Method Article

בדיקת קשירת קרבה מאפשרת זיהוי, לוקליזציה וכימות של מתילציה של חלבון ארגינין ברקמה קבועה

DOI:

10.3791/64294

⸱

July 20th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Université de Lyon, 2Inserm U1052, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 3CNRS UMR5286, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, 4Pathology Department, Centre Leon Bérard, 5Plateforme Anatomopathologie Recherche

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת קשירת קרבה היא טכניקה שימושית מאוד לאיתור וכימות מתילציה של ארגינין של חלבון נתון כאשר שאריות הארגינין שהשתנו אינן ידועות ו/או אם אין נוגדן ספציפי זמין.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתילציה של ארגינין מסתמנת כשינוי מפתח לאחר התרגום המעורב במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. המחקר שלו ברקמה מוגבל לרוב על ידי היעדר נוגדן ספציפי המזהה את שאריות ארגינין המטרה. בדיקת קשירת קרבה (PLA) פותחה במקור כדי לחקור אינטראקציות חלבון/חלבון. כאן, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול PLA המוקדש לזיהוי מתילציה של ארגינין שהחלנו על קולטן הגלוקוקורטיקואיד (GR). לאחר שהראינו בעבר כי PRMT5 dimethylates GRs בתאים, השתמשנו ב-PLA עם נוגדן דימתיל פאן-סימטרי ונוגדנים אנטי-GR כדי למדוד מתילציה של GR בגידולי שד. אנו מדגימים כי PLA מציע גישה ייחודית למדידת מתילציה של ארגינין של חלבון מטרה, גם כאשר אתר המתילציה לא זוהה. ניתן להרחיב טכניקה זו לשינויים אחרים לאחר התרגום שבהם קיימים נוגדנים יעילים למחצה. לפיכך, אנו מפרטים את טכנולוגיית ה-PLA המשמשת לזיהוי מתילציה של ארגינין ברקמה קבועה באמצעות GR כדוגמה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתילציה של ארגינין על ידי חלבון ארגינין מתילטרנספראז (PRMTs) היא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) בשפע המעורב בתהליכים ביולוגיים רבים. PRMTs מזרזים את ההעברה של קבוצות מתיל מ-S-adenosyl methionine לשאריות ארגינין. משפחת PRMT כוללת תשעה חברים המסווגים לפי סוג המתילציה שהם מבצעים. כל החברים מבצעים מונומתילציה (MMA). PRMTs מסוג 1 (PRMT1, 2, 3, 4, 6 ו-8) מזרזים דימתילציה אסימטרית (ADMA), בעוד שסוג 2 (PRMT5 ו-9) מזרז דימתילציה סימטרית (SDMA), וסוג 3 (PRMT7) מייצר רק MMA1. על ידי מתילציה של מצעים רבים, ה-PRMTs השונים מווסתים מגוון רחב של תהליכים תאיים חשובים כגון תיקון DNA, ויסות שעתוק, תגובה חיסונית, עיבוד RNA והעברת אותות 2,3. זה נכון במיוחד עבור איתות הורמון סטרואידים, שבו PRMTs משנים את פעילותם של קולטני סטרואידים על ידי מתילציה לא רק של הקולטנים עצמם אלא גם של הרגולטורים או ההיסטונים שלהם2.

מתילציה של ארגינין נחקרת בעיקר בסרטן, שכן רוב ה-PRMTs הוכחו כבעלי ביטוי יתר בסרטן בהשוואה לרקמות רגילות, וביטוים קשור לעתים קרובות לפרוגנוזה גרועה 4,5. זיהוי מתילציה של ארגינין in vivo חיוני להבנת תפקודים תאיים הקשורים לשינוי זה. זה מושג באופן קונבנציונלי על ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה (IHC) עם נוגדן ספציפי המזהה את שאריות הארגינין המתיליות. עם זאת, שיטה זו מוגבלת מאוד מכיוון שהיא מבוססת על זיהוי שאריות הארגינין ששונו ומסתמכת על יעילות הנוגדן בו נעשה שימוש. בדיקת קשירת קרבה באתרה (PLA) פותחה בתחילה כדי לחקור אינטראקציות חלבון/חלבון בתאים או רקמות קבועות6. מעניין לציין כי טכנולוגיה זו יכולה לשמש גם לאיתור PTMs באמצעות נוגדן פאן כנגד שינוי העניין, כמו גם נוגדן המזהה את החלבון הממוקד. הצוות שלנו התאים בעבר טכניקה זו לחקר מתילציה של קולטן אסטרוגן אלפא (ERα), תוך שימוש בנוגדנים נגד ERα ונוגדנים המזהה באופן ספציפי את אתר המתילציה על ארגינין 2607. יש לציין כי ניתן להרחיב טכניקה זו לנוגדנים המזהים סוג מיוחד של מתילציה גם כאשר שאריות המתיל אינן ידועות. ואכן, מספר חברות מספקות נוגדנים פאן המזהים במיוחד MMA, ADMA או SDMA שניתן להשתמש בהם בהצלחה לחקר מתילציה של חלבון in vivo.

