מאמר שיטה

בדיקת קרדיוטוקסיות בתפוקה גבוהה באמצעות מונושכבות קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בוגרים

DOI:

10.3791/64364

⸱

24 במרץ 2023

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים (hiPSC-CMs) מציעים חלופה לשימוש בבעלי חיים לבדיקת רעילות לב פרה-קלינית. מגבלה לאימוץ נרחב של hiPSC-CMs בבדיקת רעילות פרה-קלינית היא הפנוטיפ הלא בשל, דמוי העובר של התאים. מוצגים כאן פרוטוקולים להבשלה חזקה ומהירה של hiPSC-CMs.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) משמשים להחליף ולהפחית את התלות בבעלי חיים ובתאי בעלי חיים לצורך בדיקות קרדיוטוקסיות פרה-קליניות. בפורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים, hiPSC-CMs משחזרים את המבנה והתפקוד של תאי שריר הלב האנושיים הבוגרים כאשר הם מאורגנים בתרבית על מטריצה חוץ-תאית אופטימלית (ECM). ECM אנושי הנגזר מתאי גזע פרינטליים (מטריצה חוץ-תאית מעוררת התבגרות) מבשיל את המבנה, התפקוד והמצב המטבולי hiPSC-CM תוך 7 ימים לאחר הציפוי.

חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות מגיבות כצפוי גם לתרופות רלוונטיות מבחינה קלינית, עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב ורעילות לב. ההבשלה של חד-שכבות hiPSC-CM היוותה מכשול לאימוץ נרחב של תאים יקרי ערך אלה למדע רגולטורי וסינון בטיחות, עד כה. מאמר זה מציג שיטות מאומתות עבור ציפוי, הבשלה ופנוטיפ פונקציונלי בתפוקה גבוהה של תפקוד אלקטרופיזיולוגי והתכווצות hiPSC-CM. שיטות אלה חלות על קרדיומיוציטים מטוהרים הזמינים באופן מסחרי, כמו גם קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע שנוצרו בתוך החברה באמצעות פרוטוקולי התמיינות יעילים ביותר, ספציפיים לחדר.

תפקוד אלקטרופיזיולוגי בתפוקה גבוהה נמדד באמצעות צבעים רגישים למתח (VSD; פליטה: 488 ננומטר), פלואורופורים רגישים לסידן (CSFs), או חיישני סידן מקודדים גנטית (GCaMP6). מכשיר מיפוי אופטי בתפוקה גבוהה משמש להקלטות אופטיות של כל פרמטר פונקציונלי, ותוכנה ייעודית מותאמת אישית משמשת לניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים. פרוטוקולי MECM מיושמים לבדיקת תרופות באמצעות אינוטרופ חיובי (איזופרנלין) וחוסמי תעלות ספציפיים לערוץ Ether-a-go-go-go (hERG). משאבים אלה יאפשרו לחוקרים אחרים להשתמש בהצלחה ב- hiPSC-CMs בוגרים לבדיקות סקר פרה-קליניות פרה-קליניות לקרדיוטוקסיות, בדיקות יעילות של תרופות לב וכלי דם ומחקר קרדיווסקולרי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) אומתו בקנה מידה בינלאומי, והם זמינים לבדיקת רעילות לב חוץ גופית 1. ניתן לייצר hiPSC-CMs טהורים במיוחד במספרים כמעט בלתי מוגבלים, לשמר בהקפאה ולהפשיר. עם הציפוי מחדש, הם גם מתעוררים לחיים ומתחילים להתכווץ בקצב המזכיר את הלב האנושי 2,3. למרבה הפלא, hiPSC-CMs בודדים מתחברים זה לזה ויוצרים סינסיטיה פונקציונלית שפועמת כרקמה אחת. כיום, hiPSCs נגזרים באופן שגרתי מדגימות דם של מטופלים, כך שכל אדם יכול להיות מיוצג באמצעות בדיקות בדיקת רעילות לב במבחנה hiPSC-CM 4,5. כך נוצרת הזדמנות לבצע "ניסויים קליניים בצלחת", עם ייצוג משמעותי מאוכלוסיות מגוונות6.

