מאמר שיטה

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

DOI:

10.3791/64404

⸱

23 בדצמבר 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקלאות ימית היא אחד מענפי ייצור המזון הצומחים ביותר בעולם, וחקלאות האמנון (Oreochromis spp.) מהווה את זן דגי המים המתוקים העיקרי שתורבת. מאחר ששיטות חקלאות ימית רגישות לזיהום מיקרוביאלי שמקורו במקורות אנתרופוגניים, יש צורך בשימוש נרחב באנטיביוטיקה, מה שמוביל לכך שמערכות חקלאות ימית הופכות למקור חשוב של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ופתוגניים בעלי רלוונטיות קלינית כגון Escherichia coli (E. coli). כאן, העמידות האנטי-מיקרוביאלית, הווירוליות והתכונות הניידות של זן E. coli פתוגני, שהתאושש מאוראוכרומיס spp., שגודלו באדמה, הובהרו באמצעות ריצוף גנום שלם (WGS) ובאנליזה של סיליקו . בוצעו בדיקות רגישות מיקרוביאלית (AST) ו- WGS. יתר על כן, קבוצה פילוגנטית, סרוטיפ, הקלדת רצף מולטילוקוס (MLST), עמידות אנטי-מיקרוביאלית נרכשת, אלימות, פלסמיד ותוכן נבואה נקבעו באמצעות כלי אינטרנט זמינים מגוונים. מבודד E. coli הפגין רק רגישות ביניים לאמפיצילין ואופיין כזן ONT:H21-B1-ST40 על ידי הקלדה מבוססת WGS. אף על פי שזוהה רק גן אחד הקשור לעמידות מיקרוביאלית [mdf(A)], זוהו מספר גנים הקשורים לווירולנציה (VAGs) מהפתוטיפ האנטרופתוגני הלא טיפוסי E. coli (aEPEC). בנוסף, זוהה מטען של רפליקונים פלסמידים מקבוצות פלסמידים גדולות ו-18 אזורים הקשורים לנבואה. לסיכום, האפיון של WGS של מבודד aEPEC, שהתאושש מחוות דגים בסינלואה, מקסיקו, מאפשר תובנות לגבי הפוטנציאל הפתוגני שלו והסיכון הבריאותי האפשרי של בני אדם בצריכת מוצרים גולמיים מתחום החקלאות הימית. יש צורך לנצל את טכניקות הריצוף של הדור הבא (NGS) לחקר מיקרואורגניזמים סביבתיים ולאמץ מסגרת בריאות אחת כדי ללמוד כיצד נוצרות בעיות בריאות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקלאות ימית היא אחד מענפי ייצור המזון הצומחים ביותר בעולם, ושיטות הייצור שלה נועדו לספק את הביקוש הגובר למזון לצריכה אנושית. ייצור החקלאות הימית העולמי שילש את עצמו מ-34 מיליון טון (Mt) ב-1997 ל-112 טון ב-20171. קבוצות המינים העיקריות, שתרמו לכמעט 75% מהייצור, היו אצות, קרפיונים, דו-חיים, שפמנון ואמנון (Oreochromis spp.) 1. עם זאת, הופעת מחלות הנגרמות על ידי ישויות מיקרוביאליות היא בלתי נמנעת בגלל גידול דגים אינטנסיבי, המוביל להפסדים כלכליים פוטנציאליים2.

שימוש באנטיביוטיקה בשיטות גידול דגים ידוע במניעה וטיפול בזיהומים חיידקיים, הגורם המגביל העיקרי בפרודוקטיביות 3,4. עם זאת, שאריות אנטיביוטיקה מצטברות במשקעי חקלאות ימית ובמים, מפעילות לחץ סלקטיבי ומשנות את קהילות החיידקים הקשורות לדגים ואת קהילות החיידקים השוכנות ב-5,6,7,8. כתוצאה מכך, סביבת החקלאות הימית משמשת כמאגר לגנים של עמידות מיקרוביאלית (ARGs), ולהמשך הופעתם והתפשטותם של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה (ARB) בסביבה9. בנוסף לפתוגנים החיידקיים הנצפים בדרך כלל המשפיעים על שיטות גידול דגים, חברים ממשפחת Enterobacteriaceae נתקלים לעתים קרובות, כולל זנים פתוגניים אנושיים של Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., ו סלמונלה spp.10. E. coli הוא המיקרואורגניזם הנפוץ ביותר המבודד מארוחות דגים ומים בגידול דגים 11,12,13,14,15.