כאן, כהוכחת רעיון, אנו מציגים ניתוח מפורט של מתילציה של GR באמצעות נוגדן SDMA בגידולי שד אנושיים מתכנון ניסיוני ועד ניתוח נתונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל. פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של המרכז לחקר הסרטן בליון.

1. בחירת הנוגדנים

  1. השתמש בנוגדנים ראשוניים שאומתו על ידי IHC או אימונופלואורסצנציה (IF).
    הערה: הנוגדנים העיקריים שנבחרו למחקר חיוניים להצלחת PLA ובמיוחד ברקמות קבועות. שימוש בנוגדנים שאומתו על ידי IHC או IF יגדיל את אחוזי ההצלחה של הניסוי. אופטימיזציה וספציפיות של נוגדנים נדרשים לפני ביצוע ניסויים, באופן אידיאלי על ידי ביצוע ניסויי בקרה בתאים שנפסלו לביטוי החלבון המעניין ושימוש במעכב ספציפי לפעילות האנזימטית של המתיל טרנספראז המעורב. כאן התנאים עברו אופטימיזציה בעבר10.

2. הכנת גלולות קו תאים משובצות פרפין

הערה: הדגימות מוטמעות בג'ל ולאחר מכן מונחות במעבד רקמות אוטומטי לייבוש דגימה והטמעת פרפין.

  1. הכן את כדור התא בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות דיסוציאציה של טריפסין.
    הערה: אין לגרד כדי לקצור תאים.
  2. השעו מחדש את גלולת התא ב-1.5 מ"ל של מי מלח חוצצים פוספט (PBS).
  3. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורת החדר (RT) ב-200 x גרם. שאפו את ה-PBS supernatant.
  4. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של פורמלין 4% ואחסנו את הצינורות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
  5. שטפו את התאים במי מלח 1X Tris-buffered-מלח (TBS).
    הערה: אל תשתמש בתמיסה מבוססת פוספט מכיוון שהיא מפרקת את הג'ל.
  6. הוסף 1 מ"ל TBS והומוגניזציה למשך 30 שניות על ידי מערבולת. צנטריפוגה למשך 5 דקות בחום של 200 x גרם והסר את הסופרנטנט.
  7. חזור על שלבים 2.5 עד 2.7 פעמיים.
  8. בצע הכללת הרקמה במעבד הרקמות האוטומטי בהתאם לתוכנית הספציפית:
    פורמלין 1 שעות 37 מעלות צלזיוס
    מים מזוקקים 2 דקות RT
    EtOH 70% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    EtOH 80% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    EtOH 95% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    EtOH 100% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    EtOH 100% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    EtOH 100% 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    קסילן 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    קסילן 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    קסילן 40 דקות 45 מעלות צלזיוס
    פרפין 1 שעות 60 מעלות צלזיוס
    פרפין 1 שעות 60 מעלות צלזיוס
    פרפין 1 שעה 30 דקות 60 מעלות צלזיוס

