הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64377

⸱

10 במרץ 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

במאמר זה

סיכום

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

תקציר

תאים יכולים לשנות באופן פעיל את צורתם ולהפוך לתנועתיים, תכונה התלויה ביכולתם לארגן מחדש באופן פעיל את המבנה הפנימי שלהם. תכונה זו מיוחסת לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, בעיקר שלד האקטומיוזין (actomyosin cytoskeleton), שהוא ג'ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועי מיוזין וחלבוני עזר בעלי תכונות כיווץ פנימיות. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי. עם זאת, מודל זה אינו יכול תמיד להסביר את תוצאות הניסוי, אשר עקביות יותר עם תמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי כחומר פעיל פורואלסטי - רשת אלסטית המשובצת בציטוזול. שיפועי התכווצות הנוצרים על ידי מנועי המיוזין מניעים את זרימת הציטוזול על פני נקבוביות הג'ל, מה שמסיק שהמכניקה של שלד הציטו-שלד והציטוזול צמודים זה לזה. אחד המאפיינים העיקריים של פורואלסטיות הוא הרפיה דיפוזית של לחצים ברשת, המאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל התלוי במודולוס האלסטי של הג'ל, בנקבוביות ובצמיגות הציטוזול (ממס). מכיוון שלתאים יש דרכים רבות לווסת את המבנה שלהם ואת תכונות החומר שלהם, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי האופן שבו מכניקת השלד הציטו-שלד ודינמיקת זרימת הציטוזול מצומדים עדיין אינה מובנת. כאן, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת כדי לאפיין את התכונות החומריות של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל עבור שלד התא. התכווצות הג'ל מונעת על ידי התכווצות מנוע מיוזין, מה שמוביל להופעת זרימה של הממס החודר. המאמר מתאר כיצד להכין את הג'לים האלה ולערוך ניסויים. כמו כן, אנו דנים כיצד למדוד ולנתח את זרימת הממס והתכווצות הג'ל הן ברמה המקומית והן ברמה העולמית. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים ניתנים. לבסוף, נדונים אתגרי הניסוי והמלכודות הנפוצות, כולל הרלוונטיות שלהם למכניקת השלד התא.

מבוא

לתאים חיים יש תכונות מכניות ייחודיות. מלבד היכולת להגיב באופן פסיבי לכוחות יישומיים, הם מסוגלים גם לייצר כוחות באופן פעיל בתגובה לגירויים חיצוניים1. מאפיינים אלה, החיוניים למגוון תהליכים תאיים, בעיקר במהלך תנועתיות התא, מיוחסים בעיקר לתכונות המכניות והדינמיות של שלד התא, במיוחד שלד התא, שהוא ג'ל פעיל של חוטי אקטין קוטביים, מנועים מולקולריים מיוזין וחלבונים נלווים. רשתות אקטומיוזין אלה מציגות תכונות ארגון עצמי והתכווצות מהותיות המונעות על ידי חלבונים מוטוריים מיוזין, אשר מצליבים את חוטי האקטין ויוצרים באופן פעיל לחצים מכניים ברשת המונעת על ידי הידרוליזה ATP2.