E. coli הוא חיידק גראם שלילי רב-תכליתי המאכלס את מערכת העיכול של יונקים וציפורים כחבר קומנסלי במיקרוביוטה של המעיים שלהם. עם זאת, E. coli הם בעלי יכולת הסתגלות גבוהה להתיישב ולהתמיד בנישות סביבתיות שונות, כולל אדמה, משקעים, מזון ומים16. בגלל הרווח וההפסד של הגנים באמצעות תופעת העברת הגנים האופקית (HGT), E. coli התפתח במהירות לפתוגן עמיד לאנטיביוטיקה מותאם היטב, המסוגל לגרום לספקטרום רחב של מחלות בבני אדם ובבעלי חיים17,18. בהתבסס על מקור הבידוד, וריאנטים פתוגניים מוגדרים כ- E. coli פתוגני מעיים (InPEC) או E. coli פתוגני חוץ-מעיים (ExPEC). יתר על כן, InPEC ו- ExPEC מסווגים לפתוטיפים מוגדרים היטב על פי ביטוי המחלה, הרקע הגנטי, תכונות פנוטיפיות וגורמי אלימות (VFs)16,17,19.

תרבית מסורתית וטכניקות מולקולריות לזני E. coli פתוגניים אפשרו זיהוי וזיהוי מהירים של פתוטיפים שונים. עם זאת, הם עשויים להיות זמן רב, מייגע, ולעתים קרובות דורשים הכשרה טכנית גבוהה19. יתר על כן, לא ניתן להשתמש בשיטה אחת כדי לחקור באופן אמין את כל הגרסאות הפתוגניות של E. coli בגלל המורכבות של הרקע הגנטי שלהן. נכון לעכשיו, חסרונות אלה התגברו עם הופעתן של טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה (HTS). גישות ריצוף גנום שלם (WGS) וכלים ביואינפורמטיים שיפרו את חקר הדנ"א המיקרוביאלי במחיר סביר ובקנה מידה גדול, ואפשרו אפיון מעמיק של מיקרובים בריצה אחת, כולל גרסאות פתוגניות קרובות20,21,22. בהתאם לשאלות הביולוגיות, ניתן להשתמש במספר כלי ביואינפורמטיקה, אלגוריתמים ומאגרי מידע כדי לבצע ניתוח נתונים. לדוגמה, אם המטרה העיקרית היא להעריך את הנוכחות של ARGs, VFs ופלסמידים, כלים כגון ResFinder, VirulenceFinder ו- PlasmidFinder, יחד עם מסדי הנתונים המשויכים אליהם, עשויים להיות נקודת התחלה טובה. Carriço et al.22 סיפקו סקירה מפורטת של תוכנות הביואינפורמטיקה השונות ומסדי הנתונים הקשורים המיושמים לניתוח WGS מיקרוביאלי, החל מעיבוד נתונים גולמיים וכלה בהסקה פילוגנטית.

מספר מחקרים הוכיחו את התועלת הרחבה של WGS לחקירת גנום בנוגע לתכונות עמידות מיקרוביאלית, פוטנציאל פתוגני ומעקב אחר הופעתם והקשרים האבולוציוניים של גרסאות רלוונטיות מבחינה קלינית של E. coli שמקורן במקורות מגוונים23,24,25,26 . WGS אפשרה לזהות מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס העמידות הפנוטיפית לאנטי-מיקרוביאלים, כולל אותם מנגנוני עמידות נדירים או מורכבים. זאת באמצעות איתור וריאנטים נרכשים של ARG, מוטציות חדשות בגנים של מטרות תרופות, או אזורים מקדמים27,28. יתר על כן, WGS מציע את הפוטנציאל להסיק פרופילי עמידות מיקרוביאלית ללא צורך בידע מוקדם על פנוטיפ העמידות של זן חיידקי29. לחלופין, WGS אפשרה לאפיין את האלמנטים הגנטיים הניידים (MGEs) הנושאים הן עמידות מיקרוביאלית והן תכונות של אלימות, מה שהניע את התפתחות הגנום החיידקי של פתוגנים קיימים. לדוגמה, היישום של WGS במהלך חקירת התפרצות E. coli הגרמנית בשנת 2011 הביא לחשיפת המאפיינים הגנומיים הייחודיים של פתוטיפ E. coli חדשני לכאורה; באופן מעניין, זני התפרצות אלה מקורם בקבוצת E. coli האנטרוגרגטיבית (EAEC), שרכשה את הנבואה המקודדת את רעלן שיגה מהפתוטיפ E. coli (EHEC) האנטרוהמורגי30.

