מאמר שיטה

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

DOI:

10.3791/64439

⸱

11 בנובמבר 2022

 ,  , 
1Animal Sciences Research Center, University of Missouri, 2Universidad Nacional de Colombia, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Missouri

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנאמנות של מיוזה של ביצית היא קריטית ליצירת ביציות אופלואידיות מוכשרות מבחינה התפתחותית. ביונקים, הביצית עוברת מעצר ממושך בפרופאזה I של החטיבה המיוטית הראשונה. לאחר גיל ההתבגרות ועם חידוש המיוט, קרום הגרעין מתפרק (פירוק מעטפת הגרעין), והציר מורכב בעיקר במרכז הביצית. מיקום ציר מרכזי ראשוני חיוני להגנה מפני חיבורים חריגים של קינטוצ'ור-מיקרוטובול (MT) ואנופלואידיה. הציר הממוקם במיקום מרכזי נודד באופן רגיש לזמן לכיוון קליפת המוח, וזהו תהליך הכרחי כדי לבלוט גוף קוטבי זעיר. בתאים מיטוטיים, מיקום הציר מסתמך על האינטראקציה בין MTs אסטרליים בתיווך צנטרוזום לבין קליפת התא. להיפך, ביציות עכבר חסרות צנטרוזומים קלאסיים, ובמקום זאת, מכילות מרכזי ארגון MT אצנטריולאריים רבים (MTOCs). בשלב המטאפאזה I, לביציות עכבר יש שתי קבוצות שונות של MTOCs: (1) MTOCs המקובצים באשכולות וממוינים להרכבת קטבי ציר (MTOCs קוטביים), ו-(2) MTOCs ציטופלסמיים מטאפאזיים (mcMTOCs) שנשארים בציטופלסמה ואינם תורמים ישירות להיווצרות צירים אך ממלאים תפקיד מכריע בוויסות מיקום הציר ונדידת הציר בזמן. כאן מתוארת שיטת אבלציה בלייזר מרובת פוטונים כדי לרוקן באופן סלקטיבי mcMTOCs המסומנים באופן אנדוגני בביציות שנאספו מעכברים מדווחים Cep192-eGfp . שיטה זו תורמת להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס מיקום ציר ונדידתם בביציות של יונקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גמטות הפלואידים (זרע וביצית) מיוצרות באמצעות מיוזה, הכוללת סיבוב אחד של שכפול DNA ואחריו שתי חלוקות רצופות הנחוצות להפחתת מספר הכרומוזומים לפני ההפריה. ביונקים, במהלך חיי העובר המוקדמים, הביצית עוברת מעצר ממושך (עד גיל ההתבגרות) בשלב הדיפלוטן של פרופאזה I של החלוקה המיוטית הראשונה, שלב הנקרא שלפוחית הנבטית (GV). לאחר חידוש מיוטי, הביצית GV עוברת פירוק מעטפת גרעינית (NEBD), והציר מורכב בעיקר במרכז הביציות 1,2,3. מאוחר יותר, מונע על ידי F-actin, הציר נודד בזמן ממרכז הביציות אל קליפת המוח כדי להבטיח חלוקה אסימטרית מאוד, וכתוצאה מכך ביצה עם גוף קוטבי זעיר (PB)4,5,6.

