המטרה כאן היא להתוות פרוטוקול לחקר המנגנונים של דיסביוזיס במחלות לב וכלי דם. מאמר זה דן כיצד לאסוף ולהשתיל דגימות צואה של מורין, לבודד מעיים ולהשתמש בשיטת "סוויס-רול", ואחריה טכניקות של צביעת מערכת החיסון כדי לחקור שינויים במערכת העיכול.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
דיסביוזה של מיקרוביוטת המעי ממלאת תפקיד בפתופיזיולוגיה של הפרעות קרדיווסקולריות ומטבוליות, אך המנגנונים אינם מובנים היטב. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת תפקיד ישיר של המיקרוביוטה הכוללת או מינים מבודדים בפתופיזיולוגיה של מחלות. זוהי אפשרות טיפול בטוחה עבור חולים עם זיהום חוזר Clostridium difficile . מחקרים פרה-קליניים מראים כי מניפולציה של מיקרוביוטת המעי היא כלי שימושי לחקר הקשר המכניסטי בין דיסביוזה למחלות. השתלת מיקרוביוטה בצואה עשויה לעזור להבהיר טיפולים חדשניים הממוקדים במיקרוביוטה של המעי לניהול וטיפול במחלות לב-מטבוליות. למרות אחוזי הצלחה גבוהים במכרסמים, עדיין קיימים שינויים תרגומיים הקשורים להשתלה. המטרה כאן היא לספק הדרכה בחקר ההשפעות של מיקרוביום המעי במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. במחקר זה מתואר פרוטוקול מפורט לאיסוף, טיפול, עיבוד והשתלה של מיקרוביוטה צואתית במחקרי מורין. שלבי האיסוף והעיבוד מתוארים הן עבור תורמים אנושיים והן עבור תורמי מכרסמים. לבסוף, אנו מתארים שימוש בשילוב של טכניקות גלגול וצביעת חיסון שוויצריות כדי להעריך מורפולוגיה ספציפית למעי ושינויים בשלמות במחלות לב וכלי דם ובמנגנוני מיקרוביוטה קשורים של המעי.
מבוא
הפרעות קרדיומטבוליות, כולל מחלות לב ושבץ, הן סיבות המוות המובילות בעולם1. חוסר פעילות גופנית, תזונה לקויה, גיל מתקדם וגנטיקה מווסתים את הפתופיזיולוגיה של הפרעות אלה. עדויות מצטברות תומכות ברעיון שמיקרוביוטת המעי משפיעה על הפרעות לב וכלי דם והפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג2, השמנת יתר3 ויתר לחץ דם4, מה שעשוי להיות המפתח לפיתוח גישות טיפוליות חדשות למחלות אלה.
המנגנונים המדויקים שבאמצעותם המיקרוביוטה גורמת למחלות עדיין אינם ידועים, והמחקרים הנוכחיים משתנים מאוד, בין היתר בשל הבדלים מתודולוגיים. השתלת מיקרוביוטה בצואה (FMT) היא גישה רבת ערך להגדרת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ונדרבילט אישרה את כל ההליכים המתוארים בכתב יד זה. עכברים זכרים C57B1/6 בגיל 3 חודשים, שנרכשו ממעבדת ג'קסון, שוכנו וטופלו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. איסוף, אחסון ועיבוד של דגימות צואה אנושיות
- איסוף דגימת צואה, באמצעות מיכל סטרילי אם הנושא נמצא במרפאה. יש לשמור בקירור את דגימות הצואה בטמפרטורה של 4°C תוך 36 שעות מהאיסוף עד שהן מוכנות לעיבוד. לחלופין, איסוף דגימות צואה באמצעות כלי זמין מסחרית ליציבות DNA קלה ומורחבת בטמפרטורת הסביבה, במיוחד לשימוש ביתי.
