנו רק בעכברים זכרים9. לאחר התייחסות לספרות, בחרנו 1 קילוהרץ ו 6 קילוהרץ כתדרים של הרעש המופעל. עוצמת הרעש שהופעל הייתה 115 dB SPL-A (המקיף את הכלוב) עד 125 dB SPL-A (במרכז הכלוב). לאחר חשיפת עכברי הניסוי לרעש ברציפות במשך 6 שעות ביום, במשך 5 ימים רצופים, עלייה אופטימלית בסף השמיעה הצביעה על היקף אופטימלי של NIHL שנוצר בעכברי הניסוי. הפעולות לטיפול בבעלי החיים, בניית מערך הניסוי וגרימת רעש מתוארות בבירור שלב אחר שלב בפרוטוקול שסופק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של Mackay Medical College. עכברי C57BL/6J זכרים בני שמונה שבועות נרכשו ממרכז חיות המעבדה הלאומי (העיר טאיפיי החדשה, טייוואן). כל העכברים גודלו ושוכנו בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של בעלי חיים.

1. השראת NIHL בעכברים

  1. הכינו את הכלוב לעכברי הניסוי
    1. לשם כך, השתמשו בכלוב מלכודת חולדות במידות של 14 ס"מ × 17 ס"מ ×-24 ס"מ. חתכו ארבע חתיכות של לוחות פלסטיק גלי לגדלים מתאימים, כך שיתאימו לכלוב (13 ס"מ × 23 ס"מ ו-13 ס"מ × 16 ס"מ).
    2. כדי למנוע מהעכברים לחתוך את רגליהם על ידי רשת הרשת, הניחו שתיים מהחתיכות בחלק התחתון ובצד האחורי, בהתאמה. הניחו את שני החלקים האחרים בניצב זה לזה, כדי לחלק את החלל בתוך הכלוב לרבעים.
  2. בצע מחקר זה בתיבה אטומה לרעש. הניחו רמקול 8.5 ס"מ לפני הכלוב, והניחו גם את הרמקול וגם את הכלוב בקופסה אטומה לרעש.
  3. פתח את תוכנת היישום CLIO
  4. העבר את הסמן לסמל הרמקול ולאחר מכן לחץ על TwoSin. הזן ושנה את הערך של Freq 1 עד 1000 Hz, Freq 2 עד 6000 Hz, ולחץ על אישור כדי להתחיל להשמיע את הצליל.
  5. תחת הכרטיסיה Leq, שנה את dBV ל- dBSPL. לאחר הגדרת השעה בממשק התוכנה, לחץ על כפתור המשולש הירוק כדי להשמיע את הצליל.
  6. מקם מיקרופון מול הרמקול במרחק של 8.5 ס"מ כדי לכייל את עוצמת הרעש (ראה קובץ משלים 1). כוונן את רמת הרעש ל- 125 dB SPL-A ונטר ברציפות במשך לא פחות מ -3 דקות כדי להבטיח שרמת הרעש יציבה מספיק. השתמש בגנרטור, אנלייזר ומגבר כדי ליצור ולשלוט ברעש. (איור 1)
    הערה: בצע שלב זה בתיבה אטומה לרעש כדי למנוע נזק לשמיעה של המפעיל.
  7. הכניסו לכלוב ארבעה עכברי C57BL/6J זכרים (אחד לכל רבע) לחשיפה לרעש. הקצו באופן אקראי את העכברים בכל רבעון במהלך החשיפה לרעש. הניחו מיקרופון על החלק העליון של הכלוב כדי לנטר את רמת הרעש במהלך החשיפה לרעש (איור 2).
    הערה: בצע שלב זה בתיבה אטומה לרעש כדי למנוע נזק לשמיעה של המפעיל.
  8. חשוף את העכברים לרעש בתדרים של 1 קילוהרץ ו-6 קילוהרץ ברציפות במשך 6 שעות ביום, במשך 5 ימים רצופים.
  9. מדוד את ספי השמיעה של העכברים יום אחד לאחר החשיפה לרעש (כלומר, ביוםהשישי ) על ידי מדידת ABR. חזור על מדידות ABR אלה שוב שבוע לאחר החשיפה לרעש (כלומר, ביום ה- 13). לאחר מדידות ABR, הקריבו את כל העכברים המעורבים וקצרו את השבלול שלהם (איור 3).