בתאים מיטוטיים, הצנטרוזומים מורכבים מזוג צנטריולים המוקפים ברכיבי חומר פרי-צנטריולאריים (PMC), כגון פריצנטרי, γ-טובולין, Cep152 ו-Cep1927. צנטרוזומים אלה, המכילים צנטריול, תורמים לנאמנות של היווצרות ציר דו-קוטבי8. עם זאת, צנטריולים הולכים לאיבוד במהלך האוגנזה המוקדמת במינים שונים, כולל מכרסמים9. לכן, ביציות עכבר מאמצות מסלול הרכבה של ציר שאינו תלוי בצנטריול באמצעות מספר רב של מרכזי ארגון מיקרוטובולים (MT) (MTOCs)9,10. עם חידוש המיוט, ה- MTOCs הפרי-גרעיניים עוברים שלושה שלבים נפרדים של עיבוי, מתיחה ופיצול למספר רב של MTOCsקטנים יותר 11,12. לאחר מכן, ה-MTOCs המקוטעים מקובצים באשכולות וממוינים כדי לארגן ציר דו-קוטבי10,13,14. מאגר נוסף של MTOCs ממוקם בציטופלסמה במהלך NEBD. חלק מה-MTOCs הציטופלסמיים האלה נודדים ויוצרים קטבי ציר (MTOCs קוטביים, pMTOCs)10,11. לאחרונה התגלתה תת-קבוצה נוספת של MTOCs ציטופלסמיים, המכונים MTOCs ציטופלסמיים מטאפאזיים (mcMTOCs), שאינם תורמים להיווצרות מוט ציר אך נשארים בציטופלסמה של הביצית במהלך מטאפאזה I (Met I)15. דלדול mcMTOCs על ידי אבלציה לייזר מרובת פוטונים או הגדלה חריגה של מספרם על ידי עיכוב אוטופגיה טורפים מיקום ציר ונדידה ומגדילה את שכיחות האנאופלואידיה בביציות מטאפאזה II15.

באופן מעניין, mcMTOCs שונים מ- pMTOCs בהיבטים רבים15. לדוגמה, בניגוד ל-pMTOCs, שמקורם בעיקר ב-MTOCs פרי-גרעיניים, mMTOCs מקורם בקליפת הביצית. כאשר הציר עדיין במרכז הביצית, ה- mcMTOCs ממוקמים באופן אסימטרי הפוך לצד שאליו הציר נודד עבור שחול PB15. MTs דמויי אסטרל אינם יכולים להגיע לקליפת המוח בתא הביצית הגדול יחסית. לכן, ה-mcMTOCs האלה מנוקאלים MTs כדי לעגן את הציר (באמצעות MTOCs דמויי אסטרל) לקליפת המוח. ממצאים אלה מציעים מודל שבו כוח ה-MT בעל גרעין ה-mcMTOC מנטרל את הכוח המתווך F-actin שמניע את נדידת הציר לכיוון קליפת המוח. האיזון בין שני הכוחות המנוגדים הללו חיוני כדי לווסת את מיקום הציר המרכזי ואת נדידת הצירבזמן 15.

נכון להיום, כל חלבוני ה-PMC שנבדקו (פריצנטריים, g-טובולין, Cep192 ו-Aurora kinase A) מתמקמים בשני מאגרי ה-MTOC: mcMTOCs ו-pMTOCs15. לכן, אין גישה כימית או גנטית להפרעות סלקטיביות של mcMTOCs מבלי להפריע ל-pMTOCs. ניתן לעקוף מגבלות אלה על ידי התמקדות סלקטיבית ב- mcMTOCs עם אבלציה בלייזר. בין הטכנולוגיות מבוססות הלייזר שפותחו עבור מיקרואבלציה, לייזרים פמטו-שניות רב-פוטונים פועמים מראים פוטנציאל רב בשל פגיעתם המדויקת המוגבלת למישור המוקד, עומק החדירה הגבוה של אור אינפרה-אדום קרוב, והפחתת הפוטוטוקסיות והנזק התרמי לתא16,17,18. עבודה זו מתארת גישה סלקטיבית לביטול mcMTOCs בביציות עכבר באמצעות לייזר רב-פוטוני המוצמד למיקרוסקופ הפוך.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת מיזורי (הבטחת איכות לטיפול בבעלי חיים מספר 9695). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברות בנות 6-8 שבועות של Cep192-eGFP . כדי ליצור עכברי כתב Cep192-eGFP , נעשה שימוש בתיקון מונחה הומולוגיה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לשלב את הגן המדווח EGFP בגנום העכבר CF-1. כתב ה-EGFP התמזג ב-C-terminus של Cep192 (מרכיב אינטגרלי של MTOCs)15. כדי לתחזק את מושבת העכברים, נעשה שימוש בעכברי כתב Cep192-eGfp . כל בעלי החיים הוחזקו בכלובים (עד ארבע חיות / כלוב) ב 21 מעלות צלזיוס ו -55% לחות, עם מחזור אור / חושך של 12 שעות וגישה ad libitum למזון ומים.

