מאמר שיטה

מדידת התכווצות הלב בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מבודדים

5.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64394

⸱

9 באוגוסט 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AnaBios Corporation

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד התכווצות בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מלבבות תורמים באמצעות מערכת MyoBLAZER, פלטפורמה אמינה להערכת שינויים בהתכווצות הנגרמת על ידי תרופות במהלך הפיתוח הפרה-קליני.

תקציר

הערכת השינויים בהתכווצות הלב חיונית במהלך הפיתוח הפרה-קליני עבור תרכובות חדשות ממוקדות לב ולא לב. מאמר זה מתאר פרוטוקול להערכת שינויים בהתכווצות בקרדיומיוציטים חדריים ראשוניים אנושיים בוגרים באמצעות MyoBLAZER, שיטה אופטית לא פולשנית המשמרת את הפיזיולוגיה והפרמקולוגיה הרגילות של התאים. שיטת הקלטה אופטית זו מודדת ברציפות מעברי התכווצות מתאים מרובים במקביל, ומספקת הן תפוקה בינונית והן מידע בעל ערך עבור כל תא בודד בשדה הראייה, ומאפשרת מעקב בזמן אמת אחר השפעות התרופה. התכווצויות הקרדיומיוציטים מושרות על ידי גירוי שדה חשמלי קצוב, ותמונות השדה הבהיר הנרכשות מוזנות לתוכנת עיבוד תמונה המודדת את התקצרות הסרקומר על פני קרדיומיוציטים מרובים. שיטה זו מייצרת במהירות נקודות קצה שונות הקשורות לקינטיקה של שלבי ההתכווצות וההרפיה, ולאחר מכן ניתן לפרש את הנתונים המתקבלים ביחס לריכוזים שונים של מאמר בדיקה. שיטה זו משמשת גם בשלבים מאוחרים של פיתוח פרה-קליני לביצוע מחקרי המשך מכניסטיים לתמיכה במחקרים קליניים מתמשכים. לפיכך, למודל האנושי הראשוני המבוסס על קרדיומיוציטים בוגרים בשילוב עם המערכת האופטית לניטור התכווצות רציפה יש פוטנציאל לתרום לעידן חדש של תרגום נתונים לבביים במבחנה בפיתוח טיפול רפואי פרה-קליני.

מבוא

התכווצות שריר הלב (אינוטרופיה), המייצגת את היכולת הטבעית של שריר הלב להתכווץ, היא תכונה מרכזית של תפקוד הלב ותלויה בדינמיקה של הצימוד האלקטרו-מכני. שינויים הנגרמים על ידי תרופות בהתכווצות שריר הלב רצויים לטיפול במחלות לב (למשל, אי ספיקת לב) ואינם רצויים בהקשר של רעילות לב (למשל, הפחתה במקטע פליטת החדר השמאלי). לכן, מודלים של כיווץ פרה-קליני חייבים להיות קשורים לחיזוי מדויק כדי לוודא שתרופות חדשות יכולות להצליח במהלך הפיתוח הקליני. עם זאת, אסטרטגיות פרה-קליניות עכשוויות, המסתמכות על מודלים תאיים מלאכותיים רדוקציוניסטיים (למשל, קווי תאים אימורטליים מהונדסים גנטית המבטאים יתר על המידה מטרות לבביות ספציפיות המעניינות) ומודלים של בעלי חיים שאינם אנושיים, הראו מגבלות משמעותיות ונמצאו קשורות לשיעורי שחיקה גבוהים של תרופות (כלומר, שיעור גבוה של אותות שווא)1,2,3,4 . לפיכך, הכרחי להקים מודלים חדשים ואמינים להתכווצות הלב התאית האנושית הקשורים בעוצמה גבוהה (כלומר, שיעור גבוה של אותות אמיתיים) כדי לחזות תוצאות תרופות בבני אדם, ומכאן, לעזור להאיץ את ההשקה של טיפולים חדשים5.

השיטות פורצות הדרך שנקבעו לאחרונה לשיקום לבבות תורמים אנושיים למחקר 6,7,8,9,10 ובטכניקות בידוד קרדיומיוציטים 11,12,13,14,15 סיפקו הזדמנות ייחודית לביצוע מחקרים מבוססי אדם במהלך הפיתוח הפרה-קליני. למטרה זו, קרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים כבר הראו תועלת בהערכת שינויים הנגרמים על ידי תרופות בהתכווצות הלב האנושי11,12,13,14. המאמר הנוכחי מפרט את הפרוטוקול לחקר השפעות ההתכווצות של תרכובות חדשות בקרדיומיוציטים אנושיים בוגרים.

פרוטוקול

כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל הלבבות האנושיים ששימשו למחקרים לא היו ניתנים להשתלה והושגו באופן אתי על ידי הסכמה משפטית מדעת (גוף ראשון או קרוב משפחה) מתורמי איברים גופיים בארצות הברית (ארה"ב). פרוטוקולי ההחלמה והניסויים במבחנה אושרו מראש על ידי ועדות סקירה מוסדיות (IRBs) במרכזי השתלות בתוך רשת השתלות רכישת האיברים של ארה"ב (OPTN). יתר על כן, כל העברות הלבבות התורמים ניתנות למעקב מלא ונבדקות מעת לעת על ידי הרשויות הפדרליות בארה"ב.

