מאמר שיטה

הפרדה ואיסוף אוטומטיים של חומרים הקשורים לסרטן מדגימות קליניות

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64325

⸱

13 בינואר 2023

 ,  ,  , 
1Clinomics Inc.

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר את היישום של ציוד אוטומטי כדי להפריד ולאסוף בקלות וביעילות, כגון DNA ללא תאים ותאי גידול במחזור, מדם שלם.

תקציר

לאחרונה, ביופסיות נוזליות שימשו לאבחון מחלות שונות, כולל סרטן. נוזלי גוף מכילים חומרים רבים, כולל תאים, חלבונים וחומצות גרעין שמקורם ברקמות רגילות, אך חלק מחומרים אלה מקורם גם באזור החולה. החקירה והניתוח של חומרים אלה בנוזלי הגוף ממלאים תפקיד מרכזי באבחון מחלות שונות. לכן, חשוב להפריד במדויק את החומרים הנדרשים, וכמה טכניקות מפותחות לשימוש למטרה זו.

פיתחנו סוג מעבדה על דיסק של מכשיר ופלטפורמה בשם CD-PRIME. מכשיר זה הוא אוטומטי ויש לו תוצאות טובות עבור זיהום מדגם ויציבות הדגימה. יתר על כן, יש לו יתרונות של תשואת רכישה טובה, זמן פעולה קצר, ושכפול גבוה. בנוסף, בהתאם לסוג הדיסק שיש להרכיב, ניתן להפריד פלזמה המכילה DNA ללא תאים, תאי גידול במחזור, תאים חד-גרעיניים של דם היקפי או ציפויי באפי. לפיכך, רכישת מגוון חומרים הנמצאים בנוזלי הגוף יכולה להיעשות עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל המחקר של omics.

מבוא

גילוי מוקדם ומדויק של מחלות שונות, כולל סרטן, הוא הגורם החשוב ביותר בקביעת אסטרטגיית טיפול 1,2,3,4. בפרט, גילוי מוקדם של סרטן קשור קשר הדוק עם סיכויי הישרדות מוגברים עבור המטופל 5,6,7,8. לאחרונה, ביופסיות נוזליות היו באור הזרקורים לגילוי מוקדם של סרטן. גידולים מוצקים עוברים אנגיוגנזה ומשחררים חומרים שונים לדם. בפרט, דנ"א במחזור (ctDNAs), רנ"א במחזור (ctRNAs), חלבונים, שלפוחיות כגון אקסוזומים ותאי גידול במחזור הדם (CTCs) נמצאו בדמם של חולי סרטן 2,9. למרות שיש הבדלים בכמות החומרים הללו, הם נצפים בעקביות לא רק בשלבים המוקדמים אלא גם בשלבים מאוחרים יותר 6,10. עם זאת, הבדלים בודדים אלה הם גבוהים מאוד; לדוגמה, כמות הדנ"א נטול התאים (cfDNA) המכילה ctDNA היא פחות מ-1,000 ננוגרם, ומספר ה-CTCs קטן מ-100 ב-10 מ"ל של דם שלם מחולי סרטן11,12,13. מחקרים רבים אפיינו סרטן בשימוש בחומרים אלה בכמויות קטנות יותר (כלומר, cfDNA, ctDNA ו- CTCs). כדי להשיג תוצאות מדויקות, חשוב להפריד במדויק כמויות קטנות של חומרים עם טוהר גבוה13,14. שיטות צנטריפוגה קונבנציונליות משמשות בדרך כלל, אך הן קשות לטיפול ויש להן טוהר נמוך בהתאם למיומנות המשתמש. מאז גילוי ה-CTCs, פותחו מספר טכניקות הפרדה, כגון צנטריפוגה או הפרדת דרגות צפיפות, אימונובייד ושיטות מיקרופלואידיות. מספר טכניקות הכלה פותחו מאז גילוי CTCs. עם זאת, טכניקות אלה מוגבלות לעתים קרובות כאשר יש צורך לבודד תאים מן השבבים השונים ואת הממברנות המשמשים לבודד אותם15. כמו כן, שיטות התיוג דורשות ציוד כגון FACS, ויש מגבלות לתהליך במורד הזרם עקב זיהום תיוג.