1. אוסף ביצית עכבר

  1. הכינו את מדיום התרבית (צ'אטו, זיומק ובאביסטר, CZB19, ראו טבלת החומרים), ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה.
    הערה: ניתן לאחסן את המדיום CZB בטמפרטורה של 4 °C למשך חודש אחד (ראה קובץ משלים 1 להרכב המדיה).
  2. הוסיפו למדיום CZB גלוטמין (1 מ"מ) ומילרינון (2.5 מ"מ) (CZB + M) (ראו טבלת חומרים), והניחו אותו באינקובטור.
    הערה: מילרינון הוא מעכב פוספודיאסטראז השומר על הביציות שנעצרו בפרופזה I ומונע חידוש מיוטי20.
  3. הכן את מדיום האיסוף (מדיום חיוני מינימלי ללא ביקרבונט, MEM) המכיל 3 מ"ג/מ"ל פוליוויניל פירולידון (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (קובץ משלים 1), ומילרינון (2.5 mM) (MEM/PVP + M, ראה טבלת החומרים).
  4. הכינו את כלי האיסוף והתרבית, הכינו ארבע מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום איסוף (MEM/PVP + M) ושתי מיקרו-טיפות (100 μL) של תרבית (CZB + M) בינוניות בצלחות פטרי בקוטר 60 מ"מ ו-35 מ"מ, בהתאמה, וכסו אותן בשמן מינרלי (ראו טבלת חומרים). שמור את צלחת האיסוף על שקופית חמה יותר, והכניס את צלחת התרבית לחממה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2.
  5. יש להזריק תוך צפק 5 יחב"ל של גונדוטרופין בסרום של סוסה הרה (PMSG, ראו טבלת חומרים) לעכברות בוגרות מינית (בנות 6-8 שבועות) Cep192-eGFP 44-48 שעות לפני איסוף הביציות.
  6. להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם, לזהות ולהסיר את השחלות21, ולהעביר אותם לתוך זכוכית שעון המכילה אמצעי איסוף מראש (MEM / PVP + M) ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. מקבעים את השחלה על ידי נגיעה במזרק של 1 מ"ל בתחתית זכוכית השעון ומנקבים אותו מספר פעמים (~ 40 פעמים לכל שחלה) באמצעות מחטי תפירה המחוברות יחד כדי לשחרר את הביציות למדיום.
  8. באמצעות פיפט העברת פלסטיק, מעבירים את כל המדיום המכיל את קומפלקסי הקומולוס-ביצית (COCs) משלב 1.7 לתוך צלחת פטרי פלסטיק ריקה בקוטר 100 מ"מ.
  9. תחת סטריאומיקרוסקופ, אספו את ה-COCs באמצעות פיפט זכוכית פסטר, והעבירו אותם לצלחת האיסוף המכילה MEM/PVP + M.
  10. באמצעות פיפט זכוכית פסטר צר (בקוטר של כ-100 מיקרומטר), מפרקים את הביציות באופן מכני על ידי פיפטציה עדינה שחוזרת על עצמה, ולאחר מכן מעבירים ושוטפים אותן בארבע טיפות מיקרו של (100 μL) MEM/PVP + M (צלחת האיסוף) לפני העברתן לצלחת התרבית CZB + M.
  11. לדגום את הביציות denuded במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% של CO2 באוויר.

2. מיקרו הזרקת ביציות

  1. הכניסו טיפה של 250 μL של MEM/PVP + M לתוך מכסה צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ"מ, וכסו אותה בשמן מינרלי.
    הערה: מכסה צלחת פטרי כולל שפה תחתונה המספקת יותר מקום להתאמת המיקרומניפולטור.
  2. הפעל את מערכת המיקרו-הזרקות (ראה טבלת החומרים).
  3. מניחים את צלחת המיקרו-הזרקה על שלב ההתחממות (37 מעלות צלזיוס) של המיקרוסקופ.
  4. טען את מחט ההזרקה עם 0.5 μL של mCh-Cep192cRNA באמצעות קצוות פיפטה microloader (ראה טבלת חומרים), והצמיד את מחט ההזרקה למיקרומניפולטור.
  5. מעבירים את הביציות המנודות (שלב 1.11) למיקרודרופ 250 μL (שלב 2.1).
  6. תחת עדשה אובייקטיבית של 20x או 40x, התאימו את המיקום ואת המיקוד של ההזרקה ומחטי ההחזקה בהתאם לתנוחת הביציות (איור 1).
  7. הגדר את יחידת המיקרו-הזרקה, והגדר את לחץ ההזרקה (p i), לחץ הפיצוי (pc) וזמן ההזרקה (ti) כך שיוכלו להזריק 5-10 pl של mCh-Cep192 cRNA (כדי לסמן באופן אקסוגני את ה- MTOCs).
  8. בזהירות להזריק את הביציות מבלי לגעת בגרעין.
  9. לאחר הזרקת כל הביציות, שטפו אותן בשלוש טיפות מיקרו של CZB + M, העבירו אותן לצלחת התרבית (CZB + M), ודגרו אותן במשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ביטוי mCh-Cep192.