3. קיבוע רקמות והכנת שקופיות

  1. יש לתקן את הרקמות בפורמלין 4% למשך 24 שעות לפני ההכללה.
  2. חותכים חלקים סדרתיים בעובי 3 מיקרומטר של הבלוקים המכילים רקמות בעזרת מיקרוטום.
  3. בצע דה-פרפיניזציה עם הצביעה האוטומטית על ידי דגירה רציפה של שקופיות בקסילן (10 דקות) פעמיים, 100% אתנול (5 דקות), 95% אתנול (5 דקות) ומים (5 דקות).
  4. בצע אחזור אפיטופ המושרה על ידי חום במאגר ציטראט של 10 מ"מ באמצעות אמבט מים ב-98 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות ב-pH המתאים (בדרך כלל 6-9).
    הערה: שני הנוגדנים צריכים לעבוד באותו pH כדי שהשיטה תצליח. בוצעו מספר בדיקות לפני קביעת ה-pH האופטימלי המשמש כאן. הנוגדנים ששימשו במחקר זה הם נוגדן SDMA ונוגדני GR.
  5. הניחו לשקופיות להתקרר במשך 20 דקות, ואז שטפו אותן ב-1x PBS למשך 20 דקות.

4. ניסוי IHC

הערה: ניסויי IHC מבוצעים באמצעות מכשיר המחקר Discovery XT (טבלת חומרים) לאוטומציה ושחזור.

  1. כדי להימנע מכיבוי פרוקסידאז, השתמש במעכב הכלול בערכת דיאמינובנזידין (DAB).
  2. דגרו את השקופיות עם שני הנוגדנים העיקריים המדוללים בדילול הנוגדנים למשך 60 דקות.
  3. דגרו את השקופיות עם נוגדן פרוקסידאז צנון סוסים משני (HRP) למשך 16 דקות או נוגדן נגד עכבר למשך 30 דקות.
    הערה: מומלץ להשתמש בערכת דיאמינובנזידין מסחרית (DAB) (טבלת חומרים) לזיהוי IHC.
  4. מרחו המטוקסילין (100 מיקרוליטר / שקופית למשך 8 דקות) וכחול (100 מיקרוליטר / שקופית למשך 4 דקות) על הדגימות כדי להכתים את הגרעינים.
  5. שטפו את המגלשות במי סבון חמים, ולאחר מכן יבשו באמצעות מכתש אוטומטי והרכיבו על נעלי בית אוטומטיות באמצעות אמצעי הרכבה.

5. תגובות בדיקת קשירת קרבה

הערה: כל הריאגנטים המשמשים כלולים בערכות PLA (טבלת חומרים). מומלץ להשתמש ב -40 מיקרוליטר מגיב עבור 1 ס"מ2 של רקמה. כל הדגירה צריכה להתבצע בסביבה לחה כדי למנוע אידוי יתר. אל תאפשר לדגימה להתייבש, מכיוון שהדבר עלול להוביל לרעשי רקע. מומלץ להשתמש במאגר 1x A (מאגר כביסה באתר , טבלת חומרים) לשטיפות בצנצנות. צריך להיות נפח מינימלי של 70 מ"ל בצנצנות בעת דגירה של דגימות בתסיסה. יש לשמור דגימות ב-RT לפני השימוש.

