כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.
מאמר שיטה
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.
גוף הולך וגדל של ראיות מראה כי לימפוציטים מסוג B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב והסתגלות שריר הלב לפציעה. עם זאת, הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. דווח כי תאי B הם גם בין תאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם או שהם נוכחים, אך בשכיחות נמוכה משמעותית מתאי מיאלואידים, או שהם נדירים למדי. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלב הפגוע. יישום שיטה משותפת הניתנת לשחזור כדי להעריך את השכיחות של תאי B שריר הלב הוא קריטי כדי ליצור הרמוניה בין תצפיות מקבוצות מחקר שונות ובכך לקדם את קידום המחקר של אינטראקציות שריר הלב של תאי B. בהתבסס על הניסיון שלנו, התצפיות המנוגדות לכאורה המדווחות בספרות נובעות ככל הנראה מהעובדה שתאי B של שריר הלב הם ברובם תוך-וסקולריים ומחוברים לאנדותל המיקרו-וסקולרי. לכן, מספר תאי B שהתאוששו מלב מורין רגיש להפליא לתנאי הזלוף המשמשים לניקוי האיבר ולשיטת העיכול המשמשת. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי המביא בחשבון את שני המשתנים הקריטיים הללו באופן ספציפי. פרוטוקול זה מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור של מספר תאי B שריר הלב ומאפשר לחוקרים להבחין בין תאי B מיו-וסקולריים חוץ-וסקולריים לעומת תאי B תוך-וסקולריים.
לימפוציטים מסוג B הם תאים חיסוניים מיוחדים מאוד הממלאים תפקיד חשוב הן בתגובה החיסונית הנרכשת והן בתגובה החיסונית המולדת1. ישנן שתי אוכלוסיות עיקריות של תאי B: אוכלוסייה קטנה יותר של תאי B1 המיוצרים בעיקר במהלך החיים העובריים, ואוכלוסייה מוקדמת של תאי B2 המיוצרים בחיים הבוגרים במח העצם1. לאחר ההתבגרות במח העצם, תאי B נודדים לאיברי לימפה ראשוניים ומשניים. משם הם חוזרים ללא הרף בין איברי הלימפה העוברים דרך כלי הדם וכלי הלימפה2. תאי B מבטאים נוגדנים ספציפיים על פני השטח שלהם, המתפקדים כקולטנים. כאשר תאי B נתקלים באנטיגן שנקשר לקולטן שלהם, ניתן להפעיל אות מפעיל. תאי B פעילים נודדים לרקמה שבה נמצא האנטי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו באישור IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
1. הכנות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
לאחר השלמת הרכישה ואיסוף כל האירועים, יש לנתח את הנתונים על פי תרגול ציטומטריה של זרימה סטנדרטית. מוקד הניתוח ישתנה בהתאם למטרה האישית של כל ניסוי. במקרה זה, כימות של תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים נרדף, והוא בא לידי ביטוי כמספר התאים למ"ג רקמה.
בעת שימוש בציטומטר ספקטרלי, מומלץ להתחיל את הניתוח עם gating ראשוני כדי להסיר פסולת בגדלים שאינם בטווח המתאים לתאי החיסון, ולאחר מכן להסיר את האות כתם חי מת+. זה מאפשר לזהות אוכלוסייה נקייה של תאים חיוביים מסוג CD45 המתאימים ללויקוציטים (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב ושיפוץ/הסתגלות שריר הלב לפציעה 7,8,9,10,11,12,13,36. ציטומטריה של זרימה היא כלי מצוין לחקר אוכלוסיות תאי חיסון בכל רקמה וכמעט כלי חובה לכל מחקר המתמקד בתאי B בלב.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
לואיג'י אדמו הוא מייסד שותף של i-Cordis, LLC, חברה המתמקדת בפיתוח מולקולות אימונומודולטוריות לטיפול באי ספיקת לב, עם עניין ספציפי בנגזרות של התרופה המווסתת תאי B pirfenidone. לשאר המחברים אין קונפליקטים להצהיר.
מחקר זה מומן על ידי מענקי NHLBI 5K08HLO145108-03 ו- 1R01HL160716-01 שהוענקו ללואיג'י אדמו.