3. הבשלת ביציות

  1. הכן את מדיום ההבשלה על ידי הוספת גלוטמין (1 מ"מ) למדיום CZB בשיווי משקל מראש באינקובטור עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפחות.
  2. מכינים שתי מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום ההבשלה בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ, ומכסים אותן בשמן מינרלי (צלחת הבשלה).
  3. יש לשטוף לפחות שלוש פעמים במיקרו-טיפות CZB נטולות 100 μL כדי להסיר לחלוטין את המילרינון ולאפשר חידוש מיוטי.
  4. מעבירים את הביציות לצלחת ההבשלה, ודוגרים אותן במשך 5 שעות (שלב Prometaphase I) באינקובטור לח עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

4. הכנת ביציות לאבלציה והדמיה

  1. מעבירים את הביציות של Prometaphase I (שלב 3.4) לצלחת תרבית עם תחתית זכוכית המכילה 100 μL של מדיום הבשלה (שלב 3.1) מכוסה בשמן מינרלי.

5. הכנת מיקרוסקופ לאבלציה

  1. לפחות 30 דקות לפני אבלציה, הפעל את בקר הטמפרטורה של חממת הבמה (ראה טבלת חומרים) והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס.
  2. הפעל את בקר CO 2 והגדר אותו ל- 5% CO2.
  3. בחרו מטרה אפוכרומטית של טבילת שמן פי 40, ומרחו טיפה קטנה משמן הטבילה.
  4. הרכיבו את צלחת התרבית בעלת תחתית הזכוכית עם הביציות על אינקובטור עליון, וכיסו את האינקובטור במכסה גז.
  5. בתוכנת רכישת התמונה (ראו טבלת חומרים), בחרו אפשרות המאפשרת שמירה של מיקומי במה מרובים (לדוגמה, "הגדר סימן ומצא ניסוי"). באמצעות תאורת אור המועברת, מרכז על הביציות הבודדות ושמור את מיקומן.
  6. בתוכנת רכישת התמונות, בחר את מצב הסריקה XYZ , הגדר את פורמט התמונה ל- 256 x 256 פיקסלים, הגדר את גורם הזום ל- 2.5x - 3.0x ובחר תדר סריקה של 600 הרץ. זה מתאים לזמן השהייה של פיקסל של כ-1.6 μs.
  7. הגדר קו לייזר עירור של 488 ננומטר בכ-10% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-4.0 מיקרו-וואט ברמת הדגימה) (ראו טבלת חומרים), והשתמש ברוחב פס ספקטרלי של 500-550 ננומטר כדי לצפות באות GFP מה-MTOCs. לתצפית סימולטנית של פלואורסצנציה מ- Cep192 המתויג mCherry, הגדר קו לייזר עירור של 585 ננומטר בכ-8% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-10.7 μW ברמת הדגימה), והשתמש בגלאי אחר שנקבע לרוחב פס ספקטרלי של 595-645 ננומטר.
    הערה: כדאי להשתמש בגלאי האור המועבר (TLD) של המיקרוסקופ הקונפוקלי לגילוי גבולות ביציות בו-זמנית.
  8. באמצעות מצב סריקה חי ושליטה ידנית של כונן z, מסך את הביצית עבור MTOCs.
  9. לאחר זיהוי mcMTOC, צייר סביבו אזור מרובע של עניין (ROI).