יתרון קריטי אחד על פני גישות קיימות לבדיקת רעילות לב של תאי בעלי חיים ובעלי חיים הוא ש- hiPSC-CMs מנצלים את הגנום האנושי המלא ומציעים מערכת במבחנה עם דמיון גנטי ללב האנושי. זה אטרקטיבי במיוחד עבור פרמקוגנומיקה ורפואה מותאמת אישית - השימוש hiPSC-CMs עבור תרופות ופיתוח טיפול אחר צפוי לספק מרשמים מדויקים, מדויקים ובטוחים יותר לתרופות. ואכן, בדיקות חד-שכבתיות hiPSC-CM דו-ממדיות (2D) הוכיחו את עצמן כמנבאות רעילות לב-ריאוקסית של תרופות, באמצעות פאנל של תרופות בשימוש קליני עם סיכון ידוע לגרימת הפרעות קצב 1,7,8,9. למרות הפוטנציאל העצום של hiPSC-CMs וההבטחה לייעל ולהפוך את פיתוח התרופות לזול יותר, הייתה רתיעה משימוש בבדיקות חדשניות אלה10,11,12.

עד כה, מגבלה מרכזית אחת של אימוץ וקבלה נרחבים של בדיקות סקר hiPSC-CM היא המראה הלא בוגר והעוברי שלהם, כמו גם תפקודם. הנושא הקריטי של הבשלת hiPSC-CM נבדק ונידון בספרות המדעית ad nauseum13,14,15,16. כמו כן, גישות רבות שימשו לקידום הבשלת hiPSC-CM, כולל מניפולציות מטריצה חוץ-תאית (ECM) בחד-שכבות דו-ממדיות ופיתוח רקמות לב מהונדסות-תלת-ממדיות (EHTs)17,18. כרגע, קיימת אמונה רווחת כי השימוש ב- EHTs תלת ממדיים יספק התבגרות מעולה ביחס לגישות מבוססות חד-שכבות דו-ממדיות. עם זאת, חד-שכבות דו-ממדיות מספקות יעילות גבוהה יותר של ניצול תאים והצלחה מוגברת בציפוי בהשוואה ל-EHTs תלת-ממדיים; EHTs תלת-ממדיים משתמשים במספר גדול יותר של תאים, ולעתים קרובות דורשים הכללה של סוגי תאים אחרים שיכולים לבלבל תוצאות. לכן, במאמר זה, ההתמקדות היא בשימוש בשיטה פשוטה להבשלת hiPSC-CMs בתרבית כמונושכבות דו-ממדיות של תאים מצומדים חשמלית ומכנית.

ניתן להשיג הבשלה מתקדמת של hiPSC-CM בחד-שכבות דו-ממדיות באמצעות ECM. ניתן להבשיל את החד-שכבות הדו-ממדיות של hiPSC-CMs באמצעות כיסוי פולידימתילסילוקסאן רך וגמיש, המצופה במטריצת קרום מרתף המופרשת על ידי תא סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (ECM עכבר). בשנת 2016, דיווחים הראו כי hiPSC-CMs בתרבית על מצב ECM רך זה הבשילו פונקציונלית, והציגו מהירויות הולכה פוטנציאליות פעולה ליד ערכי לב בוגר (~ 50 ס"מ לשנייה)18. יתר על כן, hiPSC-CMs בוגרים אלה הציגו מאפיינים אלקטרופיזיולוגיים רבים אחרים המזכירים את הלב הבוגר, כולל פוטנציאל קרום מנוחה היפרפולרי וביטוי של Kir2.1. לאחרונה, דיווחים זיהו ציפוי ECM אנושי שמקורו בתאי גזע פרינטליים המקדם את ההבשלה המבנית של hiPSC-CMsדו-ממדיים 19. כאן, שיטות קלות לשימוש מוצגות למונושכבות hiPSC-CM דו-ממדיות בשלות מבחינה מבנית לשימוש במסכים אלקטרופיזיולוגיים בעלי תפוקה גבוהה. יתר על כן, אנו מספקים אימות של מכשיר מיפוי אופטי לרכישה וניתוח אוטומטיים של פונקציה אלקטרופיזיולוגית חד-שכבתית דו-ממדית hiPSC-CM, תוך שימוש בצבעים רגישים למתח (VSD) ובבדיקות וחלבונים רגישים לסידן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש ב-hiPSC בפרוטוקול זה אושר על ידי ועדת HPSCRO של אוניברסיטת מישיגן (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee). עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים וציוד. ראו טבלה 1 למדיה והרכביה.

