Method Article

אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה

DOI:

10.3791/64360

⸱

January 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Central Laboratory of Women’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2School of Medical Technology and Information Engineering, Zhejiang Chinese Medical University, 3Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV) יכולות להשתחרר מכל סוגי התאים ולשאת חלבון, דנ"א ורנ"א. מולקולות איתות משמשות אינדיקטורים למצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התא. עם זאת, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV, המונעת זיהוי סמנים ביולוגיים במורד הזרם ומחקרי התערבות תרופתית. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיהור של 50-200 ננומטר sEV על ידי ממיין תאי זרימה. לשם כך, נבחרו זרבובית 50 מיקרומטר ולחץ נוזל נדן 80 psi כדי להשיג קצב מיון טוב וזרם צד יציב. מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו לאיתור אוכלוסיות של חלקיקי 100, 200 ו-300 ננומטר. עם מיטוב נוסף של סף הפעלת המתח, הרווח והפיזור הקדמי (FSC), ניתן להפריד את אות ה- sEV מרעשי הרקע. אופטימיזציות אלה מספקות פאנל של הגדרות מיון קריטיות המאפשר לקבל אוכלוסייה מייצגת של sEV באמצעות FSC לעומת פיזור צד (SSC) בלבד. שיטת הבידוד מבוססת ציטומטריית זרימה לא רק מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה, אלא גם מאפשרת סיווג סינכרוני או ניתוח פרוטאום של sEV בהתבסס על ביטוי הסמן הביולוגי, ופותחת יישומי מחקר רבים במורד הזרם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תא משחרר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בגדלים שונים שגורמות למולקולות איתות ותכלילי ממברנה, החשובים לתקשורת בין-תאית1. כלי רכב חשמליים בגדלים שונים ממלאים גם תפקידים ביולוגיים שונים, כאשר 50-200 ננומטר sEV מסוגלים להפיץ במדויק רנ"א, דנ"א וחלבונים למיקום החוץ תאי הנכון. ה- sEV מסייע גם לקבוע את מנגנוני ההפרשה שלהם, הכוללים לא רק את הרגולציה של תהליכים פיזיולוגיים נורמליים כגון מעקב חיסוני, תחזוקת תאי גזע, קרישת דם ותיקון רקמות, אלא גם את הפתולוגיה העומדת בבסיס מספר מחלות כגון התקדמות הגידול וגרורות 2,3. בידוד וניתוח יעילים של sEV הם קריטיים לזיהוי סמנים ביולוגיים ולתכנון התערבויות עתידיות בתר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים

  1. הכינו מדיום תרבית של מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS). תרבית את תא סרטן הלבלב האנושי, PANC-1, בבקבוק תרביתבגודל 75 ס"מ 2 בצפיפות של 1 x 106 תאים / מ"ל. לדגור על התרבית ב 37 ° C עם 5% CO2.
  2. תת-תרבית התאים כאשר צפיפות התאים מגיעה ל-75%-80% תחת תצפית מיקרוסקופית. הסר את המדיום ושטוף 2x עם 3-5 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS; 0.01 M, pH 7.2-7.4).
  3. השליכו את התמיסה, הוסיפו 1-2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA, ותנו לתאים להתנתק עד שהם מתעגלים ומרחפים בתווך מתחת למיקרוסקופ. מוסיפים מדיום טרי, שואפים ומפזריםל-75 ס"מ 2 צלוחיות תרבית עם מדיום תרבית 15 מ"....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דיאגרמת תרשים הזרימה של פרוטוקול הניסוי מוצגת באיור 1. בשיטה זו, מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו כתקני ייחוס להתפלגות גודל חלקיקים. תחת תנאי הפרמטר האינסטרומנטלי הספציפי, ניתן היה להבחין בבירור בין אות החלקיקים לרעשי הרקע בתרשים FSC לעומת SSC באמצעות הצורה הלוגריתמית. אסטרטגיות גאטינג מוצגות באיור 2. R4, R5 ו-R6 מתייחסים למיקומים של מיקרוספרות של 100 ננומטר, 200 ננומטר ו-300 ננומטר, בהתאמה. R7 הוא גבול הזיהוי של רעש אלקטרוני מתחת ל-50 ננומטר, ו-R8 הוא ט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לבידוד וטיהור sEV עם גודל החלקיקים שצוין של 50-200 ננומטר באמצעות ממיין תאי זרימה, שאומת על ידי נת"ע. השיטה פתרה את בעיית צוואר הבקבוק של קבלת sEV עם גודל חלקיקים אחיד וטוהר גבוה, תוך הימנעות מהפרעות של מולקולות ביולוגיות לא קשורות עטופות ברכבים חשמליים גדולים22. ניתוחים מהירים בעלי תפוקה גבוהה אפשריים באמצעות ציטומטריית זרימה, שיכולה ללכוד 100,000 חלקיקים בשנייה ולקבל 70,000 החלטות מיון בשנייה17, מה שמקצר מאוד את הזמן ומשקף את ההטרוגניות של .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר המדעי של אוניברסיטת ג'ג'יאנג לרפואה סינית (2020ZG29), פרויקט מחקר הרווחה הציבורית הבסיסית של מחוז ג'ג'יאנג (LGF19H150006, LTGY23B070001), הפרויקט של מחלקת החינוך של מחוז ג'ג'יאנג (Y202147028) ופרויקט הטכנולוגיה הניסויית של מחלקת המעבדות של אוניברסיטת ג'ג'יאנג (SJS201712, SYB202130).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינור צנטריפוגהבקמן קולטר344058
תרבות צלוחיותקורנינג 
Dulbecco' s שונה מדיוםנשר Corning Cellgro10-013-CV
סרום בקר עובריSUERSUER050QY
סדרן תאי זרימהבקמן קולטרמופלו אסטריוס EQ
תא סרטן לבלב אנושי, תאי PANC-1NANAPANC-1 נתרמו על ידי פרופסור ווייג'ון יאנג, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת ג'ג'יאנג
גודל חלקיקי לייזר ופוטנציאל זטה מנתח MalvernZetasizer Nano ZS 90
מאגר פוספט מלוחGibcoC20012500BT
פוליסטירן מיקרוספירות פלואורסצנטיותבקמן קולטר6602336
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורJEOLJEM-1200EX
תמיסת טריפסין-EDTAGibco1713949
חלקיקי פלורסנט אולטרה קשתבקמן קולטרB28479
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטראופטימה-L80XP
רוטור אולטרה-צנטריפוגהבקמןקולטר SW32TI
430641

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Small Extracellular VesiclesFlow CytometryVesicle IsolationVesicle PurificationCytometric SortingNanoparticle TrackingWestern BlotPolystyrene MicrospheresForward ScatterSide Scatter

Related Articles