6. אבלציה של mcMTOCs

  1. הגדר לייזר פמטו-שניות לאורך גל של 740 ננומטר.
    הערה: ניתן לשנות את אורך גל הלייזר בהתאם למיקרוסקופ ולתנאי הלייזר.
  2. השתמש במודולטור האלקטרו-אופטי של המיקרוסקופ הרב-פוטוני (ראו טבלת חומרים) כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ל-70%-80%, המתאימה להספק של 60-70 mW במישור הדגימה.
    הערה: אם הלייזר מצויד במפצה דופק femtosecond, השתמש בו כדי לתקן פיזור עיכוב קבוצתי (GDD). תיקון GDD מפחית את כמות כוח הלייזר הנדרשת לאבלציה יעילה של mcMTOC וממזער את הנזק לביצית. בקרת GDD משולבת בדרך כלל עם תוכנת רכישת התמונה של מיקרוסקופים מסחריים מרובי פוטונים.
  3. השתמש באותו פורמט תמונה, מקדם זום ותדירות סריקה כמו בשלב 5.6. הגדר את הפרמטרים לממוצע של קו ומסגרת ל- 1.
  4. לחץ על כפתור הסריקה בתוכנה כדי לבצע את האבלציה של mcMTOC על ידי ביצוע סריקת לייזר אחת של החזר ההשקעה שנבחר.
  5. השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לסקור את תוצאות האבלציה על-ידי השוואת התמונות של המבנים בעלי תווית GFP שצולמו לפני ואחרי החשיפה ללייזר מרובה פוטונים. אם האבלציה מצליחה, עוצמת הפלואורסצנציה של GFP ב-mcMTOC הממוקד יורדת לרמות שנצפו ברקע.
  6. אם נותרו כמה קטעים ממבנה תיוג GFP, חזור על שלב 6.4 פעם אחת או יותר על-ידי התמקדות במישורי z שונים של ה-mcMTOC.
  7. השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לאמת את יעילות האבלציה על-ידי אובדן מוחלט של אותות mCherry הקשורים ל-mcMTOC (mCh-Cep192).
  8. חזור על שלב 5.8 לשלב 6.7 עד שכל ה- MTOCs של ביצית (במישורי מוקד שונים) יתבטלו.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרו-הזרקה mCh-Cep192 כאסטרטגיה לאישור דלדול mcMTOC בעקבות חשיפה ללייזר מרובה פוטונים ולא כולל את האפשרות שאובדן פלואורסצנציה של GFP נגרם על ידי הלבנת תמונות GFP. עם זאת, המיקרו-הזרקה של בדיקה זו היא אופציונלית ואינה נדרשת להליך האבלציה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבלציה בלייזר מרובה פוטונים מספקת שיטה יעילה לפירוק סלקטיבי של מבנים תוך-תאיים. המחקר הנוכחי השתמש באבלציה של לייזר רב-פוטוני כדי לרוקן mcMTOCs בביציות עכבר באופן סלקטיבי. אבלציה בלייזר דלדלה את ה-mcMTOCs ביעילות, כפי שמראה ההפחתה בפלואורסצנציה האנדוגנית של GFP ב-mcMTOCs הממוקדים לרמה דומה לרקע. mCh-Cep192 אקסוגני ב-mcMTOCs הממוקדים בוטל גם הוא בעקבות אבלציה בלייזר. אבלציה בלייזר של mcMTOCs צריכה להתבצע במישורי מוקד שונים בתוך הביצית (היכן ש-mcMTOCs ממוקמים, איור 2) כדי להבטיח שכל ה-mcMTOCs בתוך הביצית יתרוקנו (איור 3).