1. הפשרה וציפוי hiPSC-CMs בהקפאה זמינים מסחרית להבשלה על מטריצה חוץ-תאית מעוררת התבגרות (MECM)

  1. חממו את כל הריאגנטים לטמפרטורת החדר והחזירו לחות לצלחות MECM עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) או מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל סידן ומגנזיום, למשך שעה אחת לפני ציפוי קרדיומיוציטים (200 מיקרוליטר חיץ לכל באר של צלחת 96 באר).
  2. שטפו את צלחות MECM 2x עם HBSS או PBS המכילות סידן ומגנזיום במשך שעה אחת לפני ציפוי קרדיומיוציטים (200 מיקרוליטר חיץ לכל באר של צלחת 96 בארות) ושמרו על בארות לחות.
  3. הכינו אמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הסר את צינורות קרדיומיוציטים ממיכל החנקן הנוזלי, העבר את הצינורות לקרח יבש ופתח מעט את מכסי הצינור כדי לשחרר לחץ.
    הערה: שחרור לחץ בצינורות חשוב ביותר ! אם יותר מדי לחץ מצטבר בתוך הצינורות, הם עלולים להתפוצץ.
  5. אטמו מחדש את מכסי הצינור והכניסו אותם לאמבט המים להפשרה למשך 4 דקות.
    הערה: לאפשר להם להפשיר לחלוטין, כדי למנוע נזק לתאים עקב הפשרה חלקית.
  6. לאחר הפשרת התאים, רססו את הצינורות באתנול 70% לפני הפתיחה. מעבירים את התאים לתוך צינורות חרוטיים 15 מ"ל עם פיפטה 1 מ"ל. לטפטף באיטיות 8 מ"ל של מדיום ציפוי, מתסיס את הצינור בכל פעם 1 מ"ל מתווסף, כדי לאפשר לתאים להסתגל לשינויים באוסמולריות.
    1. לשטוף את cryovial עם 1 מ"ל של בינוני ציפוי באמצעות פיפטה זכוכית 1 מ"ל. לאחר מכן, לטפטף באיטיות את הכביסה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
  7. צנטריפוגה את הצינורות ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של מדיום ציפוי. הסר aliquot ולבצע ספירת תאים חיים עם hemocytometer. הוסף אמצעי ציפוי נוסף כדי לקבל 7.5 × 105 תאים / מ"ל.
    הערה: כ-10 מ"ל של תרחיף תאים נדרש להכנת 96 בארות.
  8. יש להוציא 100 μL של תרחיף תאים לכל באר של צלחת 96 בארות מצופת MECM באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
    הערה: יש להקפיד להימנע ממשקעים בתאים ולקבל צפיפות תאים אחידה בכל הבארות בזמן הציפוי.
  9. יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך יומיים לפני שינוי המדיום למדיום תחזוקה (200 μL/well). החליפו את אמצעי התחזוקה ביום 5 לאחר ההפשרה. בצע בדיקות EP ביום 7 ואילך, כפי שתואר קודם לכן 8,9. שנה את המדיום כל יומיים כאשר בוחרים להרחיב את תרבית התא.

