מאמר זה מציג פרוטוקול למיקרו-דיסקציה עינית במכרסמים. התהליך כולל את האינקולציה של גלגל העין יחד עם הממברנה הניקטיבית (כלומר, העפעף השלישי). לאחר מכן מתבצעת הפרדה של המשקפיים האחוריים והקדמיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
המיקרו-דיסקציה העינית של עין המכרסם כוללת פילוח של גלגל העין המצוי עם הממברנה המצורפת, או העפעף השלישי, כדי להשיג את המשקפיים הקדמיים והאחוריים. בטכניקה זו, ניתן להשיג את חלקי המשנה של העין, כולל רקמת הקרנית, הרקמה העצבית, רקמת אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) והעדשה, עבור סיטומות, חתך קריו, ו / או מתלים חד תאי של רקמת עין ספציפית. נוכחותו של העפעף השלישי טומנת בחובה יתרונות ייחודיים ומשמעותיים, שכן היא מועילה לשמירה על כיוון העין, החשוב להבנת הפיזיולוגיה של העין לאחר התערבות מקומית כלשהי או במחקרים הכוללים אנליזה עינית הנוגעת לטופוגרפיה המרחבית של העין.
בשיטה זו חינכנו את גלגל העין בשקע יחד עם העפעף השלישי על ידי חיתוך זהיר ואיטי של השרירים החוץ-עיניים וקטיעת עצב הראייה. גלגל העין נוקב דרך לימבוס הקרנית באמצעות מיקרובלייד. החתך שימש כנקודת הכניסה, ואיפשר חיתוך לאורך צומת הקרנית-סקלרלית על ידי החדרת מיקרו-מספריים דרך נקודת החתך. חתכים קטנים ורצופים לאורך ההיקף נעשו עד שהכוסות נפרדו. ניתן לנתח אותם עוד יותר על ידי קילוף עדין של השכבה השקופה של הרשתית העצבית באמצעות מלקחיים לתפירת קוליברי כדי להשיג את שכבות הרשתית העצבית וה- RPE. יתר על כן, שלושה/ארבעה חתכים במרחקים שווים נעשו מהפריפריה בניצב למרכז הראייה עד להגעה לעצב הראייה. פעולה זו פתחה את הגביעים ההמיספריים לצורת פרח כך שהם נפלו שטוחים וניתן היה להרכיב אותם בקלות. טכניקה זו שימשה במעבדה שלנו עבור wholemounts הקרנית וקטעי הרשתית. נוכחותו של העפעף השלישי מסמנת את האוריינטציה האף-טמפורלית, המאפשרת לימוד התערבויות שונות של תרפיה תאית לאחר ההשתלה, ומכאן התיקוף הפיזיולוגי הממוקד החיוני להדמיה ולייצוג מדויק במחקרים כאלה.
מבוא
דיסקציה עינית היא טכניקה חשובה במחקר העיניים ואפשרה לחוקרים לגשת למקטעי העין למחקרים ממוקדים. בעבר, חוקרי עיניים הסתמכו על רקמת העין של אנשים חולים עבור המחקרים שלהם. עם זאת, המספר ההולך וגדל של זנים של מודלים מכרסמים אופתלמיים1 לאורך השנים הפחית את הצורך ברקמת עין אנושית. זני עכברים אלה אפשרו הבנה עמוקה יותר של מחלות עיניים והתערבויות. עם זאת, הם גם יצרו צורך בטכניקות חדשניות של מיקרו-דיסקציה עינית. הגודל הקטן ושטח הפעולה המוגבל מגבילים מאוד את הגישה היעילה לחלקי העין. יתר על כן, בשל הרכבה תאית הומוגנית של המשקפיים האחוריים והקדמיים, קשה לבצע התערבויות ממוקדות לאחר דיסקציה. טכניקות המיקרו-דיסקציה הנוכחיות של לייזר2 ומיק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הליך זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים של המכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. מספר האסמכתא הסידורי של האישור הוא IAEC#480/18. הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הרגולציה של הוועדה לבקרה ופיקוח על ניסויים בבעלי חיים, משרד הדיג, גידול בעלי חיים וחלב, ממשלת הודו, בפיקוח וטרינר מקצועי ב-SAF, הביטוח הלאומי.
1. הכנה
- להרחיב את העיניים מכרסם באמצעות טיפה של 0.8% tropicamide ו 5% phenylephrine פתרונות אופתלמיים בכל עין. הניחו את בעל החיים באזור חשוך למשך 30 דקות לפני ההליך.
הערה: משכך כאבים אינו נדרש מכיוון שבעל החיים מורדם מיד לאחר השלמת 30 דקות. ההסתגלות הכהה והרחבת עיני החיה מאפשרות למתבונן לבדוק קרעים ונזקי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רקמת עין/קרנית עכבר RD1 הוכנה כדי לחקור אנגיוגנזה לימפוגרפית פוטנציאלית ברקמה הקדמית/הקרנית במצב חולה. רקמת הלחמית המחוברת מהעפעף השלישי פעלה כבקרה חיובית, שכן הקרנית חסרה כלי לימפה. לצורך המחקר, רקמת הקרנית נותחה עם הלחמית ותוקנה עם 4% PFA, ולאחר מכן חלחול וחסימה. לאחר מכן הרקמה הוכתמה בנוגדן ראשוני כנגד סמן האנדותל הלימפטי (LYVE1)9. זה היה ואחריו דגירה עם נוגדן משני שכותרתו עם Alexa Fluor 488 (ירוק). תמונות מייצגות (איור 4) צולמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי במהירו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מיקרודיסקציה של העין נמצאה כמשימה קשה בשל גודלה הקטן וצורתה הכדורית של עין המכרסם, ועין המכרסם דורשת טכניקות חדשניות לטיפול יעיל8.