לאחרונה, השימוש בביופסיות נוזליות גדל, ומחקרים שונים נערכים לגילוי מוקדם של סרטן. למרות ששיטה זו פשוטה, עדיין ישנם קשיים בניתוח במורד הזרם, ומחקרים שונים מנסים להתגבר על קשיים אלה16,17. בנוסף, אתרים רבים, כולל בתי חולים, דורשים שיטות אוטומטיות, ניתנות לשחזור וטוהר גבוה הנוחות לשימוש. כאן פיתחנו מעבדה על דיסק להפרדה אוטומטית של חומרים מדגימות דם לאחר ביופסיה נוזלית. התקנים אלה מבוססים על העיקרון של צנטריפוגה, מיקרופלואידיקה ולכידת תאים בגודל נקבוביות. ישנם שלושה סוגים של דיסקים: LBx-1 יכול לרכוש פלזמה וציפוי באפי, בעוד LBx-2 יכול לרכוש פלזמה ו- PBMC מדם שלם עם נפח של פחות מ -10 מ"ל; FAST-auto יכול גם לרכוש CTCs באמצעות קרום הניתן להסרה מהדיסק. ניתן להשתמש בעד ארבעה מכל דיסק בהפעלה אחת. מעל לכל, היתרון של מכשיר ושיטה זו הוא כי הוא יכול לקבל מגוון רחב של חומרים שמקורם בסרטן מאותה דגימה באמצעות כמות קטנה של דם. משמעות הדבר היא כי הדם של המטופל רק צריך להיות נמשך פעם אחת. בנוסף, יש לו את היתרון של אי הכללת טעויות עקב הבדלים בתקופת דגימת הדם. פלטפורמה זו קלה לשימוש ומספקת תוצאות מדויקות עבור ביופסיות נוזליות ויישומים במורד הזרם. בפרוטוקול זה, השימוש במכשיר ובמחסנית מוצג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל דגימות הדם השלמות התקבלו מחולי סרטן ריאות. המחקר והניתוח בקלינומיקס מתבצעים על ידי המכון לחקר גנומיקה של סרטן, ואישור מחקר IRB על ידי הממשלה מובל על ידי ועדת הביקורת המוסדית של המרכז הרפואי אסאן (IRB NO. 2021-0802) עם מספר IRB רשום למחקר בקלינומיקס.

1. הכנת מדגם

  1. אסוף 9 מ"ל של דם שלם לתוך צינור איסוף דם יציב EDTA או cfDNA.
  2. מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור למעלה ולמטה כ-10 פעמים.
  3. אחסנו את הדגימות בטמפרטורת החדר (RT; לאחסון לטווח קצר) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (לאחסון לטווח ארוך). אין להקפיא ולהפשיר.

2. הכנת המכשיר

  1. לחץ על מתג ההפעלה כדי להפעיל את המכשיר.
    הערה: מסך טעינה מופיע בלוח המגע, והכלי מאותחל. יש להרחיק את הידיים מהמכשיר במהלך האתחול. מסך בחירת המחסנית מופיע לאחר השלמת אתחול המכשיר.
  2. בחר את המצב לדוגמה לשימוש. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על החץ.