figure-results-1
איור 1: מיקרו-הזרקת ביציות. מיקרו-הזרקה של ביצית עכבר שנעצרה על ידי Prophase I עם mCh-Cep192 cRNA. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: דלדול של mcMTOCs בביציות עכבר. תמונות מייצגות של מישורי מוקד בודדים. הריבועים הלבנים מציינים mcMTOC לפני ואחרי אבלציה בלייזר מרובה פוטונים. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: דלדול של mcMTOCs במישורי מוקד שונים בביצית עכבר. תמונות הקרנה מקסימליות מייצגות של ביצית עכבר אבלציה של mcMTOC. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: הרכבים של צ'אטו, זיומק ובאביסטר (CZB) ומדיום חיוני מינימלי ללא ביקרבונט (MEM/PVP). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיימות שיטות שונות להפרעה למבנים הקשורים לשלד הציטוסקלטון בתוך תאים22,23,24,25. עם זאת, מציאת טכניקות יעילות כדי לשבש באופן סלקטיבי את המבנה הממוקד מבלי לפגוע בכדאיות התא היא מאתגרת. שיטת האבלציה בלייזר רב-פוטונים המוצגת כאן היא אסטרטגיה יעילה להשראת הפרעה מכנית סלקטיבית ל-mcMTOCs בתוך הביצית מבלי לשנות את כדאיות הביציות.

נעשה שימוש נרחב באבלציה בלייזר כדי להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים בהפרדת כרומוזומים במהלך מיטוזהומיוזה 22,23,26,27. בשל גודלם הגדול יחסית (קוטר >80 מ"מ) של ביציות יונקים בהשוואה לתאים סומטיים28, האבלציה של המבנים התוך-תאיים שלהם מהווה אתגר. יתר על כן, נפח mcMTOC הממוצע בביציות metaphase I הוא ~ 20 μm15, המייצג אתגר נוסף. יש לאמץ שיטה יעילה המציעה חדירה עמוקה יותר לרקמות כדי להתגבר על אתגרים אלה. היתרון העיקרי של שימוש בלייזר מרובה פוטונים לאבלציה הוא יכולתו להגיע עמוק יותר לתוך התא תוך מזעור ההשפעות מחוץ למטרה29.

כדי לוודא את היעילות והיעילות של שיטת האבלציה בלייזר כדי לרוקן את המבנה הממוקד, מומלץ להשתמש בחלבון המסומן בפלואורסצנטיות כדי לזהות את המבנה הממוקד לאורך זמן (לפני ואחרי אבלציה)23. חשוב לשים לב שאבלציה בלייזר מדלדלת את כל ה-mcMTOC כמבנה, ולמרות ש-mcMTOCs קטנים יותר דורשים חשיפה אחת בלבד ללייזר כדי להתרוקן, מק-MTOCs גדולים יותר עשויים לדרוש יותר מחשיפה אחת ללייזר במישורי מוקד שונים. מומלץ גם לתקן ולתייג תת-קבוצה של ביציות בקרה ו- mcMTOC-ablated עם סמן MTOC (כגון γ-טובולין, פריצנטרי או Cep192) כדי לאשר את היעילות של אבלציה mcMTOC עוד יותר. בביציות בקרה, אזורים בציטופלסמה הסמוכים ל-mcMTOCs אך אינם חופפים אליהם ייחשפו ללייזר.

ניסוי זה דורש מספר אבלציות של mcMTOC תוך כדי תנועה בין מישורי מוקד שונים בתוך הביציות. לכן, מומלץ מאוד לתרגל טכניקה זו מספר פעמים לפני ביצוע הניסוי כדי למזער את זמן הניסוי, ובכך להגדיל את הכדאיות של הביציות. יתר על כן, חשוב להשתמש בכוח הלייזר המינימלי שמספיק כדי לרוקן את mcMTOCs מבלי להשפיע על כדאיות הביציות.