  1. מרווה פרוקסידאז
    1. תוחמים את אזור התגובה באמצעות עט הידרופובי כדי למנוע אידוי יתר של התמיסה במהלך הניסוי. הוסף טיפה אחת של תמיסת מי חמצן לכל 1 ס"מ2 מכל דגימה. דגירה למשך 5 דקות ב-RT.
      הערה: מומלץ לייעל את זמן הדגירה בהתאם לדגימות/נוגדנים המשמשים.
  2. חסימת
    1. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד תחת תסיסה למשך 5 דקות ב-RT.
    2. הקש על המאגר הנותר A והוסף טיפה אחת לכל 1 ס"מ2 של תמיסת חסימה (כלולה בערכת PLA). יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  3. דגירה ראשונית של נוגדנים
    1. לדלל את שני הנוגדנים העיקריים בריכוזים מתאימים בדילול הנוגדנים.
    2. הסר את תמיסת החסימה מהשקופיות והוסף מיד את תמיסת הנוגדנים העיקרית (כלולה בערכת PLA). דגירה למשך שעה בתא לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. דגירה של בדיקת PLA
    1. לדלל את בדיקת ה-PLA PLUS (1:5) עם בדיקת PLA מינוס (1:5) בדילול הנוגדנים.
      הערה: מומלץ להשתמש ב-8 מיקרוליטר של בדיקת PLA מינוס מלאי (5x), 8 מיקרוליטר של בדיקת PLA בתוספת מלאי (5x) ו-24 מיקרוליטר של מדלל נוגדנים לתגובה של 40 מיקרוליטר.
    2. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT.
    3. הקש על המאגר הנותר A והחל את פתרון בדיקת ה-PLA (הכלול בערכת ה-PLA) על הדגימות. יש לדגור למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. קשירה
    1. הפשירו את מאגר הקשירה (כלול בערכת PLA) לפני השלבים הבאים.
    2. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 5 דקות ב-RT.
    3. לדלל את מאגר הקשירה פי 5 (1:5) (כלול בערכת PLA) במים בעלי טוהר גבוה. הוסף את הליגאז (1:40) (כלול בערכת PLA) מיד לפני הוספתו לדגימה.
      הערה: מומלץ להוסיף 8 מיקרוליטר של מאגר הקשירה פי 5 ל-31 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר. לאחר מכן מוסיפים 1 מיקרוליטר ליגאז.
    4. הקש על המאגר הנותר A והחל את תמיסת הליגאז על הדגימות. יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
  6. הגברה
    1. הפשירו את מאגר ההגברה לפני השלבים הבאים.
    2. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
    3. לדלל את מאגר ההגברה פי 5 (1:5) (כלול בערכת PLA) במים בטוהר גבוה. הוסף את הפולימראז (1:80) (כלול בערכת PLA) מיד לפני שטפטף אותו בעדינות על הדגימה.
      הערה: מומלץ להוסיף 8 מיקרוליטר ממאגר הקשירה פי 5 ל-31.5 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר. לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר ליגאז.
    4. הקש על המאגר הנותר A והחל את תמיסת ההגברה על הדגימות. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  7. זיהוי
    1. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
    2. לדלל את חוצץ השדה הבהיר לגילוי פי 5 (1:5) (כלול בערכת PLA) במים בטוהר גבוה.
      הערה: מומלץ להוסיף 8 מיקרוליטר ממאגר הזיהוי פי 5 ל-32 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר.
    3. הקש על המאגר הנותר A והחל את פתרון הזיהוי על הדגימות. דגירה למשך שעה ב-RT.
  8. פיתוח מצע
    1. טפטפו בעדינות את מאגר A על הדגימות ושטפו במאגר A ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
    2. לדלל את תמיסת המצע על ידי דילול ריאגנטים של המצע A (1:70), B (1:100), C (1:100) ו-D (1:50) (כלול בערכת PLA) במים בטוהר גבוה.
      הערה: מומלץ להוסיף 0.6 מיקרוליטר של מצע A, 0.4 מיקרוליטר של מצע B, 0.4 מיקרוליטר של מצע C ו-0.8 מיקרוליטר של מצע D ב-37.8 מיקרוליטר של מים בטוהר גבוה לתגובה של 40 מיקרוליטר.
    3. הקש על המאגר הנותר A והחל את תמיסת ההגברה על הדגימות. דגירה למשך 10 דקות ב-RT.
  9. צביעה גרעינית
    1. טפטפו בעדינות מים מזוקקים על הדגימות ושטפו במים מזוקקים ב-50 סל"ד למשך 2 דקות ב-RT.
    2. הקש על שארית המים המזוקקים. הוסף טיפה אחת של כתם גרעיני (כלול בערכת PLA) לכל דגימה בגודל 1 ס"מ2 ודגירה למשך 2 דקות ב-RT.
    3. שטפו את השקופיות מתחת למי ברז זורמים למשך 10 דקות כדי לתת לכתם להתבגר ולקבל צבע כחול. אין להשתמש במי ברז עומדים.
  10. התייבשות
    1. דגרו את השקופיות בתמיסה המכילה 96% אתנול פעמיים למשך 2 דקות. לאחר מכן דגרו את השקופיות בתמיסה המכילה 99.7% אתנול פעמיים למשך 2 דקות.
    2. דגרו את השקופיות בקסילן למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו את השקופיות לקסילן טרי.
  11. הרכבת המגלשות
    1. השתמש בנפח מינימלי של אמצעי הרכבה לא מימי והחל כיסוי על גבי הדגימה, כדי להבטיח שלא ייתפסו בועות אוויר מתחת לכיסויים.
    2. הניחו לשקופיות להתייבש לפני הניתוח במיקרוסקופ בעל שדה בהיר.