הערה: החל את כל נהלי הבטיחות הדרושים במהלך ביצוע פרוטוקול זה, כולל לבישת ציוד מגן אישי מתאים (לדוגמה, מעילי מעבדה, משקפי בטיחות, כפפות).

1. בידוד קרדיומיוציטים (יום אחד לפני מדידת התכווצות)

  1. לנקב מחדש את לבבות התורם מיד עם הגעתם למעבדה עם תמיסה קניינית קניינית קרה כקרח6 ולבודד מיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים אנזימטיים מחדרי 11,12,13,14,15.
  2. לאחר מכן, לשמור על cardiomyocytes בהשעיה ולאחסן אותם עם 10 מ"ל של פתרון A (110 mM סוכרוז, 0.005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM חומצה לקטוביונית, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM טאורין, 20 mM L-היסטידין, 20 mM HEPES, 2 mM L-חומצה גלוטמית, 2 mM L-(-)-חומצה מאלית, pH 7.4 עם KOH) בבקבוקוני Wheaton 20 מ"ל (טבלת חומרים) בטמפרטורת קירור עד לחקירתם הניסיונית.
    הערה: אחסן 200,000 תאים לכל בקבוקון.

2. הכנת ציפוי למינין (יום לפני מדידת התכווצות)

  1. הניחו מכסה זכוכית בודד (25 מ"מ x 25 מ"מ מרובע, טבלת חומרים) בכל באר של צלחת תרבית בת שמונה בארות (טבלה של חומרים).
  2. לאחר מכן, צפו את הכיסויים בלמינין בריכוז של 5 מיקרוגרם/מ"ל. לשם כך, הוסף 800 μL של מלאי למינין 521 רקומביננטי אנושי (טבלה של חומרים, מאוחסן ב -20 ° C) ל -7.2 מ"ל של תמיסה B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM גלוקוז, ו 10 mM HEPES, pH 7.4 עם NaOH) וערבב היטב.
  3. זרוק 200 μL של תמיסת הלמינין המדוללת למרכז כל כיסוי. לאחר מכן, מכסים את הצלחת ועורמים אותה במקרר בטמפרטורה של 18 מעלות.
    הערה: הכינו מספר צלחות תרבית בנות שמונה בארות כדי להבטיח שיש מספיק כיסויים מצופים למינין.

3. הכנת קרדיומיוציטים סובלניים Ca2+ (ביום מדידת התכווצות)

  1. מוציאים בקבוקון תאים מהמקרר, שואפים תמיסה A מהבקבוקון ומוסיפים 10 מ"ל קירור של תמיסה B.
    הערה: יש לוודא שהתאים אינם נשאבים ולפזר תמיסה B לתוך הבקבוקון על ידי הנחת פיפטה בחלק הפנימי של החלק הפנימי של דופן הבקבוקון.
  2. מכסים את בקבוקון התאים ולאחר מכן מערבלים בעדינות כדי להבטיח שהתאים מפוזרים לאורך תמיסה B. לבסוף, אפשרו לתאים להסתפק במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT).

4. הכנת מערכת ההקלטה (ביום מדידת התכווצות)

הערה: מערכת ההקלטה כוללת קופסת בקרת טמפרטורה, ממריץ, זילוח מונחה לחץ הנשלט על ידי מחשב, בקבוקי זילוח מונעי לחץ, תוכנת רכישה פנימית המאפשרת בחירת אזורי עניין (ROIs) ותצוגה של מעברי כיווץ, מיקרוסקופ הפוך, תא תא ומצלמה (איור 1).

  1. הפעל את מערכת ואקום היניקה. לאחר מכן, הסירו את מכסה המיקרוסקופ, הפעילו אותו, חברו את המצלמה (טבלת חומרים, איור 1), ולבסוף, ודאו שהמאוורר מופעל כדי להבטיח שהמצלמה לא תתחמם יתר על המידה.
  2. לאחר מכן, הפעילו את פלטת החימום במיקרוסקופ (Table of Materials) ואת קופסת בקרת הטמפרטורה (Table of Materials, איור 1), וכוונו אותן לטמפרטורת ההפעלה הנכונה. לאחר מכן, הפעילו את מגרה השדה (טבלה של חומרים, איור 1) ואת מערכת הלחץ. לבסוף, חברו את צינורות התמיסה (Table of Materials) לתא ההקלטה (Table of Materials, איור 1).

