Method Article

פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.)

DOI:

10.3791/64445

⸱

September 7th, 2022

 ,  , 
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרעי העגבנייה הם מודל חשוב לחקר גנטיקה וביולוגיה התפתחותית במהלך רבייה של צמחים. פרוטוקול זה שימושי לניקוי זרעי עגבניות בשלבי התפתחות שונים כדי לבחון את המבנה העוברי העדין יותר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עגבניות (Solanum lycopersicum L.) הוא אחד מגידולי המזומנים העיקריים בעולם. זרעי העגבנייה הם מודל חשוב לחקר גנטיקה וביולוגיה התפתחותית במהלך רבייה של צמחים. הדמיה של מבנה עוברי עדין יותר בתוך זרע עגבנייה נפגעת לעתים קרובות על ידי רירית ציפוי זרעים, כסות רב-שכבתית ואנדוספרם בעל דופן עבה, אשר צריך להיפתר על ידי חתך הטבעה מייגע. חלופה פשוטה יותר היא להשתמש בטכניקות ניקוי רקמות שהופכות את הזרע לכמעט שקוף באמצעות חומרים כימיים. למרות שהליכי ניקוי קונבנציונליים מאפשרים תובנה עמוקה לגבי זרעים קטנים יותר עם שכבת זרעים דקה יותר, ניקוי זרעי עגבניות ממשיך להיות מאתגר מבחינה טכנית, במיוחד בשלבי ההתפתחות המאוחרים.

מוצג כאן פרוטוקול ניקוי מהיר וחוסך עבודה לצפייה בהתפתחות זרעי עגבניות בין 3 ל -23 ימים לאחר הפריחה כאשר המורפולוגיה העוברית כמעט הושלמה. שיטה זו משלבת תמיסת ניקוי מבוססת כלור הידרט הנמצאת בשימוש נרחב בערבידופסיס עם שינויים אחרים, כולל השמטת קיבוע פורמלין-אצטו-אלכוהול (FAA), הוספת טיפול בנתרן היפוכלוריט בזרעים, הסרת רירית שכבת הזרעים המרוככת, וטיפול בשטיפה ואקום. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לניקוי יעיל של זרעי עגבניות בשלבי התפתחות שונים והיא שימושית במעקב מלא אחר התהליך ההתפתחותי של זרעים מוטנטיים ברזולוציה מרחבית טובה. פרוטוקול ניקוי זה עשוי להיות מיושם גם על הדמיה עמוקה של מינים חשובים מסחריים אחרים בסולניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עגבניות (S. lycopersicum L.) הוא אחד מגידולי הירקות החשובים ביותר ברחבי העולם, עם תפוקה של 186.8 מיליון טונות של פירות בשרניים מ 5.1 מיליון דונם בשנת 20201. הוא שייך למשפחת Solanaceae הגדולה עם כ-2,716 מינים2, כולל גידולים רבים בעלי חשיבות מסחרית כגון חצילים, פלפלים, תפוחי אדמה וטבק. העגבנייה המעובדת היא מין דיפלואידי (2n = 2x = 24) עם גודל גנום של כ 900 Mb3. במשך זמן רב, נעשה מאמץ רב לקראת ביות עגבניות ורבייה על ידי בחירת תכונות רצויות מסולנום פראי spp. יש יותר מ-5,000 עגבניות במרכז המשאבים לגנטיקה של עגבניות ויותר מ-80,000 נבטים של עגבניות מאוחסנים ברחבי העולם....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פתרונות