6. הדמיה ללוקליזציה

  1. רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ זקוף.
    הערה: במחקר זה, הדמיה של שקופיות בוצעה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר זקוף (טבלת חומרים). התמונות נרכשו בתנאים זהים בהגדלה של פי 40 עבור לפחות 10 שדות ראייה שנבחרו באופן אקראי באופן אוטומטי. מומלץ לנתח מינימום של 500 תאים לכל מצב.

7. אנליזה לכימות

הערה: כימות הדגימות בוצע באמצעות תוכנת ImageJ8. FIJI, הפצת ImageJ הכוללת את ImageJ ותוספים אחרים שהותקנו מראש, שימשה לניתוחים הבאים 9,10.

  1. כדי לקבוע את מספר הנקודות:
    1. פתח את התמונה.
    2. בצע דה-קונבולוציה של צבע. לשם כך, לחץ על תמונה > צבעים > דה-קונבולוציה של צבע.
    3. בחר תמונה: - (color_1) בשם הקובץ.
    4. השתמש בפקודה Find Maxima כדי לקבוע את מספר הנקודות (Process > Find Maxima).
  2. כדי לקבוע את מספר התאים:
    1. פתח את התמונה.
    2. בצע דה-קונבולוציה של צבע. לשם כך, לחץ על תמונה > צבעים > דה-קונבולוציה של צבע.
    3. בחר תמונה: - (color_1) בשם הקובץ.
    4. מצא סף המציג את המספר המרבי של גרעינים. לשם כך, לחץ על תמונה > בהירות/ניגודיות > סף.
    5. מלא את החורים על ידי לחיצה על תהליך > בינארי > מילוי חורים.
    6. השתמש בפקודת פרשת המים כדי לחלק רכיבים מחוברים לרכיבים נפרדים. לחץ על תהליך > בינארי > פרשת מים.
    7. נתח חלקיקים כדי לקבוע את מספר הגרעינים על ידי לחיצה על נתח > נתח חלקיקים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות ההליך המתואר לעיל, ניתן לזהות ולכמת את המתילציה של חלבון מעניין. כאן, אנו מראים את הדוגמה של מתילציה של GR על ידי PRMT5. הנוגדנים ותנאי הניסוי ל-PLA יושמו בעבר על תאים10. בקצרה, נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-GR ו-SDMA מזוהים על ידי בדיקות קרבה מצומדות עם אוליגונוקלאוטידים משלימים. לאחר מכן, הכלאה של בדיקת DNA מעגלית מתרחשת כאשר החלבונים נמצאים בסמיכות. הגברה עוקבת של דנ"א זה מודגמת על ידי HRP תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 1). התנאים האידיאליים לגילוי GR ו-PRMT5 ע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתילציה של ארגינין, כמו PTMs אחרים, תורמת לוויסות עדין של תפקודי החלבון. עם זאת, השפעתו אינה מוערכת בשל הקושי להעריך שינויים אלה, בעיקר בגלל מחסור בכלים. זה נכון במיוחד כאשר חוקרים מתילציה in vivo, כאשר הדרך היחידה למדוד מתילציה של ארגינין היא להחזיק נוגדנים ספציפיים המזהים את שאריות המתיל של החלבון המבוקש. זה מהווה בבירור מגבלה שכן יש לדעת את שאריות הארגינין המתיליות, ונוגדנים יעילים ספציפיים לשינוי חייבים להיות זמינים ליישום IHC, מה שקורה לעתים רחוקות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ל-B. Manship על הגהה של כתב היד. אנו מודים ללורה פרנקולס, קלמנטין לה נבה, פלטפורמת פתולוגיה מחקרית (CRCL) על העזרה הטכנית. איור 1 נוצר באמצעות Servier Medical Art. מחקר זה נתמך על ידי הליגההבין-לאומית למלחמה בסרטן והאגודה: 'Le Cancer du sein, parlons-en'.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
שקופיות הידבקות TOMO 90°, x100VWR631-1239
נוגדן נגד GR (עכבר)Santa Cruzsc393232
נוגדן נגד GR (עכבר)סנטה קרוזsc393232
נוגדן נגד PRMT5 (ארנב)Merck07-405
נוגדן נגד SDMA (ארנב)CST13222