5. הכנת תרכובות בדיקה (ביום מדידת ההתכווצות)

  1. דילול דימתיל סולפוקסיד (DMSO; טבלת חומרים) פי 1,000 בתמיסה C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM גלוקוז ו-10 mM HEPES, pH 7.4 עם NaOH) ליצירת פתרון רכב DMSO של 0.1%.
  2. כדי לבדוק תרכובת בפי 1, פי 10, פי 100 ופי 1000 מהחשיפה הטיפולית שלה של 0.001 מיקרומטר, יש להמיס את תרכובת הבדיקה ב-DMSO בריכוז של 1 מילימול.
  3. דלל פתרון זה באופן סדרתי עם DMSO כדי לייצר שלושה מלאי DMSO נוספים (לדוגמה, 0.001 mM, 0.01 mM ו- 0.1 mM). לבסוף, דללו כל תרכובת בדיקה פי 1,000 ב-100 מ"ל של תמיסה C כדי לקבל ריכוזי בדיקה סופיים (0.001 מיקרומטר, 0.01 מיקרומטר, 0.1 מיקרומטר ו-1 מיקרומטר).
  4. הוסיפו את תמיסת הרכב והתמיסות של ריכוזי המיקרומולר הסופיים של התרכובת לבקבוקי זכוכית של 100 מ"ל (Table of Materials, איור 1) ולאחר מכן חברו את הבקבוקים למערכת הזילוח מונעת הלחץ (Table of Materials, איור 1).
  5. לאחר מכן, הפעל את מערכת הזילוח באמצעות תוכנית מונחית מחשב (Table of Materials) תוך שימוש בלחץ של 200-300 mbar כדי לספק זרימת זילוח קבועה בקצב של 1.8 מ"ל/דקה.
    הערה: אין לבצע את הניסוי אם נמצא כי תרכובת הבדיקה קשורה לבעיית מסיסות. כמו כן, נסחו את פתרונות הבדיקה המורכבים מתמיסות מלאי תוך 30 דקות לפני היישום הניסיוני על התאים.

6. ציפוי קרדיומיוציטים (ביום מדידת התכווצות)

  1. הוציאו צלחת בת שמונה בארות המכילה כיסויים מצופים למינין מהמקרר בטמפרטורה של 4°C והניחו בזהירות מכסה אחד בתא הקלטה נקי היטב (איור 1). לאחר מכן, מחזירים את צלחת שמונה הבארות למקרר 4 מעלות צלזיוס עד לציפוי הבא.
    הערה: השתמש במגבון ללא סיבים (רשימת חומרים) כדי לנגב את הכיסוי המצופה תוך שמירה על ציפוי הכיסוי בשכבה דקה של למינין. כמו כן, הקפידו להשליך כיסויים משומשים במיכל חד.
  2. לאחר מכן, קח בקבוקון של תאים (שלב 3.2) ושאפו תמיסה B מהבקבוקון כדי להגיע לנפח קטן ככל האפשר מבלי לאבד תאים (~ 200 μL). לאחר מכן, שחררו את 200 μL התאים לתוך תא מיקרוסקופ הקלטה רכוב על הבמה של מיקרוסקופ הפוך (טבלה של חומרים).
  3. תן לתאים להתיישב על הכיסוי במשך 5 דקות. בזמן ההמתנה להתיישבות המלאה של התאים, פתחו את שדה הראייה במיקרוסקופ וקבעו אם צפיפות התאים מספקת (~70%) לתחילת ריצת הניסוי.
    הערה: ודא שהיניקה אינה שואפת את כל התאים החוצה אם מחלקים יותר מ -200 μL.