עבודה זו מציגה התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי באמצעות רצף benchtop. יתר על כן, צינור ביואינפורמטיקה מסופק באמצעות כלים מבוססי אינטרנט כדי לנתח את הרצפים המתקבלים ולתמוך עוד יותר בחוקרים עם מומחיות מוגבלת או ללא מומחיות בביואינפורמטיקה. השיטות המתוארות אפשרו להבהיר את העמידות האנטי-מיקרוביאלית, הווירוליות והתכונות הניידות של זן E. coli פתוגני ACM5, שבודד בשנת 2011 מאוראוכרומיס spp. שגודל בפנים הארץ בסינלואה, מקסיקו12.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: זן E. coli ACM5 שוחזר על ידי עיבוד וגידול דגימת הדגים לקביעת קוליפורם צואה (FC)12. במהלך דגימת הדגים, הדגים לא הראו סימנים קליניים של מחלה, זיהום חיידקי או פטרייתי, וטמפרטורה ממוצעת של 22.3 מעלות צלזיוס שררה. לאחר הבידוד, המבודד E. coli עבר בדיקות ביוכימיות והושמע בהקפאה בציר עירוי לב מוחי (BHI) עם DMSO (8% v/v) כחומר מגן בהקפאה.

1. הפעלה מחדש של תרבות המניות הקפואה של E . coli ACM5

  1. ממלאי החיידקים הקפואים, פתחו את השפופרת והשתמשו בלולאה סטרילית, קצה פיפטה או קיסם כדי לגרד את פני השטח של תרבית החיידקים הקפואים.
  2. פזרו את החיידקים על צלחת אגר של לוריא-ברטני (LB) ודגרו בטמפרטורה של 37 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

2. קביעת רגישות אנטיבקטריאלית

הערה: בדיקת הרגישות האנטי-מיקרוביאלית המתוארת כאן תואמת לשיטת פיזור הדיסק המבוססת על הנחיות המכון לתקנים קליניים ומעבדתיים (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. אי קולי זן ATCC 25922 נדרש למטרות בקרת איכות.

  1. הכנת אינוקולום בשיטת השעיית מושבה
    1. מצלחת LB שדוגרת בשלב 1.2, פוסעים מושבה אחת או שתיים על צלחת אגר של מולר-הינטון (MH) ודוגרים בטמפרטורה של 37 ± 2 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות.
    2. השתמש בלולאה סטרילית כדי לבחור שתיים או שלוש מושבות מתת-התרבות הטרייה של E. coli מבודדות על צלחת אגר MH ולהחיות אותן ב-3 מ"ל של ציר MH סטרילי או תמיסת מלח 0.85% (w/v), תוך ערבוב יסודי על ידי מערבולת כדי לקבל תרחיף חיידקים אחיד.
    3. באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV (ראו טבלת חומרים), התאימו את מתלה החיידקים לעכירות דומה לתקן MacFarland של 0.5 (שווה ערך לכ-1-2 x 108 תאים /מ"ל). אם מתלה החיידקים קל מדי או כבד מדי, הוסיפו עוד מושבות E. coli או ציר MH לפי הצורך. השתמש inoculum מוכן בתוך 15 דקות של הכנה.
  2. חיסון צלחות אגר הבדיקה
    1. טבלו צמר גפן סטרילי במתלה החיידקים המותאם. סובב את המטוש מספר פעמים ולחץ אותו בחוזקה על הקיר הפנימי של הצינור כדי להסיר נוזל עודף מן המטוש.
    2. יש לחסן צלחת אגר MH על ידי הטיית המטוש פי 3 על פני כל משטח האגר, תוך סיבוב הצלחת ב-60° בכל פעם. לטבול גם את שפת האגר כדי להבטיח התפלגות שווה של האינוקולום.
    3. השאירו את מכסה צלחת הפטרי אג'אר למשך 3-5 דקות כדי לאפשר ללחות להתאדות.
  3. יישום של הדיסק האנטי מיקרוביאלי על צלחות אגר מחוסנות
    1. פזרו באופן שווה ולחצו על כל דיסק אנטי-מיקרוביאלי (ראו טבלת חומרים) על פני השטח של לוחות האגר המחוסנים כדי להבטיח מגע מלא. הפוך את הלוחות תוך 15 דקות לאחר יישום הדיסק ודגרה ב 35 ± 2 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות.
      הערה: יש להשתמש ב-12 ו-6 דיסקים לכל היותר בצלחות פטרי של 150 מ"מ ו-100 מ"מ, בהתאמה.
  4. לאחר הדגירה, מדוד את אזור גדלי העיכוב באמצעות קליפר ורנייה ופרש את הקטרים המתקבלים על פי קריטריוני נקודת השבירה של CLSI (M100 - טבלה 2A)32.