מחקרים ניסיוניים ותיאורטיים רבים נערכו כדי לחקור את התכונות החומריות של שלדציטו-שלד 3. הדעה המקובלת היא ששלד הציטו-שלד מתנהג כחומר ויסקו-אלסטי4. משמעות הדבר היא כי בטווחי זמן קצרים, שלד הציטו-שלד מתנהג כחומר אלסטי, ובטווחי זמן ארוכים, הוא מתנהג כנוזל צמיגי עקב החלבונים הצולבים והניתוק המוטורי של מיוזין (וחיבור מחדש), המאפשר לרשת להתחלף באופן דינמי. עם זאת, במצבים רבים, המודל הוויסקו-אלסטי אינו יכול לתאר את תוצאות הניסוי, אשר תואמות יותר לתמונה המתארת את השלד הציטו-אלסטי, ובאופן כללי יותר, הציטופלסמה של התא המתוארת כחומר פעיל פורואלסטי 5,6. שני מאפיינים עיקריים מאפיינים סוגים אלה של חומרים. (i) התכונה העיקרית הראשונה היא יצירת זרימה של הציטוזול החודר ("הממס") על פני נקבוביות הג'ל על ידי שיפועי התכווצות המונעים על ידי מנועי המיוזין, העומדים בבסיס תהליכים כגון בלימת תאים7, תנועתיות8 ותנודות בצורת תא9. הופעתם של זרמים ציטוסוליים כאלה יכולה להיות מקומית, עבור blebbing, או גלובלית, כמו בתנועתיות התא. במקרה האחרון, הלחצים המופעלים על ידי התכווצות בחלק האחורי של התא מניעים את זרימת הנוזל הציטוסולי לכיוון חזית התא, אשר מחדש את מאגר החלבונים הדרוש להרכבת למליפודיה8. (ii) התכונה העיקרית השנייה היא שהרפיית הלחצים היא דיפוזית ומאופיינת בקבוע דיפוזיה יעיל, , התלוי במודולוס האלסטי של הג'ל, נקבוביות הג'ל וצמיגות הממס5. קבוע הדיפוזיה הפורואלסטי קובע כמה מהר המערכת מגיבה ללחץ מופעל. קבועי דיפוזיה גבוהים יותר מתאימים לחלוקה מחדש מהירה יותר של מתח. זה, בתורו, קובע כמה זמן לוקח לנוזל הציטוסולי התוך-תאי להיות מופץ מחדש בתוך התא בעקבות לחץ מכני מופעל, בין אם הוא חיצוני או פנימי, כגון הלחצים התכווצות הפעילים הנוצרים על ידי מנועי מיוזין. דוגמאות אלה, אם כן, מראות כי המכניקה של השלד והציטוזול מצומדים זה לזה באופן הדוק ולא ניתן לטפל בהם בנפרד3.

מכיוון שתאים יכולים לווסת את התכונות המכניות שלהם במגוון דרכים, יחסי הגומלין בין מכניקת הרשת ודינמיקת זרימת הנוזלים עדיין אינם מובנים. גישה חלופית רבת עוצמה היא להשתמש במערכות משוחזרות במבחנה המאפשרות שליטה מלאה במרכיבים המיקרוסקופיים השונים ובפרמטרים של המערכת, מה שהופך את מערכות המודל הללו לאופטימליות לניתוח פיזיקלי10,11. גישה זו יושמה בהצלחה כדי לחקור את ההשפעה של הרכב חלבונים וגיאומטריה של המערכת על תנועתיות מבוססת אקטין 12,13,14,15,16,17,18, דפוס דו-ממדי של רשתות אקטומיוזין 19,20,21,22ויחסי הגומלין בין התכווצות הרשת לבין דינמיקת זרימת הנוזלים של ג'לים אקטומיוזינים פורואלסטיים, העומדים במוקד מאמר זה23.,

בכתב יד זה, הכנת רשתות אקטומיוזין אלסטיות מתכווצות של ממדים ניתנים לשליטה ותכונות חומריות נדונה בהתבסס על עבודתם של Ideses et al.23. הדינמיקה של הג'ל המתכווץ והממס המנוקז מנותחים ומכומתים, שבאמצעותם הוכח כי ניתן לתאר ג'לים אקטומיוזינים אלה כחומר פעיל פורואלסטי. חקר ההשפעה של צמיגות ממס על דיפוזיביות מתח מאשר עוד יותר את האופי הפורובלסטי של רשתות אלה. יחסי קנה המידה השונים המשמשים לכימות נתונים מסופקים. לבסוף, נדונים גם אתגרי הניסוי, המלכודות הנפוצות, והרלוונטיות של תוצאות הניסוי לשלד התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. טיפול במשטח זכוכית ופסיבציה:

הערה: חלק זה כולל שלושה שלבים עיקריים (ראה איור 1): (i) ניקוי והידרופיליזציה, (ii) סילניזציה, ו-(iii) פסיבציה של פני השטח.