אוטומציה d'הכללהLeicaASP 6025חדירת פרפין והכנת בלוק
Autostainer XLLeicaST5010קלטות Autostainer
path macrostar III  x1500VWR720-2233
CC1Roche5279801001
Citrate Buffer pH 6 10x, 100 mLMMFF / T0050
מדלל נוגדנים DakoDako AgilentS202230-2מדלל נוגדנים
Discovery ChromoMap Diaminobenzidine (DAB) ערכתRoche760-159Diaminobenzidine (DAB) ערכת
Discovery WashRoche7311079001
Duolink insitu  בדיקת PLA נגד עכבר מינוססיגמא-אולדריץ'DUO92004PLA  ערכה (בדיקה נגד ארנב מינוס)
Duolink insitu זיהוי ריאגנטים brightfieldSigma-AldrichDUO92012PLA  ערכה (ריאגנטים לזיהוי באתר)
Duolink insitu PLA בדיקה נגד ארנב בתוספתSigma-AldrichDUO92002PLA  ערכה (בדיקה נגד ארנב פלוס)
Duolink insitu לשטוף מאגר brightfieldערכת Sigma-AldrichDUO82047PLA  (מאגר כביסה באתר)
אתנול 96% VOL TECHNISOLV, 5 ליטרVWR83804.360
אתנול מוחלט ≥ 99.8%, AnalaR NORMAPUR ACS,  5 ליטרVWR20821.365
EZ Prep 10xRoche5279771001
Formol, מוכן לשימוש, 5 ליטרMMFF/40877-36פורמלין
כיסוי זכוכית אוטומטי לחלוטין LeicaCV5030כיסוי אוטומטי כיסויי
זכוכית 24 x 40Dutscher100037
HematoxylinVentana760-2021
מכשיר IHCRocheDISCOVERY XTאוטומציה של IHC
LCSRoche5264839001
MicrotomeThermo ScientificMicrom HM340Eחיתוך הרקמות כולל בלוקים
הרכבה בינונית PertexHistolab00801-FR
עט PAP לצביעה חיסוניתSigma-AldrichZ672548-1EA
שעוות פרפין tek III, 4 x 2, 5 ק"גסאקורה4511
פסטר פיפטות חד פעמיותפישר סיינטיפיק12583237
PBS מאגר 10x, 100 מ"לMMFf / T0020
מאגר תגובה 10xרוש5353955001
ריבו לשטוף 10xרוש5266262001
RiboCC1רוש
נוגדן משני נגד עכברAbcamab133469
נוגדן משני OmniMap נגד ארנב HRPRoche760-4311
מרכז הטמעת רקמותMMFEC 350
קסילן (תערובת של איזומרים) ≥ 98.5%, AnalaR NORMAPUR ACS, 5 LVWR28975.360
Zeiss Axio Imager M2 מיקרוסקופשדה בהיר זקוף
Q 5266297001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  2. Malbeteau, L., et al. How protein methylation regulates steroid receptor function. Endocrine Reviews. 43 (1), 160-197 (2021).
  3. Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
  4. Poulard, C., Corbo, L., Le Romancer, M. Protein arginine methylation/demethylation and cancer. Oncotarget. 7 (41), 67532-67550 (2016).
  5. Hwang, J. W., et al. Protein arginine methyltransferases: promising targets for cancer therapy. Experimental & Molecular Medicine. 53 (5), 788-808 (2021).
  6. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  7. Poulard, C., et al. Activation of rapid oestrogen signalling in aggressive human breast cancers. EMBO Molecular Medicine. 4 (11), 1200-1213 (2012).
  8. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Pham, T. H., Le Romancer, M. Using proximity ligation assay to detect protein arginine methylation. Methods. 175, 66-71 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Proximity Ligation AssayArginine MethylationProtein MethylationFixed TissuePost Translational ModificationGlucocorticoid ReceptorPRMT5 DimethylationPan Dimethyl AntibodyProtein LocalizationProtein Quantification
Video Coming Soon

Related Articles