3. מיצוי וכימות דנ"א גנומי (gDNA)

  1. מיצוי DNA גנומי
    1. החזירו לולאה של מושבות E. coli טריות ב-5 מ"ל של מרק LB ודגרו למשך הלילה באינקובטור רועד (180 סל"ד) בטמפרטורה של 37 ± 2 מעלות צלזיוס.
    2. צנטריפוגה את מתלה החיידקים ב 3,500 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך בזהירות את supernatant.
    3. חלץ gDNA בהתאם להנחיות ערכת מיצוי ה- DNA (ראה טבלת חומרים).
    4. בדוק את טוהר ה- gDNA על ידי מדידת צפיפות אופטית ב- 260/280 ננומטר (יחס: >1.8) ו- 260/230 ננומטר (יחס: 2.0-2.2) באמצעות ספקטרופוטומטר הנראה לעין UV. בצע אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 0.8% כדי לאמת את שלמות ה- gDNA.
  2. כימות דנ"א גנומי
    הערה: השתמש רק בצינורות PCR דקים, שקופים, בגודל 0.5 מ"ל, שאושרו על-ידי יצרן ערכת הבדיקה הפלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים).
    1. הגדר את המספר הנדרש של צינורות עבור דגימות ותקני בדיקה. הכן את פתרון הבדיקה העובדת על ידי ערבוב רכיב A ורכיב B המסופקים בערכה, בהתאם להנחיות היצרן.
    2. הכן את תקני הבדיקה על ידי הוספת 190 μL של הפתרון עובד ו 10 μL של כל תקן לצינור המתאים (שני תקנים נדרשים).
    3. הוסף 198 μL של התמיסה העובדת ו -2 μL של דגימת ה- DNA לצינור המתאים. מערבבים במרץ על ידי מערבולת כל הצינורות במשך 5 שניות. היזהרו לא ליצור בועות.
    4. לדגור את כל הצינורות במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. מדוד את הפלואורסצנטיות של כל הצינורות בהתבסס על הנחיות היצרן באמצעות הפלואורומטר (ראה טבלת חומרים).
    5. התאם כראוי את ריכוז דגימת ה- gDNA להמשך הריצוף.

4. הכנת ספריית DNA

הערה: ההכנה והריצוף של ספריית DNA בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים של היצרן (ראה טבלת חומרים). ריכוז ה-gDNA ההתחלתי הוא 4.0 ננוגרם.