2. הבחנה מכוונת לב hiPSC וטיהור hiPSC-CM

  1. תמיסת חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) חמה 1x זמינה מסחרית, HBSS ללא סידן ומגנזיום (HBSS--), וצלחות 6 בארות מצופות במטריצת קרום מרתף מסיסה המופרשת על ידי תא סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (ECM עכבר) לטמפרטורת החדר.
  2. סמן את המושבות המובחנות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה ושואף/אבלאט. לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של HBSS--. יש לבצע שתי שטיפות בבארות המכילות >10 נקודות בידול.
  3. שאפו את HBSS - והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת EDTA לכל באר. לדגור על הצלחות עד 5 דקות ב 37 ° C. בדקו את הצלחות לאחר 3 דקות וחפשו מושבות לבנות שקופות וגלויות.
  4. שאפו את פתרון ה-EDTA והוסיפו 1 מ"ל לבאר אחת. עקרו את התאים עם 2 מ"ל של תווך hiPSC על ידי צנרת התרחיף למעלה ולמטה שוב ושוב, באמצעות פיפטה זכוכית 10 מ"ל כדי לנתק את כל תאי הגזע מהבאר, ולהעביר את תרחיף התא לצינור איסוף. חזור על השאיפה והעקירה עם הבארות הבאות.
    הערה: יש לעקור מושבות קשות להרמה בעזרת קצה פיפטת הזכוכית.
  5. לספור את תאי הגזע ולהתאים את נפח צלחת 8.0 × 105 תאים / טוב. תרבית את התאים בתווך hiPSC (2 מ"ל/באר) עד שתאי הגזע מגיעים למפגש של 90% (הפעם נקרא מעתה D0).
  6. הכינו 2 מ"ל של מדיום התמיינות בסיסי בתוספת 4 מיקרומטר של CHIR99021.
  7. על D0, לשטוף כל באר של צלחת 6-באר של תאי גזע עם 1 מ"ל של HBSS לכל באר. החלף את HBSS במדיום התמיינות בסיסי בתוספת 4 מיקרומטר של CHIR99021.
  8. על D1, לא לעשות כלום.
  9. על D2, להכין בינוני התמיינות בסיסית בתוספת 4 מיקרומטר של IWP4.
  10. החלף את המדיום עם 2 מ"ל של IWP4-בתוספת מדיום התמיינות בסיסית לכל באר.
  11. ב-D3, אל תעשו דבר עבור הבחנה ספציפית חדרית. להבחנה ספציפית לפרוזדורים, שאפו את המדיום והוסיפו 2 מ"ל של מדיום בסיסי בתוספת 4 מיקרומטר של IWP4 ותמיסת חומצה רטינואית (RA) 1 מיקרומטר לכל באר.
  12. על D4, שואפים את המדיום ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום בסיסי לכל באר עבור הבחנה חדרית. עבור הבחנה פרוזדורים, לשאוף את המדיום ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום בסיסי בתוספת 1 מיקרומטר תמיסת RA לכל באר.
  13. ב-D5, אל תעשו כלום.
  14. על D6, שואפים את המדיום ומוסיפים 2 מ"ל של מדיום בסיסי לכל באר (הן להבדיל פרוזדורים והן לחדרים).
  15. ב-D7, אל תעשה דבר.
  16. על D8, לשאוף את המדיום ולהוסיף 2 מ"ל של אמצעי תחזוקה cardiomyocyte. החליפו את המדיום כל יומיים עד להפרדת תאים, או עקבו אחר תוכנית חשיפה כרונית לתרופות.

3. טיהור hiPSC-CM באמצעות MACS (מיון תאים המופעל על ידי מגנטית)

  1. שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו כל באר עם 1 מ"ל HBSS--. נתק את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.25% טריפסין/EDTA ודגירה ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 10 דקות. השהה מחדש ויחיד את התאים בכל באר עם 2 מ"ל של מדיום ציפוי כדי להשבית את טריפסין/EDTA.
  2. לאסוף את התאים משש הבארות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם מסננת 70 מיקרומטר. לאחר מכן, לשטוף את המסננת עם 3 מ"ל של ציפוי בינוני. ספור את התאים.
  3. צנטריפוגה את המתלה ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים עם 20 מ"ל של חיץ הפרדת MACS קר כקרח. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות.
  4. השהה מחדש את הגלולה ב 80 μL של חיץ הפרדת MACS קר לכל 5 × 106 תאים. הוסף 20 μL של קוקטייל דלדול קר שאינו קרדיומיוציטים (אנושי) לכל 5 × 106 תאים. מערבבים בעדינות את תרחיף התא ודגורים על קרח במשך 10 דקות.
  5. שטפו את הדגימה על ידי הוספת 4 מ"ל של מאגר הפרדת MACS קר לכל 5 × 106 תאים. צנטריפוגה את הדגימה ב~ 300 × גרם למשך 5 דקות ושאפו את הסופרנטנט.
  6. השהה מחדש את הגלולה ב 80 μL של חיץ הפרדת MACS קר לכל 5 × 106 תאים. הוסף 20 μL של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין קרות לכל 5 × 106 תאים. מערבבים בעדינות את תרחיף התא ודוגרים במשך 10 דקות על קרח.
  7. בזמן הדגירה, הניחו את עמודות הדלדול החיובי (המצוידות במסנני קדם-הפרדה של 30 מיקרומטר) על מפריד MACS, והניחו את צינורות האיסוף המסומנים של 15 מ"ל מתחת לעמודות. עמודה אחת נדרשת עבור כל 5 × 106 תאים.
  8. רכז כל עמודה עם 3 מ"ל של מאגר הפרדת MACS קר. ערבבו את תרחיף התאים שטופל בנוגדנים עם 2 מ"ל של חיץ הפרדת MACS לכל 5 × 106 תאים, והוסיפו לעמודה.
    הערה: אין לבצע צנטריפוגה! לצנטריפוגה בשלב זה יש השפעות מזיקות על תשואת קרדיומיוציטים.
  9. הוסף 2 מ"ל של מאגר הפרדת MACS לכל עמודה, ואסוף את הזרימה עד לאיסוף 12 מ"ל של תרחיף קרדיומיוציטים זורם.
    הערה: לעולם אל תאפשר לעמודות להתייבש לחלוטין.
  10. צנטריפוגה את cardiomyocytes ב ~ 300 × גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, ולהשעות את cardiomyocytes ב 1 מ"ל של מדיום ציפוי.
  11. ספרו את התאים כדי לקבוע את הריכוז, התאימו את הנפח לצפיפות הזריעה הרצויה ולוחמו את התאים. צלחת את cardiomyocytes מטוהרים על לוחות MECM 96-well, כמתואר לעיל בשלבים 1.9-1.11 (7.5 × 105 תאים / טוב).