  1. ניקוי והידרופיליזציה
    1. השתמש בפתרון Piranha לניקוי משטח זכוכית.
      הערה: תמיסת פיראנה היא תערובת של 30% H 2 O 2 ו- 70% H2SO4 (טבלת חומרים). מטרתו העיקרית היא להסיר זיהומים אורגניים ממשטחי החלקה ולחשוף את קבוצות OH על משטח הזכוכית. באופן זה, משטח הזכוכית הופך הידרופילי.
    2. מניחים 10-12 #1.5 (22 מ"מ x 22 מ"מ) כיסויי זכוכית (טבלה של חומרים) במחזיק פוליטטרפלואוראתילן תוצרת בית (שטח בסיס: 5.5 ס"מ x 5.5 ס"מ). מעבירים את מחזיק הפוליטטרה-פלואוראתילן לכוס 400 מ"ל (טבלת חומרים), ודגרים עליו עם 300 מ"ל של תמיסת פיראנה למשך שעתיים. בצע שלב זה על קרח ובמכסה מנוע כימי.
      הערה: מוט הפוליטטרה-פלואוראתילן המוברג לבסיס המחזיק הוא באורך 12 ס"מ, ארוך יותר מהכוס (11 ס"מ), המאפשר העברה/משיכה בטוחה של המחזיק אל תמיסת פיראנה וממנה. מכיוון שתמיסת פיראנה עדיין יכולה להיות תגובתית מאוד וחמה מאוד, חובה לעצור את התגובה. הדרך הקלה ביותר לעצור את התגובה היא לשפוך את תמיסת פיראנה למי (ברז) כדי להשיג דילול פי 50 (לפחות). לאחר מכן ניתן להשליך את הפתרון בבטחה. לעולם אל תשמרו את תמיסת הפיראנה המשומשת בבקבוק זכוכית סגור – זה עלול להסתיים בפיצוץ בקבוק.
    3. מעבירים את מחזיק הפוליטטרה-פלואוראתילן לכוס נקייה מלאה במים טריים בזיקוק כפול (DDW) כדי לשטוף עודפי פיראנה מהכיסויים.
    4. מעבירים את הכד לאמבט סוניקציה (טבלת חומרים), ומסננים בעוצמה מלאה של 80 הרץ למשך 10 דקות ב-25°C. חזור על שלב זה פעמיים נוספות עם DDW טרי. השתמש ב- DDW טרי בכל פעם.
  2. סילניזציה
    1. מעבירים את המחזיק לכוס נקייה (400 מ"ל) מלאה ב-300 מ"ל מתנול טהור (טבלת חומרים) ולאחר מכן לאמבט סוניקציה (טבלת חומרים). בצע סוניקציה ב-80Hz בעוצמה מלאה למשך 30 דקות ב-25°C.
    2. לאחר סוניקציה, להעביר את המחזיק לתוך תמיסת סילאן מוכן באמצעות 15 מ"ל של DDW, 3.1 מ"ל של חומצה אצטית (טבלה של חומרים), 340 מ"ל של מתנול, ו 7.6 מ"ל של סילאן ((3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane) (טבלה של חומרים). אוטמים את הכד עם פרפילם, ושומרים אותו במקרר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: ההכנה והטיפול בתמיסת הסילאן חייבים להתבצע במכסה מנוע כימי. לאחר שלב הסילניזציה, הכניסו את תמיסת הסילאן המשומשת (פסולת) לבקבוק זכוכית ייעודי בתוך מכסה המנוע הכימי.
    3. למחרת, להעביר את המחזיק לתוך נקייה מלא 300 מ"ל של מתנול טהור במשך 15 שניות. לאחר מכן, להעביר את המחזיק לתוך כד נקי, לא לפני ייבוש החלק התחתון של מחזיק polytetrafluoroethylene כדי להסיר מתנול עודף. מעבירים את הכד לתנור (טבלת חומרים) לייבוש כיסויי הזכוכית למשך 5 דקות בחום של 120°.
  3. פסיבציה של פני השטח עם פולימר אינרטי
    1. השיגו פסיבציה של פני השטח על ידי דגירה של כיסויי הזכוכית בפולימר אינרטי (Table of Materials). עבור כל ניסוי, קחו שתי כיסויים והניחו אותן בצלוחית פטרי המצופה בשכבת פארפילם שנוקתה תחילה באתנול (EtOH) (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (טבלת חומרים).
    2. יש לדגור על כל כיסוי עם 1 מ"ל של 4 מ"ג·מ"ל−1 5 kDa משקל מולקולרי מתוקסי פוליאתילן גליקול מלימיד (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (טבלת חומרים) במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS) (טבלת חומרים) למשך שעה אחת ב-22°C.
      הערה: הנחת החלקות הכיסוי על שכבת פרפילם הידרופובית מגבילה את תמיסת הפולימר PEG ההידרופילית למשטח כיסוי הזכוכית. זמן הדגירה הוא קריטי להשגת פסיבציה אופטימלית. יש להשתמש בזמני הדגירה הנעים בין 45 דקות לשעתיים. מעל זמן הדגירה הזה, משטח כיסוי הזכוכית יכול להתדרדר, מה שמוביל להידבקות חלבונים ולאובדן שקיפות.
    3. בסוף תהליך הדגירה, לשטוף כל כיסוי עם 5 מ"ל של DDW, ולייבש עם זרימה של N2 (גז). אין לייבש את הכיסויים תחת שואב אבק. מכיוון שהכיסויים חייבים להישמר רטובים לאחר פסיבציה, הניחו מיד 1 מ"ל של 10 מ"ל טריס על המשטחים הפגילטים. יש להשתמש בכיסויים תוך שעתיים.
      הערה: השלבים השונים חייבים להתבצע בתא זרימה למינרי כדי למנוע זיהום משטח זכוכית.