  1. תיוג, הגברה של PCR ואינדקס
    1. בצינור של 0.2 מ"ל, הוסף 2.5 μL של מאגר תיוג ו-2 μL של gDNA קלט (2.0 ng/μL). מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה.
    2. מוסיפים 1 μL של חיץ הגברה ומערבבים בעדינות על ידי פיפטציה. יש לסובב כלפי מטה ב-280 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    3. הניחו את הדגימות בתרמו-ציקלר (ראו טבלת חומרים) והפעילו את תוכנית ה-PCR הבאה: 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן החזיקו בטמפרטורה של 10°C. כאשר הדגימות מגיעות ל -10 מעלות צלזיוס, המשך מיד לנטרל את התגובה.
    4. הוסיפו 1 μL של חיץ מנטרל לצינורות הדגימה וערבבו בעדינות על ידי פיפטציה. יש לסובב בעוצמה של 280 x גרם למשך דקה אחת ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. הוסף 1.7 μL של כל מתאם אינדקס (כלומר, אינדקסים i7 ו- i5) ו- 3 μL של אינדקס PCR מאסטר תמהיל. מערבבים בעדינות על ידי פיפטציה. יש לסובב כלפי מטה ב-280 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    6. מניחים את הדגימות בתרמוציקלר ומבצעים תגובת PCR שנייה באופן הבא: 72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 18 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ומחזיקים בטמפרטורה של 10 מעלות צלזיוס.
  2. ניקוי מוגבר של הספרייה
    1. ערבבו על ידי מערבולת פתרון החרוז המגנטי המסחרי (ראו טבלת חומרים) בהתבסס על הנחיות היצרן.
    2. העבירו את דגימת ה-gDNA המתויגת/אינדקס לצינור חדש של 1.5 מ"ל והוסיפו 0.6 מיקרון ליטר של חרוזים מגנטיים עבור כל μL של הנפח הסופי של דגימת gDNA (≈13 μL). מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג ודוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הניחו את צינורות הדגימה על מתלה מגנטי (ראו טבלת חומרים) למשך 2 דקות עד שהסופר-נטנט יתנקה. מוציאים ומשליכים את החרוזים בזהירות מבלי להפריע לחרוזים.
    4. הוסיפו 200 מיקרון ליטר של 80% אתנול טרי מבלי לערבב. מדגרים במשך 30 שניות עד שה-eluate מתנקה ומסירים בזהירות ומשליכים בזהירות את החרוזים מבלי להפריע לחרוזים.
    5. בצע שלב שטיפה שני. יש להוסיף 200 μL של 80% אתנול לחרוזים ולדגירה במשך 30 שניות. לאחר שה-eluate מתבהר, מסירים ומשליכים את החרוזים ומייבשים באוויר למשך 10 דקות.
    6. מוסיפים 15 מיקרון של 10 מ"מ טריס בופר (pH 8) לחרוזים ומערבבים בעדינות על ידי פיפטציה. לדגור במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הניחו שוב את צינורות הדגימה על המדף המגנטי למשך 2 דקות, ואפשרו לסופר-נטנט להתנקות.
    7. העבר בזהירות 14 μL של supernatant מן צינור הדגימה לצינור חדש 0.2 מ"ל. זוהי הספרייה המנוקה.
      הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את הספרייה הנקייה בטמפרטורה של -20°C למשך עד 7 ימים.
  3. נורמליזציה של ספריה
    1. המשך לכמת את הספריות המנוקות על ידי בדיקה פלואורסצנטית כמתואר בשלב 3.2, למעט שלב 3.2.5.
    2. דמיינו את הספריות המנוקות על אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% כדי לקבוע את גודל השבר הממוצע.
    3. חשב את ערך הטוחנות של הספריה באמצעות המשוואה הבאה:
      figure-protocol-1
    4. באמצעות ערך הטוחנות, חשב את הנפחים המתאימים של מאגר resuspension (RSB) וספריות מנוקות כדי לדלל את הספרייה הבודדת בריכוז התחלתי של 10 ננומטר.

