מאמר שיטה

מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64340

⸱

30 בנובמבר 2022

 ,  , 
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology, Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן פותחה מערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על ידי ננו-ברים כדי לספק קרום סינתטי עם עקמומיות מוגדרת המאפשרת אפיון של חלבונים בעלי יכולת חישת עקמומיות במבחנה.

תקציר

עקמומיות הממברנה ממלאת תפקידים חשובים בתהליכים חיוניים שונים של תאים, כגון נדידת תאים, חלוקת תאים וסחר בשלפוחית. הוא לא רק נוצר באופן פסיבי על ידי פעילויות תאיות, אלא גם מווסת באופן פעיל אינטראקציות חלבון ומעורב באיתות תוך תאי רבים. לפיכך, יש ערך רב לבחון את תפקידה של עקמומיות הממברנה בוויסות ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים. לאחרונה פותחו טכניקות רבות לחקר הקשר בין הממברנה המעוקלת לחלבון במבחנה. בהשוואה לטכניקות מסורתיות, דו-שכבת השומנים (SLB) הנתמכת על ידי ננו-ברים שפותחה לאחרונה מציעה הן תפוקה גבוהה והן דיוק טוב יותר ביצירת עקמומיות הממברנה על ידי יצירת דו-שכבה רציפה של שומנים על מערכים מעוצבים של ננו-מוטות עם עקמומיות ממברנה מוגדרת מראש ובקרה שטוחה מקומית. ניתן לאפיין הן את נזילות השומנים והן את רגישות החלבון לממברנות מעוקלות באמצעות הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית. כאן מוצג הליך מפורט כיצד ליצור SLB על משטחי זכוכית מפוברקים המכילים מערכי ננו-מוטות ואפיון חלבונים רגישים לעקמומיות על SLB כזה. בנוסף, פרוטוקולים לשימוש חוזר בננו-שבבים ועיבוד תמונה מכוסים. מעבר לננו-בר-SLB, פרוטוקול זה ישים בקלות לכל סוגי שבבי הזכוכית הננו-מובנים למחקרי חישת עקמומיות.

מבוא

עקמומיות הממברנה היא פרמטר פיזיקלי קריטי של התא המתרחש במגוון תהליכים תאיים כגון מורפוגנזה, חלוקת תאים ונדידת תאים1. כיום ידוע כי עקמומיות הממברנה היא מעבר לתוצאה פשוטה של אירועים תאיים; במקום זאת, הוא התגלה כרגולטור יעיל של אינטראקציות חלבונים ואיתות תוך-תאי. לדוגמה, מספר חלבונים המעורבים באנדוציטוזה בתיווך קלתרין נמצאו נקשרים באופן מועדף לממברנה המעוקלת, וכתוצאה מכך נוצרה נקודה חמה לאנדוציטוזה2. ישנם גורמים רבים ושונים לדפורמציה של הממברנה כגון משיכת ממברנה על ידי כוחות השלד הציטוסקטלי, נוכחות של אסימטריה של שומנים עם קבוצות ראש בגדלים שונים, קיומם של חלבונים טרנסממברניים בעלי צורה חרוטית, הצטברות של חלבונים מעצבי ממברנה כמו חלבוני BAR-domain (הקרויים על שם חלבוני בין, אמפיפיסין ו-Rvs), והחדרת תחום הליקסים האמפיפתיים לממברנה1 . באופן מעניין, חלבונים ושומנים אלה לא רק מעוותים את הממברנה אלא יכולים גם לחוש את עקמומיות הממברנה ולהפגין הצטברות מועדפת1. לכן, חיוני לחקור אם וכיצד ממברנות עם עקמומיות שונה משנות את ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים המחוברים אליהם ואת ההשפעות הפוטנציאליות על התהליכים התוך-תאיים הקשורים אליהם.