2. טיהור חלבון

  1. לטהר G-actin מאבקת אצטון שריר השלד ארנב באמצעות שיטת סינון ג'ל24.
    1. טיהור אקטין לוקח שבוע אחד. שמור את G-actin מטוהר במאגר G (5 mM Tris pH 7.8, 0.01% NaN3, 0.1 mM CaCl 2,0.2 mM ATP ו- 1 mM DTT), ואחסן אותו על קרח. השתמש בפתרון תוך שבועיים.
      הערה: החליפו את הקרח כל כמה ימים.
    2. תייגו את האקטין בצבע פלואורסצנטי16 (טבלת חומרים). לטהר את GST-fascin מבוסס על השיטה של אונו et al.25. יש להקפיא במהירות הבזק את שני החלבונים בנוזל N2, ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
  2. השתמש בפרוטוקול סטנדרטי כדי לטהר מיוזין II משריר השלד של ארנב26. מאגר המניות של מיוזין II (דימרים) מטוהר כולל 10 mM Tris pH 7.4, 0.5 M KCl ו-35% w/v סוכרוז. הקפיאו במהירות הבזק את המיוזין בנוזל N2, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
    הערה: הריכוז הגבוה של KCl שומר על מנועי המיוזין בצורה דימרית, בעוד שהאחוז הגבוה של סוכרוז מבטיח שפעילות המנועים לא תיפגע בעת הקפאה. השתמש פיפטה ייעודית לטיפול בנוזל צמיג בעת עבודה עם תמיסות מלאי מיוזין II (רשימת חומרים).
    1. תייגו את דימרים מיוזין II בצבע פלואורסצנטי (טבלה של חומרים) בזוגות של שאריות ציסטאין מהונדסות19,27. השתמש במוטנט RLC RLC עוף למטרה זו26. יש להקפיא במהירות הבזק את המיוזין II המסומן בנוזל N2, ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: הליך תיוג זה מבטיח שהמיוזין המסומן פעיל כחלבון מיוזין II הטבעי.
  3. השתמש בספקטרופוטומטר UV-Vis (טבלת חומרים) כדי למדוד את ספיגת תמיסות החלבון, ולהסיק את ריכוזי החלבונים באמצעות חוק באר-למברט באמצעות מקדמי ההכחדה הבאים: G-actin (ε290 = 26,460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99,330 M−1·cm−1), מיוזין II dimer (ε280 = 268,800 M−1·cm−1), ומוטנט RLC A (ε280 = 3,960 M−1·cm−1)19.