5. איגום ספרייה, דה-טבעיזציה וייזום רצף

  1. הפשירו את מחסנית הריאגנט בהתאם להוראות היצרן. חלצו את תא הזרימה מהמקרר (4 מעלות צלזיוס) והביאו אותו לטמפרטורת החדר לפני הרצף.
  2. בריכה 5 μL של כל ספרייה מנורמלת (10 ננומטר) לתוך צינור נמוך לקשור 1.5 מ"ל. דלל את הספרייה המאוגדת ב-4 ננומטר עם הנפח המתאים של RSB.
  3. הוסף 5 μL של הספרייה המאוגדת (4 ננומטר) ו- 5 μL של 0.2 N NaOH בצינור חדש של 1.5 מ"ל עם קשירה נמוכה. מערבבים לזמן קצר על ידי מערבולות, מסתובבים ב-280 x גרם למשך דקה אחת, ודוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל את הספרייה המאוגדת לגדילים בודדים.
  4. ערבבו בעדינות 10 μL של ספרייה שעברה דנטורציה ו-990 μL של חיץ הכלאה מוכן מראש על ידי פיפטינג והניחו על קרח עד לביצוע הדילול הסופי לטעינת רצף. ריכוז הספרייה המפורקת הוא 20 pM.
  5. להפשיר ולהכין ספריית בקרה (ראו טבלת חומרים) בריכוז של 4 ננומטר על ידי ערבוב של 2 μL של ספריית בקרה (10 ננומטר) ו-3 μL של מים נטולי נוקלאז.
  6. מערבבים 5 μL של ספריית הבקרה (4 ננומטר) ו-5 μL של 0.2 N NaOH מוכן טרי. ערבבו לזמן קצר על ידי מערבולת, סובבו כלפי מטה ב-280 x g למשך דקה אחת, ודגרו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנטרל את ספריית הבקרה לגדילים בודדים.
  7. ערבבו בעדינות 10 μL של ספריית בקרה מפורזת ו-990 μL של מאגר הכלאה מוכן מראש על ידי פיפטינג והניחו על קרח עד לסיום הדילול הסופי לטעינת רצף. הריכוז של ספריית הבקרה המפורזת הוא 20 pM.
  8. בצינור חדש של 1.5 מ"ל עם חיבור נמוך, שלבו 594 μL של ספריית המאגר המפורק ב-20 pM ו-6 μL של ספריית הבקרה המפורק ב-20 pM. מערבבים כמו שצריך.
  9. דלל את תערובת הספרייה הסופית (20 pM) לריכוז טעינה סופי של 1.2 pM בנפח של 600 μL באמצעות מאגר ההכלאה המוכן מראש.
  10. לפני טעינת תערובת הספרייה הסופית על מחסנית הריאגנט, בצע טיפול תרמי נוסף כדי להשיג העמסה יעילה לתוך תא הזרימה. דגרו את תערובת הספרייה הסופית למשך 2 דקות בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס. הפוך את הצינור כדי לערבב, והנח את הצינור על קרח במשך 5 דקות.
  11. טען 500 μL של תערובת הספרייה הסופית לתוך המאגר המתוכנן על מחסנית מגיב. התחל רצף בהתאם להנחיות. טען את תא הזרימה ואת מחסנית הריאגנט והגדר את ריצת הריצוף.

6. ניתוח נתוני רצף

הערה: בדוק את קובץ משלים 1 לתיאור נוסף של עיבוד מקדים של נתוני WGS כלליים, תוכנה, הגדרות פרמטרים וניתוח רצף של הגנום של E. coli.