2. הערכה מבוססת תגובה שמיעתית בגזע המוח (ABR) של סף השמיעה

  1. השתמש במערכת בדיקת ABR מסחרית שתוכננה במיוחד עבור בעלי חיים קטנים10.
  2. הזרקה תוך-צפקית תערובת של טילטמין וזולאזפאם (40 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (9.3 מ"ג/ק"ג) לעכברים להרדמה כללית.
    הערה: הערכת ABR אורכת ~ 2 שעות. הקפידו לספק תמיכה תרמית באמצעות כרית חימום ומרחו משחת עיניים למניעת יובש בזמן שהעכבר נמצא תחת הרדמה.
  3. למדוד את ABR בעכבר תחת הרדמה כללית. הניחו אלקטרודות מחט תת-עורית (12 מ"מ) בקודקוד, מאחורי הפינה של האוזן השמאלית, ובחזרה ליד הזנב כדי למדוד את סף השמיעה.
  4. הציגו גירויים אקוסטיים באמצעות רמקול הממוקם במרחק של 1 ס"מ מאוזן שמאל של החיה.
  5. השתמש באוסילוסקופ כדי לשלוט בגירויים האקוסטיים. בחר Sine Wave עבור הגירויים ו- 10 k עבור קנה המידה של החלון. סובב את ידית התדר כדי לקבל את התדר הרצוי של הגירויים האקוסטיים.
  6. התאם את עוצמת הגירוי על ידי סיבוב ידית AMLP על מחולל הפונקציות. השג את עוצמת הגירוי הרצויה על ידי סיבוב ידית AMLP למתח מתאים, המחושב מכיול.
  7. אסוף את מדידות ABR תחת סדרה של עוצמות גירוי, מ 10 dB SPL ל 100 dB SPL, עם גודל צעד 10 dB.
    הערה: מדוד את סף השמיעה בתיבה אטומה לרעש. רמת עוצמת הגירוי המינימלית שיכולה ליצור גל V שניתן להבחין בו באות שנאסף הונחה כסף ABR10,11 (איור 4). לאחר הערכת ABR, עקוב אחר בעל החיים עד שהוא מתאושש מהרדמה (~ 1 שעות).