3. הכנת מדגם

הערה: פילמרי מונומרים אקטין בנוכחות אגרגטים גדולים של מנועי מיוזין II ואת crosslinker פסיבי חזק fascin כדי לייצר רשתות אקטומיוזין אלסטי מכווץ מקרוסקופי19,23. הוספת חרוזים פלואורסצנטיים לתמיסה מאפשרת מעקב אחר זרימת הממס במהלך התכווצות הג'ל.

  1. תמיסת חלבון ("actomyosin")
    1. למעט G-actin, יש לשמור את החלבונים בטמפרטורה של -80°C באליציטוטים קטנים, ולהפשיר אותם בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש. הנפח הכולל של תמיסת האקטומיוזין הוא 40 μL.
    2. הכן את התמיסה על ידי ערבוב 10 mM Tris pH 7.4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, מערכת התחדשות ATP (0.5 מ"ג·מ"ל−1 קריאטין קינאז ו-5 מ"מ קריאטין פוספט), 200 מיקרומטר EGTA (כלטים Ca2+ יונים), תמיסה נגד הלבנה (0.1 מ"ג·מ"ל−1 גלוקוז אוקסידאז, 0.018 מ"ג·מ"ל−1 קטלאז, ו-5 מ"ג·מ"ל−1 גלוקוז), 5 מיקרומטר G-אקטין , 280 ננומטר GST-fascin ו-1.67 ננומטר מיוזין II. אחוז G-actin המסומן הוא 5% (אחוז מולרי).
      הערה: השתמש באחוז נמוך של G-actin המסומן כדי למנוע את הרוויה של האות הפלואורסצנטי בשלבים מתקדמים של התכווצות הג'ל.
  2. הכנת אגרגטים מוטוריים של מיוזין II
    1. הוסף את מנועי המיוזין לתמיסת החלבון בצורה של אגרגטים. כדי ליצור אגרגטים גדולים של מיוזין (150 דימרים מיוזין / אגרגטים), דלל את תמיסת מלאי המיוזין עם 10 mM Tris pH 7.4 כדי להגיע לריכוז סופי של 25 mM KCl.
    2. שמור את תמיסת המיוזין המדוללת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן העבר אותה לקרח עד לשימוש. המנועים פעילים באופן מלא עד שעתיים.
  3. מדידת זרימת הממס
    1. כדי לעקוב אחר זרימת הממס על פני נקבוביות הג'ל, הוסף את החרוזים הפלואורסצנטיים לתמיסת האקטומיוזין. להפחית את האינטראקציה בין החרוזים לבין רשת actomyosin על ידי פסיבציה של החרוזים. מעשית, לדגור 1 μL של חרוזים (טבלה של חומרים) עם 5 מיקרומטר G-actin במשך 20 דקות ב RT, ולאחר מכן להסיר עודף G-actin על ידי צנטריפוגה (טבלה של חומרים) (תנאים: 6,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C).
    2. חזור על שלב זה עם 10 מ"ג·מ"ל−1 אלבומין בסרום בקר (BSA) (רשימת חומרים) כדי לחסום (אולי) את המשטח הלא מצופה שנותר. השתמש בחרוזים בדילול סופי של 1:10,000 vol/vol בניסויים.
      הערה: חשוב להתאים את קוטר החרוזים לגודל נקבוביות הג'ל כך שיחס גודל החרוז/נקבוביות יהיה <1 בכל השלבים.
  4. השפעת צמיגות הפתרון
    1. שלוט בצמיגות התמיסה על ידי הוספת גליצרול (רשימת חומרים) לתמיסת האקטומיוזין. הוספת גליצרול באחוז משקל הנע בין 0% ל -34% גורמת לעלייה מקבילה בצמיגות התמיסה מ η ω ל 2.76 η ω, כאשר η ω הוא צמיגות המים ב 20 ° C28.
      הערה: חיוני להשתמש פיפטה ייעודית לטיפול בנוזל צמיג בעת עבודה עם גליצרול (טבלה של חומרים).