7. הקלטה של התכווצות cardiomyocyte

  1. לאחר השלמת הציפוי, אזנו את התאים למשך 5 דקות על ידי ערבוב רציף שלהם עם תמיסה C באמצעות מערכת זילוח מונעת לחץ (טבלה של חומרים). התאם את היניקה כראוי, הפעל הן את תיבת בקרת הטמפרטורה והן את צלחת החימום, והגדר אותם לספק ~ 35 ° C.
  2. לאחר מכן, לעורר את התאים עם מתח סף supra-threshold בתדר קצב 1 הרץ (דופק דו קוטבי של 3 ms משך) על מגרה שדה עם זוג חוטי פלטינה ממוקם משני הצדדים של התא מחובר מגרה השדה.
  3. הגדר את המשרעת של הדופק המגרה ב 1 V, ולאחר מכן להגדיל אותו עד cardiomyocytes להתחיל לייצר מחזורי התכווצות-הרפיה. השתמש בערך סף של 1.5x לאורך כל הניסוי.
    הערה: בחר תאים בריאים עם מורפולוגיה בצורת מוט ופסיעות ברורות. לאחר מכן, התאימו את שדה הראייה והתמקדו בהבאת תאים מתכווצים רבים ככל האפשר לתצוגה (איור 2A).
  4. לאחר מכן, להציג את התמונות הדיגיטליות של התאים בתוך תוכנת הרכישה של מערכת רישום התכווצות אופטית. תוכנה זו משתמשת במצלמה ברזולוציה גבוהה ובקצב פריימים גבוה עם קצב של 150 FPS (טבלה של חומרים, איור 1) כדי להקליט זרם וידאו המכיל מיוציטים מרובים באותו פריים.
    הערה: זה מספק רזולוציה זמנית ומרחבית מספקת כדי ללכוד ולמדוד את הדינמיקה של סרקומר של מספר מיוציטים בריאים בו זמנית. מעבדים מודרניים בעלי ספירת ליבות גבוהה ממונפים כדי לאפשר חישוב מקביל של שינויים באורך הסרקומר מזרם הווידאו בזמן אמת (נתוני צפיפות אופטית נאספים מאזורי עניין המוגדרים על-ידי המשתמש [ROI] הממוקמים מעל תמונות של קרדיומיוציטים בריאים ובמקביל לציר ההתכווצות, איור 2B). נתוני העוצמה האופטית מראים פסים בהירים וכהים המתאימים לקווי Z של הקרדיומיוציטים (איור 1, איור 2C). לבסוף, הנתונים האלה מוצגים למשתמש למטרות ניטור ונשמרים בדיסק לצורך ניתוח מאוחר יותר (איור 2C).
    1. הימנע מאזורים בתאים שאינם ממוקדים. כמו כן, אל תמקמו את ה-ROI קרוב לקצה התאים, מכיוון שהשינויים בהתכווצות התאים במהלך יישום התרופות עלולים לגרום לכך שה-ROI לא יוכל לקרוא את התכווצות התאים.
  5. כאשר בחירת החזר ההשקעה הושלמה והצירים עומדים בסטנדרטים הדרושים לשימוש (למשל, קיצור סרקומר >1%; התכווצות קצבית עם יישום תדר קצב של 1 הרץ, היעדר אירועים אריתמיים), התחל את הניסוי כדי להעריך את ההשפעות של תרכובת. פרוטוקול הגירוי ורצף היישום של ריכוזי הבדיקה בתרכובת מוצגים בטבלה 1. תוכנת הרכישה תנהל, באופן אוטומטי, רכישה והצגה של נתונים ותיוג ריכוזי הבדיקה וזמן הטיפול.
    הערה: החל ריכוזי בדיקה אם ההתכווצות נשארת באמפליטודה יציבה לאורך כל תקופת הרכב הבסיסית. פסילת תאים המציגים הפעלה או ריצה.
    6. כמו כן, יש לוודא שהזילוח עובר לריכוזי הבדיקה השונים במהלך הניסוי.
  6. עם סיום הניסוי ואחסון הנתונים בשרת, כבו את הזילוח והתנור, עצרו את הגירוי, נקו את תא המיקרוסקופ במים מזוקקים, הסירו את מכסה הזכוכית וייבשו היטב את התא.
    הערה: נקה את החדר ביסודיות מכיוון שזה קריטי כדי למנוע חשיפת קבוצת התאים הבאה לתרכובת כלשהי בטרם עת, ובכך לפסול את כל הנתונים שנאספו.
  7. לאחר מכן, לבצע ציפוי חדש של cardiomyocytes ולבצע ניסוי נוסף כדי לקבל מספיק נתונים להשלמת הבדיקה של התרכובת או בדיקת תרכובת חדשה.

8. כיבוי מערכת הקלטת הכיווץ האופטי

  1. לאחר השלמת הבדיקה היומית של התרכובות, תחילה כבה את כל הציוד שאינו נחוץ לניקוי המערכת והעתק את הנתונים לניתוח לא מקוון.
  2. לאחר מכן, הסר את בקבוקי הזכוכית של 100 מ"ל (טבלה של חומרים) המכילים תמיסות של ריכוזי בדיקה סופיים והחלף אותם בבקבוקי זכוכית מלאים באמצע הדרך בתמיסת RBS 25 Concentrate (טבלה של חומרים). יש לנקב את תמיסת RBS דרך תא המיקרוסקופ למשך 5 דקות, ואז לנתק את צינור הזילוח מהחדר, לנקות אותו במים מזוקקים, ולבסוף לייבש אותו היטב.
    הערה: ודא ששואב האבק פועל היטב כדי למנוע הצפות אפשריות.
  3. לאחר מכן, חבר את צינורות הזילוח לצינורות הניקוז. באמצעות התוכנה של מערכת הזילוח מונעת הלחץ (טבלה של חומרים), הפעל את פתרון RBS במשך 10 דקות תוך הבטחת הלחץ וקצב הזרימה מוגדרים כראוי. לאחר מכן, יש לנקב 1% DMSO למשך 5 דקות ולאחר מכן מים מזוקקים למשך 15-20 דקות כדי להשלים את ניקוי מערכת הזילוח.
  4. כבו את אור המיקרוסקופ והניחו את הכיסוי שלו. לאחר מכן, נתק את חוטי המצלמה מהקופסה בצד המיקרוסקופ וכבה את המאוורר. ודא כי כל הבקבוקים המשומשים נשלחים לניקוי autoclave. לבסוף, ודא שכל דליי הניקוז מלאים או פחות.
    הערה: ודא שיש מספיק כיסויים מצופים למינין לשימוש למחרת.
  5. לבסוף, העתק את הקבצים בתיקיית הרכישה של כל הניסויים שנעשו בכל מערכת הקלטה והדבק אותם בשרת גיבוי מאובטח לניתוח לא מקוון נוסף. לאחר מכן, מחק את כל קבצי הנתונים מתיקיית הרכישה.