3. בדיקה מיקרוסקופית

  1. תיקון הרקמה שנקטפה
    1. לאחר מדידות ABR, להקריב את העכבר על ידי הזרקה תוך צפקית תערובת של tiletamine ו zolazepam (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (23.25 מ"ג / ק"ג) עבור הבדיקה המיקרוסקופית.
    2. קצרו את השבלול מהעכבר וטבלו אותו מיד בפורמלדהיד 10% (FA) לקיבוע (שני שבלול/מ"ל) למשך 8 שעות לפחות ב-4°C.
    3. לאחר הקיבוע, החלף את תמיסת FA בתמיסת חומצה אתילאנדיאמין-טטראצטית (EDTA) 10% להסתיידות למשך 3-4 ימים ב-4°C. לאחר מכן, בדקו כל שבלול בפינצטה כדי לוודא שהשבלול מרוכך מספיק.
    4. הניחו את השבלול בצלחת פטרי מלאה במי מלח חוצצי פוספט (PBS), וחתכו את האיבר בצורת ספירלה של קורטי (OC) (כל שבלול מסויד) לשלושה חלקים - הסיבוב הבסיסי, הסיבוב האמצעי, והתור האפי - לצביעת רקמות.
    5. תחת מיקרוסקופ מנתח (הגדלה: 8x-35x), להסיר את המבנים הגרמיים (scala vestibuli, scala tympani, ו modiolus) של שבלול decalcified ולקבל את הרקמה הרכה, כולל OC (עובי: כ 40 מיקרומטר).
  2. צביעת שבלול אימונופלואורסנציה
    1. הכנת המאגר החוסם: הכינו תמיסות אלבומין 2% בסרום בקר (BSA) ו-0.2% טריטון X-100 ב-PBS.
    2. מעבירים את הרקמה המוכתמת מצלחת הפטרי לצינור מיקרוצנטריפוגה, וטובלים את הרקמה ב-0.1 מ"ל של החיץ החוסם למשך שעתיים בטמפרטורת החדר (RT).
    3. הכנת מאגר הנוגדנים הראשוני Myo7A: יש לדלל את הנוגדן הראשוני Myo7A במאגר החוסם ביחס נפח של 1:200.
    4. טפל ברקמה בצינור המיקרוצנטריפוגה עם 100 μL של מאגר נוגדנים ראשוני Myo7A למשך שעתיים ב- RT.
    5. שטפו את הרקמה שלוש פעמים ב-PBS במשך 5 דקות כל אחת.
    6. הכנת נוגדן משני Myo7A (Myo7A-Rb-488) ונוגדן פאלואדין (phalloidin-594) חוצץ: נוגדן משני מדולל Myo7A (1:400) ונוגדן פאלואדין (1:200) במאגר החסימה.
    7. טפל ברקמה עם 100 μL של נוגדן משני Myo7A וחיץ נוגדנים phalloidin במשך 2 שעות ב RT.
    8. לאחר טיפול בנוגדנים + פלואדין יש לשטוף את הרקמה ב-PBS שלוש פעמים, למשך 5 דקות כל אחת.
    9. מעבירים את הרקמה שטופה מצינור המיקרוצנטריפוגה לצלחת פטרי מלאה PBS באמצעות פיפטת העברת פלסטיק 1 מ"ל עם קצה חתוך.
    10. כדי להתכונן לבדיקה המיקרוסקופית, פתחו את הרקמה, הניחו אותה על מגלשת זכוכית והוסיפו 15 μL של מדיום פלואורומאונט 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) על הרקמה כדי לכסות אותה במלואה. הניחו כיסוי זכוכית בעדינות על הרקמה. השאירו את המגלשה למשך הלילה ב-RT לפני שתאטמו אותה בלק.
  3. רכישת תמונות
    1. קבל תמונות דו-ממדיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף ותוכנה לרכישת תמונות.
    2. לפני ביצוע הבדיקה המיקרוסקופית יש לרכז את הרקמה בשדה הראייה ולהתאים את הרגישות ל-ISO 100. התאם את זמן החשיפה בתחילה על ידי לחיצה על כפתור המצב האוטומטי של התוכנה, ולאחר מכן כוונן ידנית על ידי לחיצה על כפתור התאם כדי למטב את יחס האות לרעש.
    3. התאם את אורך הגל של אור האירוע כדי לעורר את הפלואורופורים על ידי סיבוב קוביית הפלואורסצנטיות. צבעים מדומים שימשו לסימון הפליטה מתוויות פלואורסצנטיות שונות (אור כחול: DAPI; אור ירוק: Myo7A; אור אדום: phalloidin).
    4. על ידי סריקת דגימת הרקמה, צור ואסוף את נתוני ההדמיה כקבצי תמונה .tif ו- .jpg.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שינוי בסף השמיעה של ABR
סף השמיעה של העכברים נמדד באמצעות ABR מתפרץ טון יום אחד או שבוע לאחר החשיפה לרעש. נצפתה עלייה משמעותית בסף השמיעה בכל שלושת התדרים שנבדקו (12 קילוהרץ: 84.29 ± 2.77 dB SPL; 24 קילוהרץ: 91.43 ± 0.92 dB SPL; 32 קילוהרץ: 98.57 ± 1.43 dB SPL) יום אחד לאחר החשיפה לרעש (כלומר, היום השישי). התאוששות שמיעה חלקית התרחשה שבוע לאחר החשיפה לרעש (כלומר, היום ה-13), אך ספי השמיעה עדיין היו גבוהים ביותרמ-30 dB בכל התדרים (12 kHz: 72.86 ± 2.86 dB SPL; 24 kHz: 84.29 ± 2.77 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתן לחלק את NIHL לשני סוגים: NIHL זמני, אשר מראה שינוי זמני של סף השמיעה, ו- NIHL קבוע, אשר מתבטא בשינוי סף שמיעה קבוע. ליקוי השמיעה שראינו ביוםהשישי (יום אחד לאחר החשיפה לרעש) הוא ככל הנראה שילוב של שני סוגים אלה. במקרה זה, סף השמיעה יראה התאוששות הדרגתית לאורך זמן בשל המרכיב הזמני של ליקוי שמיעה. במחקרים הניסיוניים הראשוניים שלנו, התוצאות שהתקבלו עם אותו מערך ובעלי חיים, ליקוי השמיעה שנוצר על ידי חשיפה לרעש של יומיים התאושש לחלוטין תוך שבועיים, מה שמצביע על כך ש- NIHL קבוע לא נוצר בפועל. להיפך, במחקר זה, לי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד עניינים לחשוף.