  1. הכינו את ה-FAA על ידי הוספת 2.5 מ"ל של 37% פורמלדהיד, 2.5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית ו-45 מ"ל של 70% אתנול בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. מערבולת ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס. יש להכין את FAA באופן קבוע ממש לפני השימוש.
    אזהרה: 37% פורמלדהיד הוא קורוזיבי ועלול להיות מסרטן אם נחשף או נשאף. יש לבצע את הקיבעון במכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים.
  2. הכינו תמיסת ניקוי על ידי הוספת 5 מ"ל של 100% גליצרול, 40 גרם כלור הידרט ו-10 מ"ל מים מזוקקים בבקבוק זכוכית של 100 מ"ל עטוף בנייר כסף. יש להמיס באמצעות מערבל מגנטי למשך לילה בטמפרטורת החדר. הפתרון מוכן יכול להיות מאוחסן ב 4 °C במשך עד 6 חודשים.
    אזהרה: כלורל הידרט הוא מס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר זרעי עגבניות נוקו בשיטה קונבנציונלית כמו בערבידופסיס, תאי אנדוספרם צפופים חסמו את ההדמיה של עוברי עגבניות מוקדמים ב-3 DAF ו-6 DAF (איור 3A,B). ככל שהנפח הכולל של העובר גדל, בקושי ניתן היה להבחין בעובר כדורי ב-9 DAF (איור 3C). עם זאת, ככל שגודל הזרע המשיך לגדול, החדירות שלו ירדה, וכתוצאה מכך נוצר עובר לב מטושטש ב-12 DAF (איור 3D). מ-13 DAF ואילך, ריר הזרעים ושכבת הזרעים נעשו בהדרגה צפופים יותר, מה שמנע .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהשוואה לחיתוך מכני, טכנולוגיית הסליקה מועילה יותר להדמיה תלת מימדית מכיוון שהיא שומרת על שלמות רקמות הצמח או איברים16. פרוטוקולי ניקוי קונבנציונליים מוגבלים לעתים קרובות לדגימות קטנות בשל חדירה קלה יותר של תמיסות כימיות. זרעי עגבניות הם דגימה בעייתית לניקוי רקמות מכיוון שהם גדולים בערך פי 70 מזרע ערבידופסיס בגודלם ויש להם מחסומי חדירות רבים יותר. ציפוי הזרעים של Arabidopsis מורכב מארבע עד חמש שכבות תאים חיים שמקורם בכסות החיצונית ובכסות הפנימית24. עם זאת,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר ג'יה לה ולד"ר שיופן סונג על הצעותיהם המועילות למיקרוסקופיה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות ולשיטת הניקוי הקונבנציונלית, בהתאמה. מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31870299) והאגודה לקידום חדשנות לנוער של האקדמיה הסינית למדעים. איור 2 נוצר עם BioRender.com.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 ומיקרו; פיפטה LגילסוןFA10006M
1,000 ומיקרו; קצות פיפטהL קורנינגT-1000-B
צינור צנטריפוגה 2 מ"לAxygenMCT-200-C
37% פורמלדהידDAMAO685-2013
5,000 ומיקרו; L פיפטהאפנדורף3120000275
5,000 ומיקרו; קצות פיפטהL biosharpBS-5000-TL
צינור צנטריפוגה 50 מ"לקורנינג430829
אתנול מוחלטBOYUAN678-2002
בקבוק זכוכיתפישרFB800-100
כלורל הידראטמריירM13315-100G
CoverslipLeica384200
מיקרוסקופ DICZeissAxio Imager A110x, 20x ו-40x הגדלה
חומר חיטויQIKELONGAN17-9185
מחט ניתוחBioroyee17-9140
אדמת פרחים מזינהמלקחיים FANGJIE
HAIOU4-94
חומצה אצטית קרחוניתBOYUAN676-2007
גליצרולSolarbioG8190
מערבל מגנטיIKARET בסיסי
מיקרו-טוםעגבניות גנטיקה מרכז משאביםLA3911
שייקר אורביטליQILINBEIERQB-206
מצע זריעהPINDSTRUPLV713/018-LV252הקרנה: 0-10 מ"מ
שקופית קעורה אחתHUABODEYI
שקופיותLeica3800381
סטריאומיקרוסקופLeicaS8 APO1x עד 4x הגדלה
רדיד פחZAOWUFANG613
Tween 20SigmaP1379
משאבת ואקוםSHIDINGSHB-III
מד מערבולתSilogexMX-S
HBDY1895

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tomato Seed ClearingSeed DevelopmentTissue ClearingSodium Hypochlorite TreatmentSeed Coat MucilageEmbryo VisualizationDifferential Interference ContrastVacuum TreatmentEndosperm CellsSolanum Lycopersicum

Related Articles