9. ניתוח נתוני התכווצות

  1. בצע ניתוח לא מקוון באמצעות תוכנת הניתוח ומאקרו מותאם אישית כדי לחשב ממוצע של הנתונים. תוכנת הניתוח מחשבת ומדווחת על מדדים שונים מנתוני הדינמיקה של סרקומר המיוצרים על ידי תוכנת הרכישה. רשימה מפורטת של פרמטרים אלה מופיעה באיור 2D.
    הערה: היישום של טכניקות תוכנה ברמה נמוכה מאפשר לנתח ריצות רבות של הקלטות ב -5 שניות. הפרמטר העיקרי להערכת שינויים בהתכווצות הנגרמים על ידי תרופות הוא משרעת ההתכווצות (קיצור סרקומר % = שינוי באורך הסרקומר). הוא מחושב כאורך הסרקומר בשיא התכווצות / אורך סרקומר מנוחה וממוצע על פני 20 ארעי ההתכווצות האחרונים עבור כל ריכוז בדיקה.
  2. כמת את ההשפעות המורכבות של הבדיקה על משרעת ההתכווצות הממוצעת ביחס למצב בקרת הרכב הבסיסי הספציפי של כל קרדיומיוציטים.
  3. בטא את התוצאות הממוצעות כממוצע ± SEM והפק גרף המתווה את השפעת הריכוז של תרכובת הבדיקה על משרעת ההתכווצות. לאחר מכן, התאימו את עקומת הריכוז-תגובה למשוואת היל באמצעות תוכנת ניתוח (טבלה של חומרים) כדי לגזור ערכי IC50 (ריכוז המייצר עיכוב של 50% של משרעת התכווצות) ו-EC50 (ריכוז המייצר עלייה של 50% באמפליטודת ההתכווצות).
  4. בנוסף למשרעת ההתכווצות, ניתן גם לחשב פרמטרים אחרים:
    1. לאחר התכווצות: זהה לאחר התכווצות ככיווץ משני ספונטני חולף של הקרדיומיוציטים המתרחש לפני ההתכווצות הסדירה הבאה ומייצר התכווצות לא תקינה ולא מסונכרנת.
    2. כשל התכווצות: זהה כשל התכווצות כחוסר היכולת של הגירוי החשמלי לגרום להתכווצות.
    3. השתנות לטווח קצר (STV) ואלטרננים: דמיינו את שני הפרמטרים הללו בחלקות פואנקרה של השתנות משרעת התכווצות.
      1. חישוב STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) עם 20 הארעיות האחרונות של כל תקופת ריכוז של מאמר בקרה ובדיקה. זהה אלטרנים כמעברי משרעת התכווצות קצרים וארוכים לסירוגין.
      2. כדי לחשב את ההיארעות של פרו-הפרעות קצב, נרמלו את ערכי ה-STV לערך בקרת הרכב של כל תא, התוויית לאחר התכווצות, כשל התכווצות, STV ואלטרננים, ובטאו אותם כאחוזים משכיחות התאים המציגים כל אחד מהאותות.
    4. השלם את הפרופיל המכניסטי הרב-פרמטרי עם חישוב הזמן שיא אטו, דעיכה ל-30% הרפיה (דעיכה 30), דעיכה ל-90% הרפיה (דעיכה 90), זמן ל-90% הרפיה (TR90) (איור 2D), אורך סרקומר בסיסי, זמן ל-50% שיא, גובה שיא, אורך סרקומר בשיא ההתכווצות, מהירות התכווצות מקסימלית ומהירות הרפיה מרבית12. בדומה למשרעת ההתכווצות, בטאו פרמטרים אלה ביחס למצב הבקרה הבסיסי הספציפי של כל קרדיומיוציטים והציגו אותם בגרף בתרשימי ריכוז-תגובה.

תוצאות

מתואר בפרוטוקול זה הליך למדידת התכווצות בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מבודדים מתורמי איברים והערכת שינויים חריפים בפרמטרים של התכווצות הנגרמים על ידי תרכובת בדיקה. מדידת התכווצות חולפת מתבצעת באמצעות מערכת גיאומטריה תאית מבוססת וידאו, MyoBLAZER, המודדת דינמיקה של סרקומר, ומצב הלב הבוגר מחוקה על ידי גרימת התכווצות עם גירוי חשמלי בתדר הקצב הפיזיולוגי (1 הרץ). הכדאיות התפקודית של הקרדיומיוציטים מאושרת על ידי הערכת צימוד העירור-התכווצות שלהם (כלומר, עיבוד תאי המקשר עירור חשמלי [פוטנציאל הפעולה הסרקולמלי] עם התכווצות). אין מעברי התכווצות ספונטניים בקרדיומיוציטים אנושיים, והקרדיומיוציטים מגיבים לגירוי חשמלי חיצוני באמצעות מחזורי התכווצות/הרפיה (איור 2C, E), כמו גם לאיזופרוטרנול, אגוניסט β-אדרנרגי (איור 2F,G). איזופרוטרנול גורם לעלייה תלוית ריכוז בהתכווצות (איור 2G), וניתן לאפיין גם את השפעתו על הקינטיקה של התכווצות חולפת (איור 2D)12.