4. הפעלת ניסוי

  1. טיפול במחזיק מדגם תוצרת בית
    1. קחו את אחד הכיסויים הפסיביים של PEG, הניחו עליו ספייסר פרפילם משומן והניחו אותו במחזיק הדגימה.
      הערה: ניתן להחליף את הספייסר הפרפילם בכל ספייסר.
  2. הכנת פתרון actomyosin
    1. הכן את תמיסת האקטומיוזין על קרח בצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי שילוב המרכיבים המיקרוסקופיים השונים, הוספת אגרגטים מוטוריים של מיוזין II והוספת EGTA אחרון. מערבבים היטב את התמיסה . התוספת של EGTA יוזמת פילמור רשת אקטומיוזין, אשר קובע את זמן תחילת הניסוי.
  3. שים 1.1 μL של תמיסה זו על הכיסוי המותקן על המחזיק, והנח את הכיסוי השני על גבי. הברג את המחזיק כדי לאטום את הדגימה. תהליך זה לוחץ מעט את הטיפה, המאמצת צורה דמוית דיסק. קוטר הנפילה נע בין 2,800-3,000 מיקרומטר.
  4. הניחו את מחזיק הדגימה על המיקרוסקופ, והתחילו את הרכישה. הכינו את המיקרוסקופ מראש כדי לקצר את זמן הרכישה הראשוני. זה בדרך כלל לוקח 1-2 דקות לאחר ערבוב כדי להתחיל את הדמיה דגימה.