טכניקות רבות פותחו כדי לנתח את האינטראקציה בין קרום מעוקל וחלבונים הן בתאים חיים והן במערכות חוץ גופיות. מערכת התאים החיים מספקת סביבת תאים אמיתית עם מגוון שומנים עשיר וויסות איתות חלבוני דינמי 2,3,4,5,6,7. עם זאת, מערכת מתוחכמת כזו קשה לחקור בשל אי הוודאות והתנודות בסביבה התוך תאית. לפיכך, הבדיקות במבחנה באמצעות קרום מלאכותי המורכב ממיני שומנים ידועים וחלבונים מטוהרים הפכו למערכות שחזור חזקות כדי לאפיין את הקשר בין חלבונים לממברנות מעוקלות. באופן מסורתי, ליפוזומים בקטרים שונים נוצרים על ידי שחול כדי לזהות חלבונים רגישים לעקמומיות באמצעות בדיקת שקיעה משותפת באמצעות כוח צנטריפוגלי או בדיקת ציפה משותפת עם שיפוע צפיפות כדי למנוע צבירה של חלבונים 8,9. עם זאת, העקמומיות של הליפוזומים המובלטים מוגבלת על ידי גודל הנקבוביות הזמין של מסנן הממברנה המשמש במכבש10. הוכח כי בדיקת עקמומיות ליפוזום יחיד (SLiC) מתגברת על מגבלה זו, שבה ליפוזומים בקטרים שונים מסומנים פלואורסצנטיים ומשותקים על פני השטח, כך שניתן לסמן את העקמומיות על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות11. עם זאת, שונות חזקה בהרכב השומנים נצפתה בשלפוחיות קטנות, המשפיעות על דיוק מדידת העקמומיות12. ניסויים במשיכת קשירה מספקים מדידה מדויקת יותר של העקמומיות על הקשירה החולפת הנמשכת מבועיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs) באמצעות פינצטה אופטית, שבה ניתן לשלוט היטב בעקמומיות על ידי מתח הממברנה שנוצר13,14. שיטה זו מתאימה לחקר חלבונים בעלי חישת עקמומיות חיובית או שלילית, אך היא מוגבלת על ידי התפוקה של דור10 של הצינורית. בדיקת צינורות ממברנה נתמכים (SMrT) מאפשרת יצירה בו זמנית של צינורות ממברנה מרובים המובלטים מאותו מאגר שומנים על ידי זרימות מיקרופלואידיות. אף על פי כן, עקמומיות הממברנה משתנה באופן מהותי לאורך הננו-צינורית, מה שפוגע בדיוק של מדידת עקמומיות מבוססת פלואורסצנציה15,16. לשם השוואה, שימוש בשלפוחיות חד-שכבתיות קטנות (SUVs, קוטר <100 ננומטר17) ליצירת דו-שכבתי של שומנים נתמכים (SLB) על משטחים המכילים טופוגרפיות מתוכננות יצר קרום דו-שכבתי יחיד עם עקמומיות שנקבעה מראש על ידי ננו-פבריקציה או ננו-חומרים בדיוק גבוה18,19,20.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת SLB על משטחי ננו-שבבים מפוברקים עם מערכי ננו-ברים וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את רגישות העקמומיות של חלבונים במבחנה. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם שישה מרכיבים חיוניים של הבדיקה: א) ניקוי והרכבה של השבב עם תא מיקרופלואידי; ב) הכנת רכבי שטח עם הרכב שומנים מוגדר; C) היווצרות SLB על ננו-שבב וקשירה עם חלבונים רגישים לעקמומיות; ד) הדמיה ואפיון של SLB וחלבונים רגישים לעקמומיות תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ה) ניקוי השבב לשימוש חוזר; ו) עיבוד תמונה לניתוח כמותי של יכולת חישת עקמומיות חלבון. הפרוטוקול המפורט מתואר שלב אחר שלב להלן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ניקוי של ננו-שבב