figure-results-1
איור 1: התקנה ניסיונית של מערכת רישום התכווצות אופטית. רישומי התכווצות שדה בהיר מבוצעים מקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים כפי שתואר קודם לכן11,12,13,14. ההתקנה כוללת (A) תיבת בקרת טמפרטורה, (B) מגרה שדה, (C,D) מערכת זילוח מונעת לחץ, (E) תוכנית מחשב מונעת לחץ, (F) לחץ בתוספת בקבוקים, (G) תוכנת רכישה, (H) בחירת ROI עם תוכנת רכישה, (I) תצוגה של מעברי כיווץ עם תוכנת רכישה, (J) מיקרוסקופ הפוך, (K) תא מיקרוסקופ, ו ( L) מצלמה. כל התכונות של הציוד ניתנות בטבלת החומרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אימות של מדידת התכווצות קרדיומיוציטים אנושיים וההשפעה של גירוי β-אדרנרגי. (A) תמונת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה של קרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מייצגים, (B) אזורי עניין מוגדרים על-ידי המשתמש (ROI) הממוקמים מעל תמונות של קרדיומיוציטים בריאים ומקבילים לציר ההתכווצות, (C) תצוגה של מעברי התכווצות המתקבלים מאותם ROI ב-(B) עם תוכנת הרכישה, (D) פרמטרים הקשורים לארעי ההתכווצות שנמדדו עם תוכנת הרכישה: משרעת התכווצות, זמן לשיא, דעיכה 30, דעיכה 90, TR90. ניתן למדוד גם פרמטרים נוספים: אורך סרקומר בסיסי, זמן לשיא של 50%, גובה שיא, אורך סרקומר בשיא התכווצות, מהירות התכווצות מקסימלית ומהירות הרפיה מרבית. (E) מעברי התכווצות אופייניים שנרשמו ממיוציטים חדריים ראשוניים אנושיים בוגרים בתדירות קצב של 1 הרץ בנוכחות בקרת רכב (F) ולאחר חשיפה לאיזופרוטרנול 30 ננומטר, אגוניסט β-אדרנרגי לא סלקטיבי. מעברי ההתכווצות שהודגמו בלוחות E ו- F נאספו מאותו קרדיומיוציטים. Isoproterenol מ cardiomyocytes אנושיים בקצב של 1 הרץ בתדירות קצב שימש כדי ליצור את מידע העוצמה. (G) עקומת ריכוז-תגובה מצטברת אופיינית הנוצרת על ידי מדידת התכווצות קרדיומיוציטים אנושיים עם איזופרוטרנול (n = 8 תאים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

רצף זילוחפתרון לרכבריכוז 1 (מיקרומטר)ריכוז 2 (מיקרומטר)ריכוז: 3 (מיקרומטר)ריכוז: 4 (מיקרומטר)לרחוץ
זמן טיפול120 שניות300 שניות300 שניות300 שניות300 שניות300 שניות
תדירות גירוי1 הרץ1 הרץ1 הרץ1 הרץ1 הרץ1 הרץ

טבלה 1: פרוטוקול גירוי ורצף יישום תרכובת בדיקה. יציבות זמני ההתכווצות מוערכת על ידי רישום רציף במשך 120 שניות בתמיסה C, המבססת את בקרת הרכב (בדרך כלל ב- 0.1% DMSO). לאחר מכן, ריכוז מאמר הבדיקה מוחל על מינימום של 300 שניות או עד להשגת אפקט מצב יציב. נעשה שימוש בארבעה ריכוזי מאמרי בדיקה עולים, המספקים עקומות אפקט ריכוז מצטבר (C-E). בתום התוספות המצטברות של מאמר הבדיקה, ניתן ליישם תקופת שטיפה של 300 שניות.

