Method Article

טיפול בסוגיות מעשיות במיקרו-הזחה מבוססת מיקרוסקופיה של כוח אטומי על צמחי סחוס מפרקיים אנושיים

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים גישה שלב אחר שלב לזיהוי וטיפול בבעיות הנפוצות ביותר הקשורות למיקרו-כניסות במיקרוסקופ כוח אטומי. אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות על צמחי סחוס מפרקי אנושיים מקומיים המאופיינים בדרגות שונות של ניוון המונע על ידי אוסטאוארתריטיס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ללא ספק, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא כיום אחת הטכניקות החזקות והשימושיות ביותר להערכת מיקרו ואפילו ננו-רמזים בתחום הביולוגי. עם זאת, כמו בכל גישה מיקרוסקופית אחרת, אתגרים מתודולוגיים יכולים להתעורר. בפרט, המאפיינים של המדגם, הכנת הדגימה, סוג המכשיר, ואת הבדיקה הזחה יכול להוביל ממצאים לא רצויים. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את הבעיות המתעוררות הללו על צמחי סחוס מפרקי בריאים כמו גם ניווניים. לשם כך, אנו מראים תחילה באמצעות גישה שלב אחר שלב כיצד ליצור, לדרג ולסווג באופן חזותי דיסקיות סחוס מפרקי ex vivo לפי שלבים שונים של ניוון באמצעות הדמיה פלואורסצנטית דו-ממדית גדולה של פסיפס שלם של כל צמחי הרקמה. החוזק העיקרי של מודל ex vivo הוא בכך שהוא מורכב מסחוס אנושי זקן, ילידי, המאפשר לחקור שינויים הקשורים לדלקת מפרקים ניוונית מהתחלה מוקדמת ועד להתקדמות. בנוסף, מוצגים גם מלכודות נפוצות בהכנת רקמות, כמו גם הליך AFM בפועל יחד עם ניתוח הנתונים הבאים. אנו מראים כיצד שלבים בסיסיים אך חיוניים כגון הכנה ועיבוד דגימה, מאפייני דגימה טופוגרפיים הנגרמים על ידי ניוון מתקדם ואינטראקציה בין קצה הדגימה יכולים להשפיע על רכישת נתונים. אנו גם נתונים לבדיקה של הבעיות הנפוצות ביותר ב- AFM ומתארים, במידת האפשר, כיצד להתגבר עליהן. ידיעת מגבלות אלה היא בעלת חשיבות עליונה לאיסוף נכון של נתונים, פרשנותם, ובסופו של דבר, להטמעת הממצאים בהקשר מדעי רחב.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשל גודלם ההולך ומצטמצם של מכשירים ומערכות אלקטרוניים, ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה וציוד מבוססי מיקרו וננו צברה תאוצה. מכשיר אחד כזה הוא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שיכול לסרוק משטחים ביולוגיים ולאחזר מידע טופוגרפי או ביומכני בקנה מידה ננומטרי ומיקרומטרי 1,2. בין התכונות העצומות שלה, כלי זה יכול להיות מופעל כמו מיקרו, כמו גם nano-indenter כדי לקבל מידע על התכונות המכניות של מערכות ביולוגיות שונות 3,4,5,6. הנתונים נאספים על ידי מגע פיזי עם פני השטח באמצעות בדיקה מכנית, אשר יכול להיות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נעשה שימוש בקונדילים של עצם הירך שנאספו מחולים שעברו ניתוח ארתרופלסטי כולל של הברך בבית החולים האוניברסיטאי של טובינגן, גרמניה. במחקר זה נכללו רק דגימות סחוס מפרקי מחולים עם פתולוגיות מפרקים ניווניות ופוסט-טראומטיות. אישור ועדת האתיקה המחלקתית, המוסדית והמקומית התקבל לפני תחילת המחקר (פרויקט מס' 674/2016BO2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות.

הערה: תרשים זרימה של שלבי הניסוי בסדר הכרונולוגי שלהם מוצג באיור 1.