5. טכניקות מיקרוסקופיה

  1. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (Table of Materials) הנשלט על ידי תוכנה ייעודית (Table of Materials).
    1. השתמש בהגדלות נמוכות של 2.5x/0.075 מטרת Plan-NEOFLUAR (טבלה של חומרים) כדי להמחיש את כל אזור הג'ל ולעקוב אחר ההתכווצות המקרוסקופית שלו עם הזמן.
    2. השתמש במטרה 10x/0.3 Ph1 UPlanFL (טבלה של חומרים) כדי לאפיין את נקבוביות הרשת ומבנהה, ולעקוב אחר הארגון העצמי של הרשת והתכווצות עם הזמן.
      הערה: מטרה זו שימושית גם למיקום אגרגטים של מנוע מיוזין II בתוך הרשת ומעקב אחר תנועת חרוזים פלואורסצנטיים על פני נקבוביות הג'ל. ניתן להשתמש בהגדלות גבוהות יותר על חשבון שדה ראייה מופחת, שהוא משמעותי עוד יותר במצב הדמיה של צבע כפול (רשימת חומרים).
  2. להלהיב את הדגימות ב 488 ננומטר (חרוזי אקטין / פלואורסצנטי) ו 561 ננומטר (אגרגטים מוטוריים מיוזין / חרוזים פלואורסצנטיים). קבל את התמונות במהירות של 100 אלפיות השנייה לפריים באמצעות תוכנה ייעודית (Table of Materials) במצב הזרמה באמצעות מצלמת EMCCD (ראשי תיבות של Electron Multipifying charge-coupled device) (Table of Materials).
    הערה: עוצמת המנורה הפלואורסצנטית (טבלת חומרים) צריכה להישמר בערך הנמוך ביותר האפשרי כדי למנוע רוויית אות במהלך התכווצות הרשת.
  3. הדמיה סימולטנית של שני צבעים
    1. השתמש במצב זה לשתי מטרות: (i) זיהוי לוקליזציה של אגרגטים מוטוריים מיוזין בתוך רשת האקטין ו-(i) אפיון זרימת הממס החוצה פנימה והחוצה במהלך התכווצות הרשת.
    2. הרגש את מנועי האקטין והמיוזין II ב- 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, בהתאמה, והקלט את התמונות בו זמנית במצלמת EMCCD (רשימת חומרים) באמצעות מנגנון פליטה כפולה (רשימת חומרים). השתמש באותה מערכת הדמיה כדי לצלם בו-זמנית את ג'ל האקטין (488 ננומטר) ואת החרוזים הפלואורסצנטיים (561 ננומטר).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בכל ניסוי נעשה שימוש בשני כיסויי זכוכית. כיסויי הזכוכית מנוקים ועוברים פסיבציה עם פולימרי PEG. פסיבציה חיונית למניעת היצמדות החלבונים המסיסים למשטחי הזכוכית בשלבי הניסוי המוקדמים ולמזעור האינטראקציה של הרשת המתכווצת עם דפנות הזכוכית. כישלון להשיג פסיבציה טובה יכול להוביל להתכווצות לא יעילה, ובמקרים קיצוניים, יכול אפילו לעכב היווצרות רשת אקטין .

איור 1 מתאר את שלושת השלבים העיקריים של הליך הטיפול במשטח. שלבים אלה כוללים את הפעולות הבאות: (i) ניקוי משטחים והידרופילי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, גישה במבחנה משמשת כדי לאפיין את המכניקה של ג'ל אקטומיוזין פורואלסטי כמערכת מודל של שלד התא, ובאופן כללי יותר, של הציטופלסמה של התא, אשר הוכח להתנהג כחומר פורואלסטי 3,5. הריאולוגיה של שלד התא (ציטופלסמה) מאופיינת בקבוע דיפוזיה פורואלסטי, המכתיב כמה זמן לוקח לנוזל הציטוסולי התוך-תאי להתחלק מחדש בתוך התא בעקבות לחץ מכני מופעל. תאים הוצעו להשתמש במנגנון זה כדי לווסת את צורתם5.