דיון

כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט עבור המערכת האופטית המבוססת על התכווצות קרדיומיוציטים אנושיים בוגרים עבור שיטה פשוטה בתפוקה בינונית המאפשרת בדיקה של יעילות חריפה ורעילות לב של תרכובות חדשות. מערכת רישום התכווצות אופטית זו קלה לשימוש, מאפשרת הקלטות מתאים מרובים במקביל, מאפשרת הערכה בו זמנית של בריאות התא, פיזיולוגיה ופרמקולוגיה, מגיעה עם ניתוח נתונים אוטומטי ומהיר (ריצה של תאים מרובים מנותחת ב -5 שניות), ומאפשרת איסוף נתונים מהיר (עקומת ריכוז-תגובה כל 30 דקות / תרכובת / מכשיר). בהתחשב בתכונות אלה, מערכת ההקלטה יכולה לשמש לא רק כדי לזהות את ההשפעות של תרופות על התכווצות קרדיומיוציטים, אלא גם כדי לספק נתונים על יחסי מבנה-פעילות לתמיכה במאמצי כימיה רפואית במהלך השלבים המוקדמים של גילוי תרופות16. מכיוון שניתן להשיג עשרות מיליוני תאים מפרוטוקול בידוד קרדיומיוציטים, היישום של פלטפורמת מערכת רישום התכווצות אופטית - קרדיומיוציטים נחקר כעת כדי להשיג יכולת בדיקה מוגברת (עם שימוש בצלחות מבוססות היטב) בעלות מופחתת. יתר על כן, הערכת השפעות התרופה על הפרמטרים הסיסטוליים וההרפיה הנמדדים באמצעות מערכת ההקלטה יכולה לספק פרופיל מכניסטי רב-פרמטרי של תרופות אינוטרופיות12. בנוסף, ניתן להשתמש בנתוני התכווצות קרדיומיוציטים כדי לדרג תרופות חדשות מרוב להכי פחות קרדיוטוקסיות (למשל, שולי בטיחות) ומהכי פחות יעילות (למשל, שולי עוצמה). מחקרי מעקב אחר התכווצות קרדיומיוציטים יכולים להתבצע גם כדי לתמוך בתוכניות פיתוח שנקשרו לירידה קלינית בהתכווצות שריר הלב12.

יתרון משמעותי נוסף של השימוש במערכת ההקלטה האופטית לכיווץ קרדיומיוציטים אנושי הוא התאמתה לתפיסת ה-3Rs (החלפה, הפחתה ועידון)17 שכן ניתן לראות בה שיטה חלופית המונעת או מחליפה את השימוש בבעלי חיים לייצור נתונים בתעשיית התרופות. יתרון 3Rs זה יכול להיות מורחב גם למחקר לב אקדמי. כל הידע הנוכחי על פיזיולוגיה ופרמקולוגיה של קרדיומיוציטים מגיע ממחקרים אקדמיים שנערכו עם תאים שבודדו מלבבות בעלי חיים18. לפיכך, מודל הכיווץ האופטי של קרדיומיוציטים אנושי פותח את האפשרות לביצוע מחקרים תרגומיים ביקורתיים. כדי לבצע מחקרים אלה, יש לפתח פרוטוקולים לשימור ומשלוח של קרדיומיוציטים בוגרים אנושיים (הנמצאים כעת בהערכה במעבדה של AnaBios), ולמערכת ההתכווצות חייבת להיות היכולת לרשום שינויים באורך הסרקומר מקרדיומיוציטים שאינם אנושיים (זה המקרה עם מערכת רישום ההתכווצות האופטית מכיוון שסרקומרים נשמרים היטב בין מינים).

מערכת התכווצות הקרדיומיוציטים האנושית יכולה לחקות מספר מצבים פיזיולוגיים (למשל, צימוד אלקטרומכני, תדר קצב המחקה את קצב הלב, טמפרטורת הגוף, שילוב כל מטרות הלב האנושיות) והוכיחה ערך תרגומי כמרכיב מרכזי בגילוי תרופות11,12,13,14אם כי הוא אינו יכול לחקות את השינויים בעומס מכני ובלחץ הגזירה שנצפו במהלך מחזור התכווצות הלב., המבנה והתפקוד של מטריצות חוץ-תאיות לבביות מובנים כיום טוב יותר19, פיתוח מטריצות כאלה יכול לסייע להתגבר על מגבלת העומס המכאני, ומטריצות עם נוקשות דומה ללב שונות נבדקות כעת במעבדה של AnaBios. מגבלה נוספת של מערכת ההתכווצות האופטית של קרדיומיוציטים אנושיים היא היעדר רשת העצבים המספקת את הלב (למשל, סיבים סימפתטיים ופאראסימפתטיים)20. קשר נוירו-לבבי זה יכול להיווצר מחדש באמצעות יישום משותף של מוליכים עצביים (למשל, איזופרוטרנול, אגוניסט של קולטני β-אדרנוצפטור; אצטילכולין, אגוניסט של קולטני M2 מוסקריניים), כאשר התרכובת מוערכת על השפעותיה האפשריות על התכווצות קרדיומיוציטים. יתר על כן, מעברי ההתכווצות נרשמים ללא מדידות סימולטניות של פוטנציאלי פעולה וטרנזיאנטים Ca 2+, שהם חיוניים גם בעת הערכת השפעות התרופה על האק"ג והטיפול ב- Ca2+. למרות שהשמטה זו יכולה להיחשב כמגבלה של המערכת, היא אינה קריטית מדי מכיוון שהקלטות של אותות פוטנציאליים לפעולה (עם שיטת מהדק זרם או צבעים רגישים למתח) ומעברי Ca 2+ (עם מחוונים / צבעיםCa 2+) יכולים להיות קשורים לציטוטוקסיות. השפעות ציטוטוקסיות כאלה יכולות להשפיע על הערכה של תרופות חדשות כדי לווסת את התכווצות הלב. להיפך, שימוש בשיטה אופטית לא פולשנית המשמרת את הבריאות, הפיזיולוגיה והפרמקולוגיה של הקרדיומיוציטים, כמו מערכת הרישום המתוארת בפרוטוקול זה, לא רק יבטיח קבלת נתוני התכווצות באיכות הגבוהה ביותר, אלא גם יספק נתונים שיכולים לחזות היטב את ההשפעות המתכווצות של תרופות חדשות בבני אדם.