1. עיבוד רקמות ויצירת דיסקי סחוס

  1. הכנת רקמות
    1. לאחר כריתה לאחר הניתוח, הניחו את דגימות הסחוס במיכל מלא בתווך הנשר של דולבקו (DMEM....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מכשיר חיתוך מתוצרת עצמית, הצלחנו לשתול וליצור דיסקיות סחוס קטנות (4 מ"מ x 1 מ"מ) מקונדילים אנושיים טריים המכילים תבנית מרחבית תאית אחת30 של מיתרים בודדים (SS, איור 2A), מיתרים כפולים (DS), אשכולות קטנים (SC), אשכולות גדולים (BC; איור 2A), ומפוזר (איור 2B). חציל סחוס מייצג מתואר באיור 3A. בחירת הדיסקים המציגים רק סוג אחד של תבנית נעשתה באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מלמעלה למט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמחלה מתקדמת ורב-גורמית, OA מעוררת שינויים מבניים ותפקודיים בסחוס המפרקי. במהלך OA, ליקויים בתכונות מכניות מלווים בשינויים מבניים וביוכימיים על פני השטח של הסחוס המפרקי27,31. האירועים הפתולוגיים המוקדמים ביותר המתרחשים ב- OA הם דלדול פרוטאוגליקן יחד עם הפרעה ברשת הקולגן32,33,34. קשה לאתר ולזהות שינויים מוקדמים כאלה על פני השטח באמצעות בדיקות בתפזורת, מכיוון שההתנהגות המכ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למנתחים האורתופדיים מהמחלקה לכירורגיה אורתופדית בבית החולים האוניברסיטאי של טובינגן על מתן דגימות הרקמה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BMerck KGaA, דרמשטדט, גרמניה1397-89-3
ראש מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM);CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, ברלין, גרמניהJPK00518
דבק דגימה תואם ביולוגית Bruker Nano GmbH, ברלין, גרמניהH000033
Calcein AMCayman, אן ארבור, מישיגן, ארה"ב14948כתם חדיר לקרום התא, המשמש למיון דיסק סחוס - הדמיה מלמעלה מבט
שלוחהBruker Nano GmbH, ברלין, גרמניהSAA-SPH-5UMשם תדר: 30KHz, k: 0.2N/m, שם אורך: 115μ M, מספר רוחב: 40μ מ,  גיאומטריה: מלבני, קצה גלילי עם 5μ m רדיוס קצה
מכשיר ctting סחוס תוצרת עצמית n/aמכשיר חיתוך פלסטיק המכיל שלמים מוגדרים מראש של מצלמת CDD בגודל 4 מ"מ על 1 מ"מ
המשולבת ב-AFMThe Imaging Source Europe GmbH, ברמן, גרמניהDFK 31BF03
מצלמת CDD משולבת במיקרוסקופ הקרינהLeica Biosystems, Wetzlar, גרמניהDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, גרמניהCM3050S 
תוכנת עיבוד נתונים עבור AFMBruker Nano GmbH, ברלין, גרמניהn/aגרסה 5.0.86,  ניתנת להורדה בחינם מהאתר הבא https://customers.jpk.com
מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) Gibco, Life Technologies, דרמשטדט, גרמניה41966052
מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, גרמניה11889113
מחזיק קנטיבר בלוק זכוכיתBruker Nano GmbH, ברלין, גרמניהSP-90-05בלוק זכוכית ארוך במיוחד עם פנים זוויתיות, שתוכנן במיוחד לשימוש עם JPK PetriDishHeaterTM (Bruker).
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה (משולב ב-AFM)AxioObserver D1, מיקרוסקופיה של קרל זייס, יינה, גרמניהL201306_03
מדיום L-15 של לייבוביץ ללא L-גלוטמין Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניהF1315
שקופיות זכוכית מיקרוסקופסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בCLS294775X50
מדיום הרכבה עם DAPIibidi GmbH, Grä felfing, גרמניה50011מדיית הרכבה עם DAPI גרעיני (4′,6-diamidino-2-phenylindole) צביעה נגדית המשמשת לדיסקי סחוס  הדמיית
צד פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"בP4333
מחמם צלחות פטרי הקשור ל-AFM (מחמם כלים פטרי)Bruker Nano GmbH, ברלין, גרמניהT-05-0117
אזמלFeather Medical Products, אוסקה, יפן2023-01
חצאית סיליקוןBruker Nano GmbH, ברלין, גרמניהn/aקרום סיליקון מגן (D55x0.25) המונח על בסיס בסיס בלוק הזכוכית כדי למנוע עיבוי בינוני בראש ה-AFM.
תוכנית סטטיסטית - SPSSIBM, Armonk, ניו יורק, ארה"בSPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
כלי תרבית רקמה TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, שוויץTPP93040
תרכובת Tissue-tek O.C.T.Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, הולנדSA6255012מדיום הטבעה מסיס במים 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application o....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyMicro IndentationArticular Cartilage ExplantsOsteoarthritis ProgressionCartilage Mechanical PropertiesFluorescence ImagingYoung s ModulusForce Distance CurvesSample PreparationCantilever Calibration

Related Articles