תודות

אנו מודים למענקים ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST) של ממשלת טייוואן (MOST 110-2314-B-715-005, MOST 111-2314-B-715-009-MY3), ולמענקי מחקר פנימיים מהמכללה הרפואית Mackay (MMC-RD-110-1B-P030, MMC-RD-111-CF-G002-03).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  סט מיקרופון סטנדרטי בשדה חופשי CCP 1/4 אינץ'GRAS428158לחשיפה לרעש
מודול קלט מגבר, AMI100DBIOPACלתגובת גזע המוח השמיעתי
מגבר ביו, BIO100CBIOPACלתגובת גזע המוח השמיעתית
סרום בקר אלבומיןSIGMAA9647תוכנת צביעה אימונופלואורסצנטית
Cellensאולימפוס מדעירכישת תמונה
פלסטיק
DAPI fluoromountSouthernBiotech0100-20צביעה אימונופלואורסצנטית
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתSIGMAE5134הסרת אבדן
מגבר תגובה מעורר, ERS100CBIOPACלתגובת
גזע המוח השמיעתיתפורמלדהידAPLHAF030410קיבוע של
מערכת שבלול לרכישת נתונים בעלי ביצועים גבוהים, MP160BIOPACלתגובת גזע המוח השמיעתי
כבל מאריך מודולרי, MEC110CBIOPACלתגובת גזע המוח השמיעתית
Myo7A נוגדן ראשוניפרוטאוס25-6790נוגדן משני צביעה אימונופלואורסצנטית
Myo7AJackson immunoresearch711-545-152לצביעה אימונופלואורסצנטית
, חד קוטבית 12 mmTp, EL452BIOPACלתגובת גזע המוח השמיעתי
נוגדן פלואידיןAlexa FluorA12381אימונופלואורסצנטי מכתים
מי מלח עם חוצץ פוספטSIGMAP4417
כלוב14 ס"מ x 17 ס"מ x 24 ס"מ
ROMPUN- הזרקת קסילזין, תמיסה מגבר סאונד Bayer HealthCare, LLC
, MT-1000unikaלחשיפה לרעש
מחולל סאונד/מנתח/שונות, FW-02CLIO620300719לחשיפה לרעש
תא אטום לרעשIEA טכנולוגיה אלקטרו-אקוסטיתלחשיפה לרעש ורמקול ABR
אלקטרו-אקוסטית של IEAחשיפה לרעש
, STM100CBIOPACלתגובת גזע המוח השמיעתית
Triton X-100SIGMAT8787צינוריות צביעה אימונופלואורסצנטית
, OUT101BIOPACלתגובת גזע המוח השמיעתי
מיקרוסקופ זקוף, רכישת תמונה BX53Olympus
זולטילוירבאק
החיים גלי אלקטרודת מחט מלכודת חולדות  טכנולוגיה למודול ממריץ סט

מקורות

  1. World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481 (2021).
  2. Fernandez, K. A., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss. Neuroscience. 427, 43-57 (2020).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  4. Wang, J., et al. Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice. Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).
  5. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  6. Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy. Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).
  7. Amanipour, R. M., et al. Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).
  8. Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).
  9. Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. Estrogen and hearing: a summary of recent investigations. Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).
  10. Tsai, S. C. -S., et al. The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice. Hearing Research. 413, 108254(2022).
  11. Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood. Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).
  12. Yu, S. -K., et al. Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תנאי ניסוי מותאמים לאובדן שמיעה כתוצאה מרעש בעכברים והערכת תפקוד השמיעה ונזק לתאי השערה החיצוניים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.