גילויים

כל המחברים הם עובדי תאגיד AnaBios ומצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי AnaBios Corporation ומענק NIH Small Business Innovation Research (SBIR) (1R44TR003162-01).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100– 1000 ומיקרו; L מסונן, פתח רחב, קצוות סטרילייםפיפטהUF-1000W
100 מ"ל, בקבוקי לחץ דוראן פלוסDWK Life Sciences218102406
1 ליטר, 0.22 ומיקרו; m מערכת מסנן ואקוםVWR567-0020
290 מילימול/ק"ג אוסמולריות סטנדרטיתWescorOA-029
מד pH שולחנימטלר טולדוhttps://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2)מצלמת סיגמא-אולדריץ'C3881
 Optronis GmbHציקלון-25-150-Mhttps://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
קורנינג 25 מ"מ x25 מ"מ מרובע #1 כיסוי זכוכיתקורנינג2845-25
ציקלון-25-150Optronishttps://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270
טיימר דיגיטלי/שעון עצרפישר סיינטיפיק14-649-17
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD8418
צלחת תרבית סטרילית מפוליסטירן מלבנית בעלת שמונה בארותThermo Fisher Scientific73521-426
https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific מערכת תא מיקרוסקופ FHDIonOptix
Flow EZ, בקר זרימה מודולרי מבוסס לחץ עם תוכנית מונעת מחשב גרסת 1.1.0.0.OxyGEN
VWR16211-080
HEPESSigma-AldrichH3375
למינין רקומביננטי אנושי 521BioLaminaLM521-05
צינורות כרומטוגרפיה IDEX, FEP טבעי, 1/16 אינץ' OD x 0.030 אינץ' IDCole-Palmer1520L
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes, פישר סיינטיפיק06-666
L-(-)-חומצה מאלית, חומצהסיגמא-אולדריץ'112577
חומצה לקטוביונית, חומצהסיגמא-אולדריץ153516
L-גלוטמיתסיגמא-אולדריץ'49449
L-היסטידיןסיגמא-אולדריץH8000
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl<תת>2)Sigma-AldrichM9272
מיקרוסקופ בקרת טמפרטורה שלב מחמם AmScopeTCS-100
MyoPacer ממריץ שדהIonOptix
Nunc כלים מלבנייםתרמו סיינטיפיק267062
אולימפוס IX83P1ZF Ixplore מיקרוסקופ סטנדרטיאולימפוסhttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid
=116963199831& מילת מפתח=ix73%20
מיקרוסקופ& gclid=EAIaIQobChMIl
qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA
YASAAEgLp3fD_BwE
pH 4.01, 7.00 ו-10.01 תקניםאוקטוןWD-05942-10
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץ746436
אשלגן הידרוקסיד (KOH)Sigma-AldrichP4494
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)תוכנת GraphPad של Sigma-Aldrich795488
Prism- Dotmatics
https://www.graphpad.com/ RBS 25 חומר ניקוי נוזליSigma-Aldrich83460
Sharps ContainerUlineS-15307
SigmaPlot תוכנת ניתוחSystat Software Inc.https://systatsoftware.com/
נתרן כלורי (NaCl)סיגמא-אולדריץ'S3014
נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אולדריץ'221465
סטודנט דומונט #5 מלקחייםכלים מדעיים עדינים91150-20
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S7903
טאוריןסיגמא-אולדריץ'T0625
תיבת בקרת טמפרטורהWarner InsturmentsTC-324C
אוסמומטר לחץ אדיםELITechGroupדגם 5600
בקבוקוני Wheaton 20 מ"לDWK מדעי החיים225288
בקבוקי ואקום כבדים של ' , , ' , '

מקורות

  1. Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806(2020).
  2. Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
  3. Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
  4. Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
  5. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  6. Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
  7. Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597(2017).
  8. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109(2017).
  9. Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
  10. Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
  11. Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073(2017).
  12. Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692(2020).
  13. Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
  14. Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014(2021).
  15. Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370(2021).
  16. Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
  17. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  18. Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M. Animal ethics in cardiovascular research. Cardiovascular Research. 93 (1), 1-3 (2012).
  19. Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial extracellular matrix. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
  20. Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

קרדיומיוציטים אנושייםמדידת כיווץהקלטה אופטיתקיצור סרקומריםגרייה בשדה חשמליתגובה לריכוזתנודה של סידןהערכה לבבית פרה-קליניתאמפליטודת כיווץ
מדידת התכווצות הלב בקרדיומיוציטים ראשוניים אנושיים בוגרים מבודדים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.