4. מיפוי אופטי באמצעות צבעים רגישים למתח (VSD) ופלואורופורים רגישים לסידן (CSFs)

  1. הכן את הכמות המתאימה של VSD ב- HBSS עם סידן ומגנזיום, על ידי הוספת 1 μL של צבע VSD לכל מ"ל של HBSS ו- 10 μL של טעינת אדג'ובנט לכל מ"ל של HBSS.
    הערה: בדרך כלל, צלחת 96 בארות דורשת 10 מ"ל של פתרון VSD.
  2. לחלופין, הכינו HBSS עם סידן ומגנזיום בתוספת 5 מיקרומטר CSF. לשאוף את אמצעי תחזוקת קרדיומיוציטים ולהחליף עם 100 μL של VSD או CSF לכל באר של צלחת 96 באר. דוגרים על התאים למשך 30 דקות באינקובטור תרבית התא.
  3. הסר את הצבעים והחלף במדיום בדיקה או HBSS. שיווי משקל ב- 37°C לרכישת מיפוי אופטי של נתונים בסיסיים באמצעות התקן מיפוי אופטי בעל תפוקה גבוהה.
  4. לטפל בתאים עם תרופות לבדיקת חשיפה חריפה, או למפות את התאים שנחשפו באופן כרוני לתרופות מעניינות.
  5. לבדיקת רעילות לב בצלחות של 96 בארות, השתמש בארבע מנות של תרכובת עם לפחות שש בארות בכל מנה. השתמש במינונים הנעים מלמטה ומעלה ריכוז הפלזמה הטיפולית היעילה, כולל מנה של ריכוז הפלזמה הטיפולית היעילה הקלינית.
  6. לדלל את התרופות בדימתיל סולפוקסיד, לאחסן אותם כתמיסות מלאי ב -20 ° C, ולאחר מכן לדלל אותם HBSS לריכוזים הרצויים.
  7. בצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות בסיסיות לפני יישום התרופה, כמתואר בסעיף 5. לאחר יישום התרופות, בצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות לפחות 30 דקות מאוחר יותר עבור מחקרים כרוניים. עיין בסעיפים הבאים לקבלת מיפוי אופטי, הליכי רכישה וניתוח של נתונים.

5. מיפוי אופטי באמצעות מחוון סידן מקודד גנטית (GECI)