3. הפעלת המכשיר ואיסוף הדגימות

  1. העמסת מחסנית LBx-1
    1. בחר את סוג המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
    2. פתח את דלת המכשיר והכנס את כל המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית. הקפד להכניס כראוי את המחסנית ואת מחזיק המחסנית. אם המחסנית אינה מוכנסת כראוי, הדבר עלול לגרום נזק ניכר למכשיר.
    3. לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
    4. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה.
    5. סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך לוח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על מחסניות, אשר לוקח כ 30 שניות.
    6. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה ולהסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.
    7. מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את כל דגימת הדם. פיפטה מקסימום של 10 מ"ל של דגימת דם שלמה באמצעות פיפטה סרולוגית.
      אזהרה: סכנות הטיפול בדם. במהלך כל הליך הטיפול בדגימות דם וריאגנטים, חשוב ללבוש מעיל מעבדה וכפפות מעבדה. MSDS בתנאי צריך להיות נחקר ביסודיות על ידי עובדי המעבדה.
    8. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
      הערה בעת שימוש ביותר או שווה ל-9 מ"ל של דגימת דם שלמה, אין צורך בתוספת מלח עם מאגר פוספט (PBS). בעת שימוש בפחות מ-9 מ"ל של דגימת דם שלמה, הוסף PBS כדי להפוך את הנפח הכולל ל-9 מ"ל. לדוגמה, בעת שימוש ב- 7.2 מ"ל של דם שלם, אנא הוסף 1.8 מ"ל של PBS לכניסת הדגימה. פיפטה סרולוגית או קצה פיפטה יכולים לשמש להזרקת דם שלם ו- PBS. בעת שימוש בפחות מ-8 מ"ל של דגימת דם שלמה, ייתכן שלא ניתן לשחזר את הפרווה של באפי אפילו על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS. להכנת gDNA, השתמש ב-200 μL של דם שלם, שהופרד לפני שלב זה.
    9. הכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר במחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
      הערה: פלזמה ופרווה באפי מופרדות מדם שלם באופן אוטומטי, מה שאורך כ-30 דקות.
      שים לב סכנה במהלך הפעולה. פתיחת הדלת או נגיעה במכשיר במהלך פעולות סיבוב במהירות גבוהה עלולה לגרום לפציעות חמורות. קיים גם סיכון לפציעה עקב העמסה אסימטרית של הרוטור. אם רעידות ורעשים חריגים מתרחשים כאשר המכשיר מתחיל בהעשרת תאים בסיוע או במצב מומחה, מיקום המחסנית עשוי להיות לא סימטרי. לחץ מיד על מקש ההפעלה כדי לעצור ולהתקין כראוי את המחסנית.
    10. חפשו את ההודעה על המסך המלווה בצליל אזעקה, המופיע כאשר ההפרדה בין הפלזמה למעיל באפי הושלמה.
    11. עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP . פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן.
    12. לשחזר 3 מ"ל של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. שחזר את ציפוי באפי של 3 מ"ל משקע מעיל באפי באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
  2. טעינת מחסנית LBx-2
    1. בחר את שם המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
    2. פתח את הדלת והכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית.
    3. לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
    4. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. הקפד להכניס כראוי את המחסנית למחזיק המחסנית. אם המחסנית אינה מוכנסת כראוי, הדבר עלול לגרום נזק ניכר למכשיר.
    5. סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך לוח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על המחסנית, אשר לוקח כ 30 שניות.
    6. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה, להסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית ולהניח אותה על השולחן.
    7. מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את תמיסת שיפוע הצפיפות ואת כל דגימת הדם. בדוק את נפח תמיסת שיפוע הצפיפות ואת PBS שיש להזריק בהתאם לנפח דגימת הדם כולה (טבלה משלימה 1).
    8. פיפטה את תמיסת גרדיאנט הצפיפות באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך פתח הכניסה של המחסנית והזרק באיטיות את תמיסת שיפוע הצפיפות.
    9. לאחר הזרקת תמיסת שיפוע הצפיפות, פיפטה את כל דגימת הדם באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
      הערה: בעת שימוש בפחות מ-9 מ"ל מדגימת הדם כולה, הוסף PBS על-ידי הפניה לטבלה זו (טבלה משלימה 1).
    10. הכנס את המחסניות לשימוש לפי המספר על מחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
    11. פלזמה ו- PBMC מופרדים מדם שלם באופן אוטומטי, מה שלוקח בערך 30 דקות. חפש את ההודעה המופיעה מלווה בצליל אזעקה, כאשר הפרדת הפלזמה וה- PBMC הושלמה.
    12. עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP . פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן.
    13. לשחזר 3 מ"ל של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. שחזר 3 מ"ל של PBMC משקע PBMC באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
  3. טעינת מחסנית FAST-auto
    1. בחר את המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
    2. פתח את הדלת והכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית. לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
    3. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה.
    4. סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך משטח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על המחסנית, אשר לוקח כ 30 שניות.
    5. עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה ולהסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.
    6. מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את תמיסת ה- PBS ודגימת דם שלמה. פיפטה 6 מ"ל של תמיסת PBS באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת ה- PBS של המחסנית והזרק באיטיות 6 מ"ל של תמיסת PBS.
    7. לאחר הזרקת תמיסת PBS, פיפטה 3 מ"ל של דם שלם או דגימת PBMC שהתקבלה מ- LBx-2 באמצעות פיפטה סרולוגית, אשר נשטפה בעבר עם 1% BSA כדי למנוע הידבקות של שאריות. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
    8. הכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר במחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
    9. CTCs מועשרים מדם שלם באופן אוטומטי, אשר לוקח בערך 15 דקות. חפש הודעה שמופיעה מלווה בצליל אזעקה עם השלמת העשרת ה- CTCs. עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP .
    10. פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן. הכנס את מסיר הלוח האחורי (BPR) לארבעת החורים בחזית המחסנית. לחץ על הכנף הכחולה כהה עם האגודלים של שתי הידיים, ולאחר מכן לחץ על הגוף הכחול בהיר עד שהוא לוחץ.
    11. הסר בזהירות את גוף המחסנית על ידי הרמתה. מרימים בעדינות רבה את קרום המסנן עד הקצה באמצעות פינצטה. אנא הקפידו להשתמש בשפה החיצונית (החלק בעל הקצה הרחב של 1 מ"מ) של קרום המסנן כדי לצבוט ולהחזיק את קרום המסנן.
    12. בזהירות למקם את קרום המסנן (שעליו CTCs מועשרים שוכנים) לתוך צינור 1.5 מ"ל להכנת חומצת גרעין. במידת הצורך, לשחזר את הדם מסונן לשקע הדם באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל.