  1. התחבר לשרת נתוני הרצף והורד את קבצי FASTQ.
  2. הערך את האיכות הראשונית של נתוני רצף גולמיים באמצעות תוכנת צד שלישי. הסר רצפי מתאמים שרידים, בסיסים באיכות נמוכה (קובץ משלים 1).
  3. הרכיבו את נתוני הריצוף שנבדקו באיכות לרמת ה-contig או הפיגומים באמצעות תוכנת צד שלישי (ראו קובץ משלים 1).
  4. בצע ביאור גנום על-ידי שליחת קובץ FASTA המכיל את הגנום המורכב לשרת RAST (https://rast.nmpdr.org/).
  5. העלה את קובץ FASTA לפלטפורמות האינטרנט של המרכז לאפידמיולוגיה של הגנום (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) ו- ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) כדי לזהות תכונות אפידמיולוגיות, ARGs, VAGs ופלסמידים (ראה קובץ משלים 1).
  6. העלה את קובץ FASTA לשרת PHASTER כדי לזהות רצפי נבואה (https://phaster.ca/).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרגישות האנטי-מיקרוביאלית נקבעה על ידי שיטת דיפוזיית הדיסק ופורשה על ידי קריטריוני נקודת השבירה של CLSI עבור 12 אנטיביוטיקות המתפרשות על פני שישה סוגים אנטי-מיקרוביאליים שונים, כלומר, אמינוגליקוזידים, β-לקטמים, פלואורוקווינולונים, ניטרופורנים, פניקולים ואנטגוניסטים של מסלול חומצה פולית. ה- E. coli ACM5 הפגין רגישות לכל האנטיביוטיקות למעט תרופה אחת של β לקטאם. נבדקו ארבע תרופות β-לקטאם: אמפיצילין, קרבניצ'לין, צפלוטין וצפוטקסימה. בין אלה נמדדה הילה מעכבת של 14 מ"מ לאמפיצילין. לכן, על פי הקטגוריות הפרשניות CLSI עבו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג התאמה של זרימת העבודה של חיידקי WGS באמצעות רצף ספסל וצינור לאפיון גנומי של וריאנט E. coli פתוגני. בהתאם לפלטפורמת הריצוף שבה נעשה שימוש, זמני ההסבה (TATs) עבור הליכי מעבדה רטובים (גידול חיידקים, מיצוי gDNA, הכנת ספרייה וריצוף) וניתוח רצפים עשויים להשתנות, במיוחד אם נחקרים חיידקים שגדלים לאט. בעקבות הפרוטוקול עבור WGS שתואר לעיל, TAT היה בתוך 4 ימים, אשר דומה למה הספרות כיום קובע (<5 ימים) 34.

עומק הכיסוי התיאורטי לריצוף גנום של E. coli AC...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה של מקסיקו (CONACyT בראשי התיבות שלה בספרדית) עבור מלגת הדוקטורט שהוענקה לחוסה אנטוניו מאגניה-ליזאראגה [מס' 481143].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Accublock Mini אמבט יבש דיגיטליLabnetD0100אמבטיה יבשה לדגירה של צינורות
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881חרוזים מגנטיים בתמיסה לטיהור ספריית DNA
DeNovix DS-11DeNovix Inc.ספקטופוטומטר UV-Vis לבדיקת איכות צינורות ה-DNA LoBind שחולצו ב-gDNA
Eppendorf0030108418צינורות PCR של 1.5 מ"ל לספריית DNA איגום
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321Dמתלה מיקרו-צינור מגנטי המשמש במהלך טיהור DNA מבוסס חרוזים מגנטיים
תעודת זהות גראם-שלילית Multibac I.D.מחקר אבחון (מקסיקו)PT-35דיסקים אנטיביוטיים סטנדרטיים מסחריים לבדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית
ערכת פלט בינונית של MiniSeq (300 מחזורים)IlluminaFC-420-1004Reagent cartdrige לריצוף קצה מזווג (2x150)
מכשיר מערכת MiniSeqIlluminaSY-420-1001רצף שולחני המשמש לריצוף הדור הבא
צנטריפוגהMiniSpinEppendorf5452000816צנטריפוגה סטנדרטית לצינורות
Nextera XT ערכת הכנת ספריית DNAIlluminaFC-131-1024ריאגנטים לביצוע ספריות DNA לריצוף. כולל ריאגנטים תיבה 1 ותיבה 2 עבור 24 דגימות
ערכת אינדקס Nextera XT v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004סט אינדקס A, B, C, D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001בקרת ספריית DNA לרצף
אמבט מים מדויקLabCare America51221081שייקר אמבט מים המשמש לתרבית חיידקים
Qubit 1X dsDNA HS ערכתבדיקהInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231ריאגנטים לבדיקת כימות DNA מבוססת פלואורסצנציה
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866פלואורומטר המשמש לבדיקת פלואורסצנטי 
צינורות בדיקת קיוביטInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32856צינורות PCR 0.5 מ"ל לבדיקת כימות DNA מבוססת פלואורסצנטי 
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler המשמש להגברת ספריית DNA
ספקטרוני GENESYS 10 VisThermo335900ספקטופופוטומטר המשמש לתרחיף חיידקים בבדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300למיצוי DNA גנומי (50 הכנות)
ערכת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160(2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854(2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173(2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626(2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128(2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653(2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136(2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782(2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662(2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437(2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957(2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204(2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

תגיות

Antimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

מאמרים קשורים