  1. הניחו את הננו-שבב בכוס של 10 מ"ל כשהצד המעוצב פונה כלפי מעלה.
    הערה: ננו-שבב קוורץ זה יוצר באמצעות ליתוגרפיה של קרן אלקטרונים כפי שתואר לפני21. הגיאומטריה והסידור של הננו-מבנה על השבב ניתנים לתכנון מותאם אישית. הגדלים של הננו-ברים ההדרגתיים המשמשים כאן הם 2000 ננומטר אורך, 600 ננומטר גובה, ו 100 עד 1000 ננומטר רוחב (100 ננומטר צעד להגדיר).
  2. הוסיפו בזהירות 1 מ"ל של 98% חומצה גופרתית לכוס, וודאו שהחומצה מכסה באופן מלא את החלק הקדמי והאחורי של השבב.
    הערה: 98% חומצה גופרתית היא קורוזיבית ביותר ועלולה לגרום להרס מהיר של רקמות ולכוויות כימיות חמורות במגע עם העור או העיניים. השתמש בו במכסה האדים עם הגנה מתאימה.
  3. סובבו באיטיות את הכוס והוסיפו 200 μL של 30% מי חמצן טיפה אחר טיפה עד שכל הכוס מתחממת. ודא כי חומצה גופרתית ומי חמצן מעורבבים היטב כדי ליצור תמיסת פיראנה להסרת מולקולות אורגניות מן nanochip17. ישנן טכניקות חלופיות ליצירת SLB על משטחים הידרופיליים נקיים, כגון אור UV וחשיפה לאוזון כפי שתואר קודםלכן 23.
    הערה: התגובה היא אקסותרמית ביותר ויכולה לגרום לתמיסה לרתיחה, לכן הוסיפו מי חמצן לחומצה הגופרתית טיפה אחר טיפה והמשיכו להסתובב.
  4. מניחים את הכוס במיכל זכוכית משני ושומרים על ננו-שבב שקוע בתמיסת הפיראנה למשך הלילה כדי לנקות את הזיהומים ביסודיות.
    הערה: הניחו את הכוס במכסה המנוע ללא כל כיסוי, למקרה שהתגובה עלולה לייצר גז.
  5. הוציאו את הכוס והעבירו בזהירות את תמיסת הפיראנה למיכל פסולת חומצה.
  6. העמיסו 5 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לתוך הכוס כדי לדלל את שאריות החומצה ולהשליך אותה לפסולת החומצית. חזור על שלב זה חמש פעמים והשתמש ב- 5 M NaOH כדי לנטרל את פסולת החומצה.
  7. קח את השבב עם פינצטה ושטוף עם זרם מתמשך של מים deionized כדי להסיר חומצה שיורית ביסודיות. ייבשו את השבב ב-99.9% גז חנקן להיווצרות SLB22.

2. דור של שלפוחית חד-צדדית קטנה (רכבי שטח)