  1. לוחות זמינים מסחרית או hiPSC-CMs מטוהרים MACS, כמתואר לעיל, באמצעות לוחות 96 בארות מצופות MECM כדי ליצור hiPSC-CMs בוגרים. כדי ליצור חד-שכבות מתמזגות, צלחת 7.5 × 104 ס"מ לכל באר מכל צלחת 96 באר. יש להשתמש באמצעי ציפוי.
  2. לאחר 48 שעות בציפוי בינוני, לעבור למדיום תחזוקת קרדיומיוציטים.
  3. ביום 4 לאחר הפשרה וציפוי מחדש, הוסף אדנווירוס רקומביננטי לביטוי GCaMP6m (AdGCaMP6m) לתאים בריבוי זיהומים (MOI) = 5. הוסף את הנגיף באמצעות מדיום בדיקת CM.
    הערה: כאן, ניסויים באמצעות GCaMP6m בוצעו בקרדיומיוציטים iCell2 מספק מסחרי.
  4. ביום 5, הסר את מדיום adGCaMP6m והחלף בסל"ד טרי + B27 (מדיום תחזוקת קרדיומיוציטים).
  5. ביום השביעי, התבוננו ב-CMs באמצעות מיקרוסקופ או מכונת המיפוי האופטית, כדי לדמיין התכווצויות ספונטניות ומעברי סידן תואמים.
  6. ביום 7 ואילך, לבדיקת תרופות, העבירו ישירות לוחות 96 בארות של חד-שכבות hiPSC-CM בוגרות המבטאות GCaMP6m למצלמת המיפוי האופטית מהאינקובטור לאיסוף נתונים בסיסיים.
  7. לאחר איסוף נתונים אלקטרופיזיולוגיים, יש להחזיר את לוחות ה-CMs לאינקובטור תרביות הרקמה, לצורך מדידות בנקודת זמן עוקבת.
  8. לאחר הרישומים הבסיסיים, יש למרוח את התרופות, תוך שימוש בלפחות ארבע מנות של כל תרופה ולפחות שש בארות בכל מנה. אזנו את התרופות על התאים למשך 30 דקות לפחות לפני איסוף הנתונים. חממו את טמפרטורת הבאר ל~ 37 מעלות צלזיוס לפני ובמהלך רכישת הנתונים.
  9. לאחר הקלטות בסיסיות של צלחת שלמה, הוסף איזופרוטרנול (500 ננומטר) לכל באר כדי לאפשר נתוני תגובה חזקים לתרופות. כמת את ההשפעות של איזופרוטרנול על קצב פעימות חד-שכבתיות, משרעת התכווצות (משרעת מעבר סידן) ומשך מעבר הסידן (ראה איור 6), כמתואר בסעיף 5.