בשיטה המודגמת הנוכחית, גלגל העין של העכבר מתקבל עם העפעף השלישי מחובר לטיפול יעיל וקל. באמצעות העפעף השלישי, גלגל העין יכול להיות משותק לחלוטין, אשר מאפשר את הדיסקציה להמשיך בקלות עם שגיאות מינימליות. יתר על כן, נוכחותו של העפעף השלישי תוחם את הכיוון של חלקי המשנה של העין. גלגל העין נחתך, אם כן, עם העפעף השלישי כדי לקבל את המשקפיים הקדמיים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ד"ר אלקננדה מישרה, המחלקה לביולוגיה של התא ואנטומיה אנושית, אוניברסיטת קליפורניה דייוויס, ארה"ב, הכשירה אותנו בשיטה זו במכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הליבה שהתקבל מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו למכון הלאומי לאימונולוגיה, ניו דלהי. נ.ב. זכתה במלגת מחקר מטעם המחלקה לביוטכנולוגיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פרצטמול (ביוצטמול) | EG Pharmaceuticals | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| ערכת פוספטאז אלקליין (DEA) | מערכת קלינית אלמוגים, הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| מנתח אוטומטי | טוליפ, אלטו סנטרקרוז, הודו | מנתח ביוכימי Screen Maaster 3000 | לבדיקת תפקודי כבד |
| בטדין ( תמיסת פובידון-יוד) | Win-Medicare; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| ארון בטיחות ביולוגי (Class I) | קרטוס בינלאומי; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| מיקרוסקופ שדה בהיר | אולימפוס, יפן | LX51 | |
| CBA/J עכברים מולדים | מעבדת ג'קסון | מס' 000654 | |
| Cefotaxime (Taxim) | AlKem ; הזרקת | נתרן cefotaxime בהודו, ללא מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| ארה"ב | CLS431752 | ||
| קולגנאז סוג I | Gibco מאת Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| DPX Mountant | Sigma ; ארה"ב | 6522 | |
| גיליון | וילונות JSD כירורגיות, דלהי, הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| תמיסת Eosin Y, סיגמא אלכוהולית | ; HT110132 ארה"ב | ||
| הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | ||
| מערכת הרדמת גז | Ugo Basile; איטליה | 211000 | |
| גלוקוז | היימדיה, הודו | GRM077 | |
| קרם להסרת שיער (Veet) | רקיט בנקיזר, הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| תמיסת המטוקסילין, | סיגמא של מאייר; ארה"ב | MHS16 | |
| מלח נתרן הפרין | Himedia; הודו | RM554 | |
| Hyaluronidase מ-Sheep testes | Sigma ; ארה"ב | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| מזרקי אינסולין | BD ; ארה"ב | REF 303060 | |
| איזופלורן (פוראן) | Asecia Queenborough | No B506 | אינהלציה הרדמה |
| קטמין (קטמקס) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | קטמין הידרוכלוריד IP, ללא מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| מלוקסיקם (מלונקס) | אינטס פרמצבטיקה בע"מ; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| מחזיקי מחט מיקרו ישרים ומעוקלים | מרסיאן; אנגליה | BS-13-8 | |
| מחזיקי מחט מיקרו ישר & מרסיאן מעוקל | ; אנגליה | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, איטליה | MRS3500 | |
| חוט ניילון | Mighty ; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| פרפורמלדהיד | הימדיה; India | GRM 3660 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | אין מספר קטלוגי ספציפי |
| RPMI | Himedia; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| אזמל | כירורגיה גדולה; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| מספריים | ניתוחים גדולים; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| ערכת SGOT (ASAT) | מערכת קלינית אלמוגים, הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| ערכת SGPT (ALAT) | מערכת קלינית אלמוגים, הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; ארה"ב | אין מספר קטלוגי ספציפי | |
| סוכרוז | סיגמא ; ארה"ב | S0389 | |
| להב כירורגי מס' 22 | La Medcare, הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| מועצה כירורגית | מתוצרת | ללא מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| סרט לבן כירורגי | 3M הודו; הודו | 1530-1 | סרט כירורגי מיקרופור |
| תופר | Ethicon, Johnson & ג'ונסון, הודו | NW 5047 | |
| מזרקים (1 מ"ל, 26 גרם) | דיספו ואן; הודו | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | |
| גוזם (קליפר) | של פיליפס | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| בראון | אין מספר קטלוגי ספציפי (רכש מקומי) | ||
| William's E Media | Himedia; הודו | AT125 | |
| קסילזין (קסילקסין) | אימונולוגיה הודית מוגבלת | תרופות הרגעה, טרום הרדמה, משכך כאבים ומרפה שרירים |
מקורות
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