  1. הוסיפו 100 μL של כלורופורם לבקבוקון ענבר.
    הערה: כלורופורם הוא נוזל נדיף מאוד וחסר צבע, והוא עלול להיות רעיל בשאיפה או בבליעה. השתמשו בו במכסה המנוע עם המסכה והכפפות.
  2. ממיסים 500 מיקרוגרם של תערובת השומנים בכלורופורם. הרכב תערובת השומנים המשמשת כאן הוא 89.5 מול% של פוספטידילכולינים מביצים (PC), 10 מול% של פוספטידיל-סרין במוח (PS), ו-0.5% מול% של Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, מלח טריאתילמוניום (Texas Red DHPE).
  3. ייבשו את תערובת השומנים בבקבוקון עם גז חנקן 99.9% עד שהכלורופורם נדיף ותערובת השומנים יבשה.
    הערה: שלב זה צריך להתבצע במכסה המנוע. יש להימנע מהתזת נוזלים בעת ייבוש במכה.
  4. הניחו את תערובת השומנים הקיימת בבקבוקון הענבר ללא המכסה במייבש האבק המכוסה רדיד אלומיניום. לאחר מכן ייבשו את הדגימה בוואקום עם משאבה למשך 3 שעות כדי להנדיף לחלוטין את הכלורופורם.
  5. הוסיפו לבקבוקון 250 מיקרו-ליטר של מאגר מי מלח עם אגירת פוספט (PBS). מערבבים את התמיסה עד שהיא הומוגנית.
    הערה: מאגר PBS מורכב מ-150 mM NaCl, ללא סידן, מגנזיום ופנול אדום; ה- pH מותאם ל- 7.2 כדי להפוך את המחשב ואת ה- PS ליפידים דו-שכבתיים.
  6. סוניקו את תערובת השומנים במשך 30 דקות בתדר של 50 קילוהרץ בסוניק אמבטיה. לאחר מכן מעבירים את תערובת השומנים לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ואוטמים עם פרפילם.
  7. מקפיאים את תערובת השומנים בחנקן נוזלי למשך 20 שניות ואז מפשירים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמבט מים. חזרו על מחזורי ההפשרה 30 פעמים. לאחר מכן, תערובת השומנים נראית כמו נוזל צלול.
    אזהרה: לחנקן נוזלי יש נקודת רתיחה של כ-195.8 מעלות צלזיוס. זה יכול לגרום כוויות קור או כוויות קריוגניות. השתמשו בו בחלל הלא סגור עם כפפות בידוד חום.
  8. יש לשטוף שני מזרקי זכוכית אטומים לגז ואת המחבר של המיני-אקסטרודר עם אתנול, כלורופורם ומתנול בהתאמה. חזרו על רצף השטיפה חמש פעמים כדי לנקות מראש את המנגנון. השאירו אותם במכסה האדים עד שהממס האורגני נדיף לחלוטין.
  9. הרכיבו את מנגנון המיני-אקסטרודר והעבירו 500 μL של מאגר PBS דרך המחבר כדי להרטיב מראש את המנגנון, ולאחר מכן השליכו את המאגר ממזרק אחר. שלב זה מסיר זיהומים ומקל על שחול.
  10. הרכיבו את מנגנון המיני אקסטרודר עם קרום מסנן פוליקרבונט בגודל 100 ננומטר.
    הערה: גודל הנקבוביות של קרום המסנן קובע את קוטר הליפוזומים.
  11. קח 500 μL של מאגר PBS עם אחד המזרקים ודחף אותו בעדינות דרך המסנן כדי למלא את המזרק הריק השני בקצה השני. חזור על ההבלטה הלוך ושוב שלוש פעמים כדי לבדוק את דליפת המנגנון ולהשליך את החיץ מהמזרק השני.
  12. העבירו את תערובת השומנים דרך המיני אקסטרודר כדי להחליף את מאגר ה-PBS. לאחר מכן חצו הלוך ושוב 20 פעמים כדי ליצור רכבי שטח. האופי הרב-לשוני של הבועיות עשוי להישמר עם מספר לא מספיק של זמני שחול, אשר ישפיעו על היווצרות SLB23.
  13. אספו את רכבי השטח מהמזרק השני כדי להפחית את הזיהום בחלקיקים גדולים יותר והעבירו אותו לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
    הערה: הסר את המזרק היישר מהמחבר למקרה שהמזרק יתנתק.
  14. יש לעטוף את הצינור ברדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנה של שומנים המסומנים בפלואורסצנט ולאחסן אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. בדרך כלל, ניתן לאחסן את רכבי השטח עד 7 ימים.

3. היווצרות SLB על ננו-שבב

  1. הוציאו בזהירות את הננו-שבב המנוקה ממים שעברו דה-יוניזציה בעזרת זוג פינצטה וייבוש עם 99.9% גז חנקן.
  2. בצע ניקוי פני השטח של nanochip עם טיפול פלזמה אוויר במשך 1 שעות.
  3. הרכיבו את הננו-שבב בתא פולידימתילסילוקסן (PDMS), המורכב משתי חתיכות של PDMS - PDMS אמצעי ו-PDMS עליון (איור 1A). ה-PDMS האמצעי דק (~0.5 מ"מ) עם פתח גדול בצורת אליפסה במרכז כדי להבטיח חשיפה מספקת לתבנית הננו-בר. ה- PDMS העליון עבה (~ 4.0 מ"מ) עם שני חורים קטנים בתוך הפתח הסגלגל הגדול ככניסה ושקע לטיפול בנוזל.
    1. מניחים את השבב על משטח נקי כשהתבנית פונה כלפי מעלה.
    2. מכסים בעדינות את ה-PDMS האמצעי עם השבב, ומוודאים שכל התבנית חשופה לאזור המרכזי של הפתח הגדול בצורת אליפסה ב-PDMS האמצעי.
    3. כסו את ה-PDMS העליון ב-PDMS האמצעי ושמרו על שני החורים הקטנים שלו באזור החור הסגלגל הגדול של ה-PDMS האמצעי. לאחר מכן תא PDMS הוא התאספו.
      הערה: PDMS הוא הפולימר האורגני הנפוץ ביותר על בסיס סיליקון. הוא תואם ביולוגית, שקוף, כמו גם מעוות כדי להיות מתוכנן כצורה מותאמת אישית להרכבת שבב והדמיה תחת המיקרוסקופ. חשוב מכך, ניתן להדביק אותו באופן קוולנטי לשכבת PDMS אחרת או לזכוכית בחוזקה לאחר טיפול בפלזמה, מה שהופך אותו למתאים כתא להכנת SLB. שלב זה מבטיח שכל שכבה של PDMS מותקנת היטב כדי למנוע פערים ודליפות.
  4. טען את רכבי השטח לתוך תא PDMS מאחד משני החורים הקטנים ב- PDMS העליון עם פיפטה ודגרה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את ה- SLB.
  5. הכניסו בעדינות את חיץ ה-PBS לתוך תא ה-PDMS מצד אחד של החור הקטן והוציאו את הפסולת עם צמר גפן מהחור השני כדי לשטוף את רכבי השטח הלא מאוגדים. לאחר מכן לרכוש את SLB שנוצר על nanochip (איכות SLB נבדקת על ידי התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching (FRAP) כפי שמוצג בשלב 4.4 ונדון בסעיף התוצאות המייצגות).
    הערה: בעת הזרמת מאגר PBS לתוך התא, קצה הפיפטה צריך להיות מלא במאגר ובמגע עם משטח הנוזל כדי למנוע הזרקת בועות.

4. הדמיית ה-SLB וחלבון חישת העקמומיות הנקשר על הננו-שבב

הערה: סעיף זה יהיה תלוי במערכת המיקרוסקופים הזמינה לניסוי. כאן תתואר הנחיה כוללת כיצד לבצע את ההדמיה. ניתן לשנות את ההגדרות המפורטות בין הגדרות המיקרוסקופ השונות.

  1. הגדר את המיקרוסקופיה הקונפוקלית לסריקת לייזר באמצעות מטרת שמן 100x (N.A.1.4). פתח את תוכנת ZEN כדי לבחור את עוצמת לייזר העירור שיכולה לעורר את הפלואורסצנציה של השומנים והחלבון. בחר מצב רכישה > הגדרה חכמה > טקסס רד DHPE / EGFP.
  2. כוונן את המיקוד באמצעות ידית המיקוד כדי לאתר את הננו-מוטות על השבב עד שקצוות הננו-מוטות יהיו חדים מתחת לתעלת השומנים.
  3. הגדר את פרמטרי הסריקה כמפורט להלן כדי לקבל תמונת בקרה של תעלת השומנים לפני הוספת חלבון: גודל מסגרת = 512 פיקסלים x 512 פיקסלים (512 פיקסלים x 512 פיקסלים, גודל פיקסל של 124 ננומטר), סיביות לפיקסל = 16 (עומק 16 סיביות ), מהירות סריקה = 5, וממוצע = 4 (מצב ממוצע של ארבע פעמים לקו).
  4. בצע את בדיקת FRAP על ידי הלבנת דו-שכבת השומנים המסומנת בפלואורסצנט על אזור ננו-בר יחיד אקראי.
    1. בחר/י בתיבות הסימון ״אזורי ניסוי ״ ו״ הלבנה״ . ציירו שטח מעגלי בקוטר 5 מיקרומטר שיכול לכלול את כל הננו-בר במרכז (גודל הננו-בר הוא 2 מיקרומטר) והוסיפו לאזורי הניסוי. הזן פרמטרי הדמיה של קיטועי זמן כדוגמה הבאה: בחר מהירות סריקה = 9 וממוצע = 1. בחר סדרת זמן > משך = 100 מחזורים ומרווח = 2 שניות. הזן פרמטרים להלבנה כדוגמה הבאה: בחר/י בתיבת הסימון ״התחל אחרי # תמונות״ ובחר/י שלוש תמונות.
    2. בחר את תיבות הסימון של הלייזר המבצעות FRAP ושנה את העוצמה ל - 100.0%. לחץ על התחל ניסוי עבור ניסוי FRAP.
      הערה: FRAP היא שיטה נפוצה לאפיון הניידות של מולקולות תאיות. אם ל-SLB יש נזילות טובה, הפלואורסצנציה באזור המולבן תתאושש בהדרגה כאשר פלואורופורים מולבנים יתפזרו החוצה ופלואורופורים לא מולבנים מאזורים אחרים יתפזרו פנימה.
  5. יש לטעון את תמיסת החלבון לתוך תא ה-PDMS ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר את קשירת החלבון ב-SLB.
    הערה: החלבונים המשמשים באיור 2G,H כדי להדגים את הרכב השומנים מקלים על קשירת חלבונים ב-SLBs מעוקלים בננו-ברים הם 74 μM GFP ו-79 μM GFP-His. שני חלבונים אלה הם חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ללא או עם תג שלו. החלבונים המשמשים למחקר חישת עקמומיות באיור 4 ובאיור 5 הם 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 ו-16 μM FBAR+IDRFBP17. שלושת החלבונים האלה הם התחומים של FBP17, שהוא חלבון BAR טיפוסי שמניחים באופן אינטואיטיבי שהוא גם מחולל עקמומיות וגם כחיישנים. כל נפח חלבון הוא 20 μL.
  6. מקד מחדש את הננו-ברים וחזור על שלב 4.3 כדי לצלם תמונות של תעלות השומנים והחלבונים לצורך זיהוי חישת עקמומיות חלבונים.
  7. חזור על שלב 4.4 כדי לבצע את בדיקת FRAP הן בתעלות השומנים והן בתעלות החלבון ולבצע הדמיה בהילוך מהיר כדי לאפיין את הניידות של חלבון חישת עקמומיות.

5. שימוש חוזר בננו-שבב

  1. קחו את הננו-שבב בפינצטה ונתקו אותו בזהירות מתא ה-PDMS בכוס של 50 מ"ל מלאה במים שעברו דה-יוניזציה.
    הערה: זהו שלב קריטי. מנעו מהפינצטה לגעת בננו-מבנה, ואל תכריחו את השבב להיפרד כדי למנוע סדקים.
  2. שטפו היטב את הננו-שבב באתנול נטול מים כדי להסיר שאריות אורגניות המחוברות על פני השטח.
    הערה: השתמש בנייר טישו נקי כדי להסיר מים על פני השטח לפני שטיפה עם אתנול נטול מים.
    אזהרה: אתנול נטול מים הוא כימיקל נדיף מאוד ומעט מסוכן. יש להימנע ממגע עם העור והעיניים. השתמשו בו במכסה המנוע עם המסכה והכפפות.
  3. שטפו את השבב ביסודיות עם הרבה מים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר שאריות אתנול. לאחר מכן לפוצץ לייבש את השבב עם 99.9% גז חנקן.
    הערה: חשוב להסיר את כל עקבות האתנול על השבב לפני שתמשיך לשלב הבא מכיוון שחומצת הפיראנה יכולה להגיב באלימות עם ממס אורגני ועלולה לגרום לפיצוצים.
  4. מניחים את השבב בכוס נקייה של 10 מ"ל כשצד התבנית פונה כלפי מעלה ומנקים את השבב עם תמיסת פיראנה לשימוש חוזר אשר עוקב אחר אותם שלבים כמו 'ניקוי של ננו-שבב'.