4. תחזוקת המערכת

  1. הכנה לניקוי וחיטוי המכשיר
    1. נקו את כל המשטחים הנגישים של המכשיר והאביזרים פעם בשבוע באמצעות אתנול ורקמות מיובשות, וגם מיד כאשר מזוהמים.
    2. נקו את הקערה ואת פיר הרוטור באופן קבוע באמצעות אלכוהול (אתנול ואיזופרופנול) או חומרי חיטוי על בסיס אלכוהול.
  2. ניקוי וחיטוי המכשיר
    הערה: לפתרון בעיות כלליות ולהערות אחרות במחשב, עיין בטבלה משלימה 2.
    1. כבה את המכשיר באמצעות מתג ההפעלה הראשי. נתק את תקע החשמל מספק הכוח.
    2. פתחו את הדלת ונקו וחטאו את כל המשטחים הנגישים של המכשיר, כולל כבל החשמל, באמצעות מטלית לחה וחומרי הניקוי המומלצים.
    3. בדוק את פיר הרוטור עבור נזק. בדוק את המכשיר עבור קורוזיה ונזק.
    4. חבר את המכשיר לספק הכוח רק אם הוא יבש לחלוטין מבפנים ומבחוץ.
  3. נתקו את תקע החשמל הראשי והסירו את מחזיק הנתיכים. מחזיק הנתיך ממוקם מעל שקע החשמל. החלף את הנתיך המשומש בנתיך רזרבי מהמיכל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המטרה של טכניקה זו היא לבודד בקלות ובאופן אוטומטי חומרים הקשורים לסרטן מדם שלם. בפרט, כל אחד יכול להשתמש בטכניקה זו בכל תחומי המחקר והניתוח המתאימים. ההפרדה בו זמנית וניתנת לשחזור של חומרים מרובים בדגימת דם אחת היא משמעותית בביופסיות נוזליות. דיסקיות LBx-1 ו- LBx-2 משמשות לבידוד פלזמה וציפוי בא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכמות והריכוז של cfDNA ו- CTC תלויים באדם, בשלב ובסוג הסרטן. זה גם תלוי במצבו של המטופל 2,4,5,10,20. בפרט, בשלבים המוקדמים או הטרום סרטניים של סרטן, הריכוזים של חומרים הקשורים לסרטן הם נמוכים מאוד, ולכן קיימת אפש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.