6. רכישת נתוני מיפוי אופטי וניתוח

  1. ודא שהמצלמה של התקן המיפוי האופטי, הטרנסילטור ומחמם הלוחות מופעלים.
  2. פתח את תוכנת הרכישה וקבע את מיקום שמירת הקבצים.
  3. פתחו את המגירה הקדמית ומקמו את הצלחת על מחמם הצלחות.
  4. רכוש מסגרת כהה על ידי לחיצה על כפתור מסגרת כהה .
  5. בחר משך זמן (10-30 שניות) וקצב פריימים של רכישה (לדוגמה, 100 פריימים לשנייה; 250 פריימים לשנייה לרזולוציה זמנית גבוהה יותר) ולחץ על התחל רכישה.
  6. פתח את תוכנת הניתוח ובכרטיסייה ייבוא/סינון , בחר אתר קובץ בודד או פרוס מרובים כדי לבנות מחדש לוחית.
  7. בחר Parameter Mode (APD או CaTD), הזן Distance per Pixel והשתמש באשף הבארות כדי לקבוע את מיקום הבארות בתמונה. לחץ על עבד שמירה כדי לעבור לכרטיסיה הבאה.
  8. פתח את הכרטיסיה ROI (אזורי עניין) ובחר לצייר את החזר ההשקעה באופן ידני, אוטומטי או לא להשתמש בהחזר השקעה כלל, אשר לאחר מכן ישקול את כל הבאר לניתוח. לאחר בחירת החזר ההשקעה, לחץ על הלחצן תהליך/שמירה כדי לעבור לשלב הבא. סמן את התיבות הסתר בארות והצג רק מסוננים כדי להציג באופן חזותי את החזר ההשקעה.
  9. פתח את הכרטיסיה ניתוח ובפינה השמאלית העליונה של המסך, בחר כל באר או החזר השקעה כדי לאשר את הדיוק של זיהוי פעימות אוטומטי. הוסף או הסר פעימות מהעקבות על-ידי הקשה על Add Beat/ Save Beats, או על-ידי בחירת Individual Beat והקשה על Delete במקלדת.
  10. לחלופין, השתמש בתכונה מפות חום ממוצעות כדי ליצור מפות חום של פרמטרים נבחרים עבור הצלחת.
  11. לחץ על הלחצן Time-Space Plot בכרטיסייה Analysis כדי להציג נתונים באופן חזותי עבור כל באר או החזר השקעה. לאחר שווידאת שזיהוי הפעימות מדויק, המשך אל יצוא הכרטיסייה ובחר תבנית קובץ. הקש Export וצור תיקייה שאליה הנתונים ייוצאו. המשך לפתיחת קבצי נתונים והפעל את שגרת הניתוח הסטטיסטי שנבחרה.
    הערה: קובצי .xlxs מועדפים מכיוון שכל הפרמטרים מיוצאים בקובץ יחיד; תבניות אחרות (.csv או .tsv) מייצרות קובץ אחד לכל פרמטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבשלת hiPSC-CM המאופיינת בניגודיות פאזה והדמיה קונפוקלית אימונופלואורסצנטית
ציר הזמן להבשלה בתיווך ECM של hiPSC-CMs הזמינים מסחרית באמצעות לוחות 96 בארות מצופות MECM מוצג באיור 1A. נתונים אלה נאספים באמצעות קרדיומיוציטים זמינים מסחרית המגיעים למעבדה כמו בקבוקונים cryopreserved של תאים. כל בקבוקון מכיל >5 × 106 קרדיומיוציטים ברי קיימא. התאים הם ~ 98% טהורים ונבדקים בקפדנות לבקרת איכות (תעודת ניתוח מסופקת עם כל בקבוקון). המספר הגבוה של CMs מאפשר הפשרה וציפוי C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן מספר גישות שונות לבדיקת רעילות לב חוץ גופית באמצעות hiPSC-CMs. מאמר "שיטות עבודה מומלצות" שפורסם לאחרונה על השימוש ב- hiPSC-CMs הציג את מבחני המבחנה השונים, את הקריאות העיקריות שלהם, וחשוב מכך, את הפירוט של כל בדיקה לכימות תפקוד אלקטרופיזיולוגי של הלב האנושי20. בנוסף לשימוש באלקטרודות חודרות ממברנה, המדד הישיר ביותר של תפקוד אלקטרופיזיולוגי של הלב האנושי מסופק על ידי VSDs. קריאות בדיקת VSD מאפשרות הדמיה ישירה וכימות של פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים קריטיים, כולל משך פוטנציאל פעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TJH הוא יועץ ויועץ מדעי ל- StemBioSys, Inc. שחפת היא עובדת של StemBioSys, Inc. AMR ו- JC הם יועצים לשעבר ל- StemBioSys, Inc. . TJH, TB, AMR ו- JC הם בעלי מניות ב- StemBioSys, Inc. .

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH HL148068-04 ו- R44ES027703-02 (TJH).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין EDTAGibco25200-056
0.5 מ"ג/מ"ל BSA (7.5 ומיקרו; mol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 גרם/500 מ"ל HEPES (25 מילימול/ליטר)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mמעבדות ביולוגיות וקטוריות1909
אלבומין אנושיסיגמאA9731-1G
נוגדן אלפא אקטיניןThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
מדיום בדיקה שקוף (פלואורובריט)ThermoFisherA1896701לאדנווירוס העברה
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (סרום בקר עוברי)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM מדיית תחזוקהFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
זום חגורה Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
איזופרוטרנולMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
חומצה L-אסקורבית 2-פוספט ססקימגנזיום מלח הידרטסיגמאA8960-5g
L-גלוטמיןGibcoA2916801
עמודות LSMiltenyii Biotec130-042-401
מאגר MACS (מאגר ריצה autoMACS)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker אדוםThermoFisherM7512
Nautilus HTS מיפוי אופטי CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R מיקרוסקופ קונפוקליחומצות
Gibco11140-050
מסנן טרום הפרדהMiltenyii Biotec130-041-407
ערכת בידוד קרדיומיוציטים שמקורה ב-PSC, Miltenyii Biotec אנושי130-110-188
מפריד PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS (מגנט)Miltenyii Biotec130-091-051
חומצה רטינואיתSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
נוגדן TnI (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית - תמיסת EDTA)Gibco15040-066
Y-27632 דיהידרוכלורידTocris1254
β-מרקפטואתנולGibco21985023
אמינו לא חיוניות ניקון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova,, et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834(2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638(2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071(2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941(2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368(2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HiPSC

מאמרים קשורים