6. כימות תמונה

  1. סובב את התמונות שנרכשו על ידי מיקרוסקופ כך שמערך הננו-ברים יהיה במצב אנכי לניתוח הבא בתוכנת פיג'י.
  2. השתמש בקוד MATLAB 'c_pillarmask_averaging' שנכתב בהתאמה אישית כדי לאתר את הננו-פס הבודד על ידי מסיכה מרובעת (51 פיקסלים x 51 פיקסלים) הן בערוץ השומנים והן בערוץ החלבון.
    הערה: קוד MATLAB זה תוכנן במיוחד עבור הננו-שבב. ניתן להשיג אותו ב- GitHub דרך הקישור: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. הפחת את אותות הרקע של כל תמונה באמצעות שלושת ה- ROIs (5 פיקסלים x 5 פיקסלים) בפינות התמונה על ידי פונקציית meshgrid בקוד MATLAB 'BarGra_avg'. פעולה זו נועדה לתקן רעשי רקע לא אחידים פוטנציאליים הנגרמים על ידי הגדרת המיקרוסקופ או פילוס השבב בשלב המיקרוסקופ.
  4. צור את התמונות הממוצעות של ננו-ברים בגודל זהה באמצעות קוד MATLAB 'BarGra_avg', כאשר כל נקודה היא הממוצע של הערכים באותה נקודה בכל המסכות הריבועיות של ננו-ברים בודדים. צור חלקות פני שטח תלת-ממדיות של התמונות הממוצעות בתוכנת פיג'י כדי להציג את התפלגות האות הממוצעת סביב הננו-ברים באופן אינטואיטיבי. בחרו ' נתח > משטח התוויית פני השטח > קלט 100 ' למכפיל מצולע, ובחרו תיבות הסימון 'הצללה', 'צייר ציר' ו'החלק '.
  5. פלח כל ננו-מוט לשלושה אזורים, הכוללים שני אזורים בעלי קצה ננו-בר ואזור ננו-מרכזי אחד כדי לחלץ את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם בהתאמה על-ידי קוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification'. הגדלים של ה-ROIs של הננו-ברים מותאמים בהתאם לממד של הננו-ברים באמצעות קובץ ה'מיקום'.
  6. חלקו את עוצמות החלבון בעוצמות שומנים המופקות מקוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification' באזור הבר-קצה כדי לקבל את צפיפות קצה הננו-בר שאינה כוללת את אפקט שטח הפנים.
  7. שרטט את צפיפות קצה הננו-בר עם ריכוזים שונים במנסרת GraphPad כדי לקבל את עקומת הקשירה. פתח את תפריט ניתוח . בחר רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) > כריכה - רוויה > קשירה ספציפית עם פונקציית שיפוע היל כדי להתאים את העקומה למשוואת היל ולאחר מכן חשב את ערך מקדם KD ו- Hill.
  8. עוצמות השומנים והחלבונים מנורמלות לעוצמות המתאימות להן במרכז הננו-ברים של 600 ננומטר הנרכש באותה תמונה באמצעות קוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  9. השתמש בתשעת הפיקסלים הבהירים ביותר של עוצמות חלבון מנורמלות באזור הקצה הננו-ברי חלקי אזור הבר-מרכז כדי לכמת את חישת עקמומיות החלבון עם ננו-ברים בגודל זהה, הערך נקרא "יחס קצה למרכז". השתמש ביחס של עוצמת חלבון מנורמל כדי לנרמל את עוצמת השומנים כדי לכמת את טווח חישת עקמומיות החלבון עם ננו-ברים בגדלים שונים, הערך נקרא "צפיפות ננובר-קצה מנורמלת". ערכים אלה מחושבים על ידי קוד MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  10. טען את תמונת המחסנית של FRAP בתוכנת פיג'י. בחר את אזור FRAP וצור החזר השקעה. בחר בפונקציה More > Multi measure כדי למדוד את עוצמת אזור FRAP עבור כל פעם. התווה את העוצמה בפריזמת GraphPad כדי ליצור את עקומת ההתאוששות של FRAP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תכנון ננו-בר מומלץ לבדיקת חלבונים חישת עקמומיות חיובית, המכילים חצי עיגול בכל קצה עם עקמומיות המוגדרת על ידי רוחב הננו-מוט ובקרת עקמומיות שטוחה/אפס אחת מקומית במרכז (איור 2A,B). היווצרות מוצלחת של ה-SLB על גבי ננו-מוטות גורמת לאותות סמן שומנים המפוזרים באופן שווה על פני כל משטח הננו-בר, כפי שמוצג באיור 2C. ניתן לשלב אותות מננו-ברים מרובים על-ידי חישוב ממוצע של תמונות הננו-ברים הבודדות (איור 2D), כך שניתן יהיה למזער ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מערכת nanobar-SLB המתוארת כאן מציעה שילוב ייחודי של היתרונות במספר בדיקות קיימות במבחנה. הוא חושף ביעילות את הקשירה המועדפת של חלבונים לממברנות מעוקלות מאוד כבדיקת ציפה או שקיעה של ליפוזום, אך דורש הרבה פחות דגימות ומציע עקמומיות מוגדרת בצורה מדויקת יותר על ננו-ברים בודדים 8,29. הוא גם מציע מגוון רחב של עקמומיות מבוקרת במדויק להשוואה סימולטנית כמו בדיקת SLiC, עם פחות דאגה לשינוי בהרכב השומנים בעקמומיות שונות ושינויים מורפולוגיים או עקמומיות בלתי ניתנים ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים על היעדר אינטרס כלכלי מתחרה בעבודה זו.