תודות

כתב יד זה נתמך בחלקו על ידי הקרן לפיתוח מכשור רפואי בקוריאה (KMDF, מענק מס 'RS-2020-KD000019) והמכון לפיתוח תעשיית הבריאות של קוריאה (KHIDI, מענק מס' HI19C0521020020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1% BSA (אלבומין סרום בקר)Sigma-AldrichA3059
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהAxygenMCT-150-C-S
15 מ"ל צינור חרוטיSPL50015
4150 TapeStation SystemAgilentG2992AAסרט מסך DNA נטול תאים (Agilent, 5067-5630), מאגר דגימת DNA ללא תאים (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax ערכת בידוד DNA ללא תאים ביעילות גבוהה השליחA17622-2505 מ"ל X 50 גרסת הכנה
BD שפופרות איסוף דםBD367525EDTA (10 מ"ל)
BioViewCCBSClinomicsBioView Clinomics-Customized Bioview System. ציוד התאמה אישית מבוסס מיקרוסקופ Allegro Plus
CD45 נוגדן חד שבטי (HI30), PE-Alexa Fluor 610InvitrogenMHCD4522
FAST Auto מחסניתClinomicsCLX-M3001
LBx-1 מחסניתClinomicsCLX-M4101
LBx-2 מחסניתClinomicsCLX-M4201
OPR-2000 מכשירClinomicsCLX-I2001
כיסוי זכוכיתMarienfeld SuperiorHSU-0101040
DynaMag 2 מגנט מעמדתרמו פישר מדעי12321D
Ficoll Paque SolutionGE healthcare17-1440-03צפיפות שיפוע
פתרון קצה מסנן, 10 ומיקרו; LAxygenAX-TF-10קצות פיפטה עם מחסומי אירוסול מומלצים כדי לסייע במניעת זיהום צולב.
קצה מסנן, 200 ומיקרו; LAxygenAX-TF-200קצות פיפטה עם מחסומי אירוסול מומלצים כדי לסייע במניעת זיהום צולב.
קצה מסנן, 100 ומיקרו; LAxygenAX-TF-100קצות פיפטה עם מחסומי אירוסול מומלצים כדי לסייע במניעת זיהום צולב.
קצה מסנן, 1000 ומיקרו; LAxygenAX-TF-1000קצות פיפטה עם מחסומי אירוסול מומלצים כדי לסייע במניעת זיהום צולב.
FITC אנטי-אנושי CD326 (EpCAM) נוגדןBioLegend324204
FITC עכבר אנטי-אנושי ציטוקרטיןBD Biosciences347653
תמיסת פורמלדהיד (35% משקל ב-H2O)Sigma Aldrich433284
Kimtech Science מגביםיוהאן-קימברלי41117
כפפת לטקסMicroflex63-754
מתלה להפרדת חרוזים מגנטייםV& P ScientificVP 772F2M-2
צנרת ידנית  (0.5-10 ומיקרו; L)Eppendorf3120000020
צנרת ידנית  (2-20 ומיקרו; L)Eppendorf3120000038
צנרת ידנית  (10-100 ומיקרו; L)Eppendorf3120000046
צנרת ידנית  (20-200 ומיקרו; L)Eppendorf3120000054
צנרת ידנית  (100-1000 ומיקרו; L)Eppendorf3120000062
מדיום הרכבה עם DAPI - מימי, Fluoroshieldabcamab104139
בקרת IgG אנושית רגילהR& D Systems1-001-A
OLYMPUS BX-UCBOlympus9217316
Pan Cytokeratin נוגדן חד שבטי (AE1/AE3), Alexa Fluor 488Invitrogen53-9003-82
PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט)Corning21-040CVC
נייד Pipet AidDrummond4-000-201
זכוכית שקופיותMarienfeld SuperiorHSU-1000612
StainTray Staining BoxSimportM920
פיפטה סרולוגית סטרילית (10 מ"ל)SPL91010
Triton  תמיסת X-100סיגמא אולדריץ'93443
TWEEN  20Sigma AldrichP7949
דםמאוחסן בטמפרטורה של 4-8 מעלות; C על ידי איסוף בצינור יציב EDTA או cfDNA: אם הדם כולו אינו מספיק ב-9 מ"ל, הוסף PBS (מי מלח עם פוספט) לפי הצורך.
X-Cite 120Q (תאורת מנורת פלואורסצנטי)Excelitas010-00157
מלא

מקורות

  1. Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
  2. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  3. Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
  4. Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
  5. Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
  6. Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
  7. Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
  8. Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
  9. Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
  10. Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
  11. Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
  12. Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
  13. Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
  14. Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
  15. Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
  16. Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
  17. Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
  18. Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
  19. Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
  20. Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
  21. Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
  22. Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
  23. Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
  24. Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
  25. Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
  26. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
  28. Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
  29. Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
  30. Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

191

מאמרים קשורים