טכניקה זו יש כמה מגבלות. ראשית, מיקרוסקופים קונפוקליים מרובי פוטונים יקרים יחסית למיקרוסקופים קונפוקליים רגילים. שנית, הפרעה לכל ה-mcMTOCs במישורי מוקד שונים גוזלת זמן רב יותר מאשר הפרעות כימיות או גנטיות. שלישית, פרוטוקול זה דורש מיומנויות טכניות כדי לבטל את כל mcMTOCs בזמן הקצר ביותר האפשרי. עם זאת, לאחר השליטה, השימוש בלייזר מרובה פוטונים מספק אסטרטגיה מצוינת לשבש כמה מבנים תוך תאיים בביציות עכבר, כולל mcMTOCs, תורם להבנת המנגנונים המולקולריים המווסתים את מיקום הציר ואת נדידתו בזמן בביציות יונקים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת בלבואלה על עזרתם ודיונים חשובים. המחברים מודים למלינה שו על ששיתפה בחביבות את מבנה mCherry-Cep192. מחקר זה נתמך על ידי R35GM142537 (NIGMS, NIH) ל-AZB.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4 בקיר דק GL 1.0 OD/.75 IDמכשיר דיוק עולמי מחטי הזרקה TW100F-4nbsp;
זכוכית בורוסיליקט פישרברנד Cat# 13-678-20D
נימי זכוכית בורוסיליקט מכשיר דיוק עולמי Cat# TW100-6מחזיק מחטים 
אלבומין בסרום בקר MilliporeSigma Cat# A4503
חממת כלוב למיקרוסקופ Leica DMI6000 Bשירותי הדמיית חיים GmbH
סידן כלרוד דיהידראטMilliporeSigma Cat# C7902
בקר CO2 בקר Pecon# 0506.000
CO<>sub2 כיסוי HPPecon# 0506.020
DL-חומצה לקטית MilliporeSigma Cat# L7900
DMi8לייקה מיקרוסקופ לא ישים 
EDTAMilliporeSigma Cat# E5134
Femtojet 4iEppendorf לאישים&מזרק זעיר 
Femtotips Microloaderפישר מדעי 
Gentamicin MilliporeSigma Cat# G1272
גנטמיצין MilliporeSigma Cat# 1272
צלחת תחתית זכוכית תאגיד מאט טקCat# P35G-1.0-20-C 
Hepes MilliporeSigma Cat# H3784
Hepes נתרן מלחMilliporeSigmaCat # H3784
Hera Cell vios 160iThermo לא ישים CO<תת>2 אינקובטור 
Leica TCP SP8 מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר ספקטרלי עם מעמד הפוך DMI6000 BLeica Microsystems, IncN/A 
ל-גלוטמין MilliporeSigmaCat#G8540
מגנזיום גופרתי דיהידרטMilliporeSigma Cat# M7774
MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond לייזרספקטרה-פיזיקהN/A
mCH-Cep192 cRNAN/A
נשר בינוני חיוני בינוני - MEMMilliporeSigmaCat #M0258
MilrinoneMilliporeSigmaCat# M4659
שמן מינרליMilliporeSigmaCat# M5310
מינימום עיט בינוני חיוני (MEM)MilliporeSigma Cat# M0268 - עכבר 1 ליטר
: כתב Cep192-eGFP CF-1N/A
צלחת פטרי (100 מ"מ)Fisherbrand צלחת פטרי FB0875712
(35 מ"מ)קורנינג צלחת פטרי 430165
(60 מ"מ)בז חתול# 351007
פנול אדום MilliporeSigma Cat# P5530
פוליוויניל פירולידוןמיליפורסיגמאחתול# P2307
פוליוויניל פירולידון (PVP)מיליפורסיגמה Cat# P2307
אשלגן כלורי MilliporeSigma Cat# P5405
אשלגן פוספט מונובסיסי MilliporeSigma Cat# P5655
סוסה בהריון&אקוטית; גונדוטרופין בסרום לי ביו-סולושנסCat# 493-10-10 
חומצה פירובית MilliporeSigma Cat# P4562
חומצה פירובית MilliporeSigma Cat# P4562
מחטי תפירה D.M.CN/AN° 5*16 מחטים 
נתרן ביקרבונט MilliporeSigma Cat# S5761
נתרן כלורי MilliporeSigma Cat# S5886
הכנסת חימום במה עליונה PPecon# 0426.300
Sterezoom S9iLeica סטריאומיקרוסקופ לא ישים 
מזרק 1 מ"לחברת BD חתול# 309597
טאורין MilliporeSigma בקר טמפרטורה Cat# T0625
Tempcontrol 37-2 digitalPecon# 0503.000
בקר טמפרטורת הקובייה לחממתהכלוב Life Imaging Services GmbH
&E5242956003Cat#Cat#

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
  2. Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  4. Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
  5. Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
  6. Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
  7. Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
  8. Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
  9. Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
  10. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  11. Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217(2015).
  12. Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
  13. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  14. Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
  15. Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
  16. Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
  17. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
  18. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  19. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
  20. Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104(2021).
  22. Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
  23. Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  24. Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
  25. Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
  26. Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
  27. Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
  28. Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MTOCsMTOCsCep192 eGfp

מאמרים קשורים