ציטומטר זרימת אורורה ששימש לפיתוח מחקר זה מומן על ידי NIH Grant S10OD026859. אנו מכירים בתמיכתה של ליבת הציטומטריה של זרימת JHU Ross.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 700 נוגדן CD11b אנושי | 101222 | BioLegend | 100 ומיקרו; G 200 ומיקרו; L |
| (CellTreat 29481) מסננת תאים, 40 ומיקרו; m, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה טבעי | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% הזרקת נתרן כלורי, USP | 114-055-101 | איכות ביולוגית | 0.90% |
| 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה טבעי | 1615-5500 | SealRite, ארה"ב Scientific | |
| 10 ומיקרו; L טיפים מסננים TipOne בוגר | 11213810 | ארה"ב מדעי | |
| 1000 ומיקרו; טיפים מסננים טיפ אחד בוגר 11267810 | ארה"ב סיינטיפיק | ||
| 15 מ"ל צינור צנטריפוגה, מכסה אטם תקע, פוליפרופילן, שסתום | חד | 430052 | |
| , פוליקרבונט | SVPT951 | ייצור | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µ טיפים מסננים TipOne בוגר L | 11208810 | ארה"ב שסתום | |
| , פוליקרבונט | SVPT953 | ECT ייצור | |
| 5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול, פלקון 352054 בסגנון 12 x 75 מ"מ | של מותג | ||
| 50 מ"ל, מכסה אטם תקע, פוליפרופילן, RNase - / DNase | 430290 | Corning | |
| ACK ( אמוניום-כלוריד-אשלגן) מאגר ליזינג | 118-156-101 | אוסמולליות ביולוגית איכותית: 290 + או -5% mOsm/Kg מתאם H20 | |
| 4x50 מ"ל, עבור דלי מלבני של 250 מ"ל ברוטור A-4-63 | 5810759005 | אפנדורף | |
| לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל, 9 צינורות לכל מתאם, תחתית חרוטית לשימוש עם רוטור דגם A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| מתאם ל-15 צינורות תחתונים עגולים 2.6 – 7 מ"ל, עבור דלי מלבני של 250 מ"ל ברוטור A-4-62 | 22638246 | רדיד אלומיניום אפנדורף | |
| 12 אינץ' x 75 אינץ' גליל .0007 | UPC 109153 | ריינולדס | |
| - עכבר | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer מזרק קצה החלקה עם מחט מחוברת 25 גרם x 5/8 אינץ', סטרילי, לשימוש חד פעמי, 1 מ"ל | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| מזרקי אינסולין עדינים במיוחד של Brandzig 29G 1 סמ"ק 1/2 אינץ' 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 נוגדן CD19 נגד עכבר | 115537 | BioLegend | 50 µ מכסי גרם/מ"ל |
| לצינורות זרימה עם רשת מסננת 35 ומיקרו; m, מיקום כפול לצינורות 12 x 75 מ"מ, סטרילי | T9009 | Southern Labware | |
| פחמן דו חמצני USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials בצורה נמוכה, זכוכית, 500 מ"ל | UX-34502-46 | קולגנאז Cole-Parmer | |
| 2 | LS004176 | מחבר סיגמא-אולדריץ' | |
| פליז מצופה כרום 1/4 אינץ' נקבה NPT x 1/4 אינץ' דוקרני | Y992611-AG | AirGas ארה"ב | |
| Cytek Aurora זרימה ציטומטר | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 פטמה 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - בקר פיפטה אלקטרוני | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223 / E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| צנטריפוגה Eppendorf 5810R | Eppendorf | ||
| Eppendorf Research בתוספת פיפטות משתנות חד-ערוציות | Eppendorf | ||
| gibco | 1x | ||
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, ישר | 13018-14 | Fine | |
| Tools Luer Slip מזרק סטרילי, לשימוש חד פעמי, 20 מ"ל | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, בינוני | 4033- CS150 | McKesson | |
| Navigator איזון נייד רב תכליתי | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE נגד עכברים/אנושי CD45R/B220 נוגדן | 103208 | BioLegend | 200 ומיקרו; g/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 נוגדן CD45 נגד עכבר | 103132 | BioLegend | 100 ומיקרו; g 500 uL |
| צלחת פטרי, ניתנת לערמה 35 מ"מ x 10 מ"מ פוליסטירן סטרילי | FB0875711YZ | פישר מדעי | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas ארה"ב | |
| עוצמתי 6 וואט LED כפול צוואר אווז תאורה | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide מחט 25 גרם x 5/8 (0.5 מ"מ x 16 מ"מ)305122 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| עכברוש מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (עכבר BD Fc בלוק) שיבוט 2.4G2 (RUO)553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 מ"ג/מ"ל | |
| R 4.1.1 | |||
| 9501250000 | Accutec Blades Inc | ||
| רגולטור אנליטי שני שלבים 0-25 psi משלוח CGA320 3500 psi כניסת | Y12244A320-AG | AirGas ארה"ב | |
| רוטור A-4-62, כולל 4 x 250 מ"ל דליים מלבניים | רוטור A-4-62 | אפנדורף | |
| פיפטה סרולוגית, סתומה, 10 מ"ל, סטרילית, לא פירוגנית/נטולת אנדוטוקסין, לא ציטוטוקסית, 1 חתיכה/שלפוחית | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma תווית קלטת | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, ישר, זכר Luer Lock x 1/8 אינץ' צינור דוקרני; 1 / EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, גודל S2, Excelon, 1/8 אינץ' מזהה x 3/16 אינץ' OD x 1/32 אינץ' קיר x 50 אינץ' ארוך | CG-730-003 | מעבדת אקסלון | |
| מזרק PP / PE ללא מחט, 3 מ"ל | Z683566 | Millipore Sigma | |
| משאבת מזרק | 55-1199 (95-240) | מכשיר | |
| טיימר אזעקה תומאס 3 ערוצים TM10500 | 9371W13 | מתלה צינורות תומאס סיינטיפיק | |
| , 12 עמדות, 6 עבור 5.0 מ"ל ו-15 צינורות מ"ל ו-6 ל-25 מ"ל ו-50 צינורות מ"ל, פוליפרופילן, עמדות ממוספרות, | 30119835 | אפנדורף | |
| , 12 פוזיציות, עבור 5.0 מ"ל ו-15 צינורות מ"ל, פוליפרופילן, עמדות ממוספרות, ניתנות לחיטוי | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603, תעודת זהות וזמנים; OD 1/4 אינץ' וזמנים; 3/8 אינץ'. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| מלקחיים לניתוח VWR עם סיכת מנחה עם קצות מעוקלים | 89259-946 | Avantor, מאת VWR | |
| VWR מספריים לניתוח, קצה חד, 4½ " | 82027-578 | Avantor, על ידי VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, דגם 3500I | 12620-946 | Avantor, על ידי VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה