Method Article

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

DOI:

10.3791/64404

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקלאות ימית היא אחד מענפי ייצור המזון הצומחים ביותר בעולם, וחקלאות האמנון (Oreochromis spp.) מהווה את זן דגי המים המתוקים העיקרי שתורבת. מאחר ששיטות חקלאות ימית רגישות לזיהום מיקרוביאלי שמקורו במקורות אנתרופוגניים, יש צורך בשימוש נרחב באנטיביוטיקה, מה שמוביל לכך שמערכות חקלאות ימית הופכות למקור חשוב של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ופתוגניים בעלי רלוונטיות קלינית כגון Escherichia coli (E. coli). כאן, העמידות האנטי-מיקרוביאלית, הווירוליות והתכונות הניידות של זן E. coli פתוגני, שהתאושש מאוראוכרומיס spp., שגודלו באדמה, הובהרו באמצעות ריצוף גנום שלם (WGS) ובאנליזה של סיליקו . בוצעו בדיקות רגישות מיקרוביאלית (AST) ו- WGS. יתר על כן, קבוצה פילוגנטית, סרוטיפ, הקלדת רצף מולטילוקוס (MLST), עמידות אנטי-מיקרוביאלית נרכשת, אלימות, פלסמיד ותוכן נבואה נקבעו באמצעות כלי אינטרנט זמינים מגוונים. מבודד E. coli הפגין רק רגישות ביניים לאמפיצילין ואופיין כזן ONT:H21-B1-ST40 על ידי הקלדה מבוססת WGS. אף על פי שזוהה רק גן אחד הקשור לעמידות מיקרוביאלית [mdf(A)], זוהו מספר גנים הקשורים לווירולנציה (VAGs) מהפתוטיפ האנטרופתוגני הלא טיפוסי E. coli (aEPEC). בנוסף, זוהה מטען של רפליקונים פלסמידים מקבוצות פלסמידים גדולות ו-18 אזורים הקשורים לנבואה. לסיכום, האפיון של WGS של מבודד aEPEC, שהתאושש מחוות דגים בסינלואה, מקסיקו, מאפשר תובנות לגבי הפוטנציאל הפתוגני שלו והסיכון הבריאותי האפשרי של בני אדם בצריכת מוצרים גולמיים מתחום החקלאות הימית. יש צורך לנצל את טכניקות הריצוף של הדור הבא (NGS) לחקר מיקרואורגניזמים סביבתיים ולאמץ מסגרת בריאות אחת כדי ללמוד כיצד נוצרות בעיות בריאות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקלאות ימית היא אחד מענפי ייצור המזון הצומחים ביותר בעולם, ושיטות הייצור שלה נועדו לספק את הביקוש הגובר למזון לצריכה אנושית. ייצור החקלאות הימית העולמי שילש את עצמו מ-34 מיליון טון (Mt) ב-1997 ל-112 טון ב-20171. קבוצות המינים העיקריות, שתרמו לכמעט 75% מהייצור, היו אצות, קרפיונים, דו-חיים, שפמנון ואמנון (Oreochromis spp.) 1. עם זאת, הופעת מחלות הנגרמות על ידי ישויות מיקרוביאליות היא בלתי נמנעת בגלל גידול דגים אינטנסיבי, המוביל להפסדים כלכליים פוטנציאליים2.

שימוש באנטיביוטיקה בשיטות גידול דגים ידוע במניעה וטיפול בזיהומים חיידקיים, הגורם המגביל העיקרי בפרודוקטיביו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: זן E. coli ACM5 שוחזר על ידי עיבוד וגידול דגימת הדגים לקביעת קוליפורם צואה (FC)12. במהלך דגימת הדגים, הדגים לא הראו סימנים קליניים של מחלה, זיהום חיידקי או פטרייתי, וטמפרטורה ממוצעת של 22.3 מעלות צלזיוס שררה. לאחר הבידוד, המבודד E. coli עבר בדיקות ביוכימיות והושמע בהקפאה בציר עירוי לב מוחי (BHI) עם DMSO (8% v/v) כחומר מגן בהקפאה.

1. הפעלה מחדש של תרבות המניות הקפואה של E . coli ACM5

  1. ממלאי החיידקים הקפואים, פתחו את השפופרת והשתמשו בלולאה סטרילית, קצה פיפטה או קיסם כדי לגרד את פני השטח של תרבית החיידקים הקפואים.
  2. פזרו את החיידקים על צלחת אגר של לוריא-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרגישות האנטי-מיקרוביאלית נקבעה על ידי שיטת דיפוזיית הדיסק ופורשה על ידי קריטריוני נקודת השבירה של CLSI עבור 12 אנטיביוטיקות המתפרשות על פני שישה סוגים אנטי-מיקרוביאליים שונים, כלומר, אמינוגליקוזידים, β-לקטמים, פלואורוקווינולונים, ניטרופורנים, פניקולים ואנטגוניסטים של מסלול חומצה פולית. ה- E. coli ACM5 הפגין רגישות לכל האנטיביוטיקות למעט תרופה אחת של β לקטאם. נבדקו ארבע תרופות β-לקטאם: אמפיצילין, קרבניצ'לין, צפלוטין וצפוטקסימה. בין אלה נמדדה הילה מעכבת של 14 מ"מ לאמפיצילין. לכן, על פי הקטגוריות הפרשניות CLSI עבו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג התאמה של זרימת העבודה של חיידקי WGS באמצעות רצף ספסל וצינור לאפיון גנומי של וריאנט E. coli פתוגני. בהתאם לפלטפורמת הריצוף שבה נעשה שימוש, זמני ההסבה (TATs) עבור הליכי מעבדה רטובים (גידול חיידקים, מיצוי gDNA, הכנת ספרייה וריצוף) וניתוח רצפים עשויים להשתנות, במיוחד אם נחקרים חיידקים שגדלים לאט. בעקבות הפרוטוקול עבור WGS שתואר לעיל, TAT היה בתוך 4 ימים, אשר דומה למה הספרות כיום קובע (<5 ימים) 34.

עומק הכיסוי התיאורטי לריצוף גנום של E. coli AC.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה של מקסיקו (CONACyT בראשי התיבות שלה בספרדית) עבור מלגת הדוקטורט שהוענקה לחוסה אנטוניו מאגניה-ליזאראגה [מס' 481143].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Accublock Mini אמבט יבש דיגיטליLabnetD0100אמבטיה יבשה לדגירה של צינורות
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881חרוזים מגנטיים בתמיסה לטיהור ספריית DNA
DeNovix DS-11DeNovix Inc.ספקטופוטומטר UV-Vis לבדיקת איכות צינורות ה-DNA LoBind שחולצו ב-gDNA
Eppendorf0030108418צינורות PCR של 1.5 מ"ל לספריית DNA איגום
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321Dמתלה מיקרו-צינור מגנטי המשמש במהלך טיהור DNA מבוסס חרוזים מגנטיים
תעודת זהות גראם-שלילית Multibac I.D.מחקר אבחון (מקסיקו)PT-35דיסקים אנטיביוטיים סטנדרטיים מסחריים לבדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית
ערכת פלט בינונית של MiniSeq (300 מחזורים)IlluminaFC-420-1004Reagent cartdrige לריצוף קצה מזווג (2x150)
מכשיר מערכת MiniSeqIlluminaSY-420-1001רצף שולחני המשמש לריצוף הדור הבא
צנטריפוגהMiniSpinEppendorf5452000816צנטריפוגה סטנדרטית לצינורות
Nextera XT ערכת הכנת ספריית DNAIlluminaFC-131-1024ריאגנטים לביצוע ספריות DNA לריצוף. כולל ריאגנטים תיבה 1 ותיבה 2 עבור 24 דגימות
ערכת אינדקס Nextera XT v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004סט אינדקס A, B, C, D
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001בקרת ספריית DNA לרצף
אמבט מים מדויקLabCare America51221081שייקר אמבט מים המשמש לתרבית חיידקים
Qubit 1X dsDNA HS ערכתבדיקהInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231ריאגנטים לבדיקת כימות DNA מבוססת פלואורסצנציה
Qubit 2.0 FluorometerInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866פלואורומטר המשמש לבדיקת פלואורסצנטי 
צינורות בדיקת קיוביטInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32856צינורות PCR 0.5 מ"ל לבדיקת כימות DNA מבוססת פלואורסצנטי 
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811Thermocycler המשמש להגברת ספריית DNA
ספקטרוני GENESYS 10 VisThermo335900ספקטופופוטומטר המשמש לתרחיף חיידקים בבדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitZymo Research Inc.D4300למיצוי DNA גנומי (50 הכנות)
ערכת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Escherichia ColiWhole Genome SequencingAntimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

Related Articles