תודות

אנו מודים למרכז ננו-פבריקציה של נאניאנג (N2FC) ולמרכז לטכנולוגיות פוטוניות משבשות (CDPT) באוניברסיטה הטכנולוגית של נאניאנג (NTU) על התמיכה בייצור ננו-מבנים והדמיית SEM, לפלטפורמת ייצור החלבונים (PPP) בבית הספר למדעי הביולוגיה NTU לטיהור חלבונים, ולבית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU למיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו ממומנת על ידי משרד החינוך של סינגפור (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21, ו- MOE-T2EP30220-0009), המכון לניתוח מולקולרי דיגיטלי ומדע (IDMxS) הנתמך על ידי מימון MOE במסגרת תוכנית מרכזי המחקר למצוינות (W. Zhao), קרן תוכנית המדע של הגבול האנושי (W. Zhao, RGY0088/2021), מענק הסטארט-אפ של NTU (W. Zhao), בית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU עבור מלגת המחקר (X. Miao), ומועצת המלגות של סין עבור מלגת המחקר (J. Wu).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אתנול נטול מיםSigma-Aldrich100983
רדיד אלומיניוםיהלוםRN0879999FU
בקבוקון ענברSigma-Aldrich27115-U
מוח PS: L-α-phosphatidylserine (מוח, חזיר) (מלח נתרן)Avanti Polar Lipids, Inc.
10 מ"לשוט-דוראןSCOT211060804
50 מ"לשוט-דוראןSCOT211061706
1000 מ"לשוט-דוראןSCOT211065408המיכל השני 
כלורופורםסיגמא-אולדריץV800117
ניצני כותנהWatsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (מלח ניקל)Avanti Polar Lipids, Inc.
790404 ביצים PC: L-α-פוספטידילכולין (ביצה, עוף)Avanti Polar Lipids, Inc.
פלפטורם לייצור חלבון F-BAR, בית הספר למדעי הביולוגיה, האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג, סינגפורחלבונים ופפטיד
F-BAR+IDRייצור חלבון פלפטורם, בית הספר למדעי הביולוגיה, האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג, סינגפורחלבונים ופפטיד
GFPפלפטורם לייצור חלבונים, בית הספר למדעי הביולוגיה, האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג, סינגפורחלבונים ופפטיד
GFP-HisProtein Production Plaftorm, בית הספר למדעי הביולוגיה, האוניברסיטה הטכנולוגית נאניאנג, סינגפורחלבונים ופפטיד
GraphPadPrism GraphPadV9.0.0
מי חמצן, 30% (מוסמך ACS)Thermo ScientificH325-500
IDR מ- FBP17 אנושיסנגון ביוטק (שנחאי) ושות', בע"מ
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות1.50d
סריקת לייזר מיקרוסקופיה קונפוקליתZeiss LSM 800 עם מטרת שמן Airyscan100x (NA1.4).
מתנולפישר 10010240
מיני אקסטודר אוונטי פולאר ליפיד, בע"מ610000-1EA
1.5 מ"ל מיקרו-צינורותגריינר616201
MATLABMathworksR2018b
קרום הידרופילי גרעיני, 0.1 μ מווטמן800309
פוספט חוצץ מלח (PBS)Life Technologies Holdings Pte Ltd.70013
פולידימתילסילוקסן (PDMS) בסיסדאו קורנינג תאגידSYLGARD 184
פולידימתילסילוקסן (PDMS) Crosslinkerדאו קורנינג תאגידSYLGARD 184
מנקה פלזמהHARRICK PLASMAPDC-002-HP
קוורץ ננו-שבבדונגהאי מחוז אלפא קוורץ מוצרים ושות', בע"מ
נתרן הידרוקסיד Sigma-Aldrich795429
Sigma-Aldrich258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium SaltLife Technologies Holdings Pte Ltd.
פינצטהGooiPDC-002-HP
מנקי אולטרסאונדElmaD-78224
VoterxScientific IndustriesG560E
מייבש ואקוםNUCERITE5312
אמבט מיםJulaboTW8
840032' 840051מדעיחומצה גופרתית T1395MP

מקורות

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FRAPPDMS

מאמרים קשורים