בעקבות ממצאים אלה, פיתחנו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לדינה ארנוביץ על טיהור ותיוג החלבון. ג.ל. מודה למשרד המדע, הטכנולוגיה והחלל על מלגת ז'בוטינסקי לדוקטורט. א.ב.ג. מודה לקרן הלאומית למדע (מענק 2101/20) ולמשרד המדע והטכנולוגיה - מדינת ישראל (מענק 3-17491) על התמיכה הכספית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilaneSigma-Aldrich Company175617מאוחסן באטמוספירת ארגון ב-4 מעלות; C 
חומצה אצטיתביו-לאב בע"מ1070521
Alexa-Fluor 488InvitrogeneA10254מדולל ב-DMSO, מאוחסן באטמוספירת ארגון ב-20 מעלות; C 
Alexa-Fluor 647InvitrogeneA20347מדולל ב-DMSO, מאוחסן באטמוספירת ארגון ב-20 מעלות; C 
BSASigma -Aldrich CompanyA3059מאוחסן ב-4 מעלות; C 
CatalaseSigma -Aldrich CompanyC9322בקבוק המלאי נשמר באטמוספירה יבשה (סיליקה ג'ל) בטמפרטורה של -20 מעלות; C
CoverslipsMezel-glaserCG2222-1.5נשמר ב-milliQ-water לאחר הטיפול בפיראנה ונעשה בו שימוש תוך 3 שבועות
קריאטין קינאזRoche Life Science Products10736988001מוכן טרי במאגר גליצין, קפ על קרח ושימוש תוך 3 ימים.  בקבוק המלאי נשמר באווירה יבשה (סיליקה ג'ל) בטמפרטורה של 4 מעלות; C
קריאטין פוספטRoche Life Science Products10621714001כאשר הוא מומס יש לשמור בטמפרטורה של -20 מעלות; C ולשימוש תוך 3 חודשים. בקבוק המלאי נשמר באווירת ארגון ומאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
DTTRoche Life Science Products10708984001כאשר הוא מומס יש לשמור בטמפרטורה של -20 מעלות; C ושימוש תוך 3 חודשים
מערכת הדמיה סימולטנית כפולה פוטומטריהDV2-CUBE
EGTAMP ביו-רפואי195174
EM-CCD מצלמהאנדור טכנולוגיה בע"מDV 887
EM-CCD מצלמהפוטומטריהEvolve Delta
EthanolBio-Lab ltd525050300
מנורת פלורסנציהRapp אופטואלקטרוניקה
פלואורסברייט YG MicrospheresPolysciences17151-10קוטר 200 ננומטר
גלוקוזICN Biomedicals Inc194024כאשר הוא מומס יש לשמור על -20 מעלות; C ולשימוש תוך 3 חודשים.
גלוקוז אוקסידאזחברת סיגמא-אולדריץ'G7141נשמר ב-20 מעלות; C ולשימוש תוך 3 חודשים. אבקת הציר נשמרת באטמוספירה של ארגון ונשמרת בטמפרטורה של -20 מעלות; C
גליצרולICN Biomedicals Inc800687
GlycineMP Biomedicals808822
מי חמצןSigma-Aldrich Company216763מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C 
KClEMD Millipore Corp.
מתנולביו-לאב בע"מ1368052100
MgCl2EMD Millipore Corp.
442615 מיקרוסקופLeica MicrosystemsDMI3000
mPEG-malNanocsPG1-ML-5k Mw = 5000 Da. מחולק לקבוצות קטנות לפי משקל. מאוחסן באטמוספירת ארגון בטמפרטורה של -20 מעלות;
C מיקרוספירות אדומות נילוסSpherotechFP-2056-2 קוטר 2300 ננומטר
מטרה (10x)Leica גרמניהHC PL AP0UPlanFL צמצם מספרי = 0.3
מטרה (2.5x)Leica גרמניה506304  צמצם מספרי Plan-NEOFLUAR = 0.075
תנורקלסר
WTC ParafilmAmcorPM-996
PBS BufferSigma-Aldrich CompanyP4417
נהג תריסVincet AssociatesVMM D1
סיליקה ג'לMerck1.01907.5000
סוניקטורElmaElmasonic P
חומצה גופרתיתריאגנטים קרלו ארבה410301
DV2 מערכת הדמיה סימולטנית דו-ערוציתפוטומטריה
TRISMP Biomedicals819620
ספקטרופוטומטר UV-VISPharmaciaUltraspec 2100 pro
MICROMAN EGilsonFD100011– 10 uL
MATLAB R2017bMathWorksכימות נתונים 
מטמורף מולקולרייםתוכנת בקרה של מערכת ההדמיה האופטית; כימות נתונים (ניתוח מעקב אחר חלקיקים, גודל רשת רשת)
529552התקנים

מקורות

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413(2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264(2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ג'לים פורו-אלסטייםהתכווצות מיוזיןזרימת ממסמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתנקבוביות הרשתהרפיית מאמץשחזור חוץ-גופי (In Vitro)מודול אלסטיות
המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.