- יש לחטא קולט אדים ברמת בטיחות ביולוגית בתמיסת אקונומיקה 10%, או חומר חיטוי אחר שאושר ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השלבים המתוארים לעיל מסוכמים באיור 1. תוכן cecal עכבר או צואת אדם הם resuspended במי מלח סטריליים כדי להכין slurry לתת לעכברים ללא חיידקים (100 μL) על ידי gavage, תחילה במשך 3 ימים רצופים, ולאחר מכן פעם כל 3 ימים. בסוף הפרוטוקול, לחץ הדם נמדד בשיטת שרוול הזנב, עכברים מומתים ורקמות נקצרות להערכת שינויים במיקרוביוטה של המעי ושינויים קרדיווסקולריים ומטבוליים.
שלב מפתח בבחירת המיקרוביוטה הוא לוודא שפנוטיפ המחלה המעניין נמצא אצל התורם וקשור לשינויים דיסביוטיים. לדוגמה,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גישה חשובה לחקר התפקיד הסיבתי של מיקרוביוטת המעי במחלות לב וכלי דם ומחלות מטבוליות היא להעביר את המיקרוביוטה הכוללת או מינים נבחרים בעלי עניין לעכברים נטולי חיידקים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאיסוף דגימות צואה מבני אדם ומעכברים ששוכנו באופן קונבנציונלי בעכברים נטולי חיידקים כדי לחקור את תפקיד המיקרוביוטה של המעי בהפרעות יתר לחץ דם.
בעכברים, אנו משתמשים בתוכן צקלי שנאסף באופן אספטי המעובד בתא אירובי, ובבני אדם, אוספים צואה. ניתן לבצע FMT באופן מיידי כאשר הדגימה עדיין טרייה או קפואה בחנקן .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא מוצהרים ניגודי עניינים, כספיים או אחרים, על ידי המחברים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (ל- A.K.) מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום; מענק איגוד הלב האמריקאי POST903428 (ל- J.A.I.); ומענקים של המכון הלאומי ללב, ריאות ודם K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (לא.ק.), ומענק NIH 1P01HL116263 (ל- V.K). איור 1 נוצר באמצעות Biorender.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| תא אנאירובי | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| מספריים לעורקים - קצה כדורי | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| תמיסת אקונומיקה | פישר סיינטיפיק | 14-412-53 | |
| סרום בקר אלבומין | פישר סיינטיפיק | B14 | |
| CD3 נוגדן | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 נוגדן חד שבטי | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| צנטריפוגה | פישר סיינטיפיק | 75-004-221 | |
| צג תפוקה גבוהה CODA | Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| בקבוקונים קריוגניים | פישר סיינטיפיק | 10-500-26 | |
| פיפטות העברת בוגר חד פעמיות | פישר מדעי | 137119AM | |
| מזרקים חד פעמיים | פישר סיינטיפיק | 14-823-2A | |
| אתנול | פישר | AA33361M1 | |
| מדעי מחט האכלה | כלים מדעיים עדינים | 18061-38 | |
| גיליון נייר סינון | פישר סיינטיפיק | 09-802 | |
| פורמלין (10%) | פישר סיינטיפיק | 23-730-581 | |
| דיאטה עתירת מלח | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| מיני משאבות אוסמוטיות | Alzet | דגם 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| צלחת פטרי | פישר סיינטיפיק | AS4050 | |
| טיפים פיפטה | פישר סיינטיפיק | 21-236-18C | |
| פיפטות | פישר סיינטיפיק | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered מלח | פישר סיינטיפיק | AAJ61196AP | |
| מרית חכמה | פישר סיינטיפיק | NC0133733 | |
| מכשיר איסוף צואה | פישר סיינטיפיק | 50-203-7255 | |
| TBS מאגר | פישר סיינטיפיק | R017R.0000 | |
| טריטון X-100 | Millipore סיגמא | 9036-19-5 | |
| נדנדה פלטפורמת Varimix פישר | סיינטיפיק | 09047113Q | |
| מערבל מערבולת | פישר סיינטיפיק | 02-215-41 | |
| קסילן | פישר סיינטיפיק | 1330-20-7, 100-41-4 |
מקורות
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes:....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
