מאמר שיטה

תא גמיש להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64449

⸱

31 באוגוסט 2022

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Binghamton University, State University of New York

במאמר זה

סיכום

אנו מדווחים על תא סביבתי גמיש ומתקדם להדמיה בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה זקוף עם זיהוי אותות משודרים. טיפות שומנים צולמו בתאי SKOV3 שטופלו בחומצה אולאית למשך עד 24 שעות במרווח זמן של 3 דקות.

תקציר

מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (SRS) הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות. דימות תאים חיים עם SRS הוכח עבור יישומים ביולוגיים וביו-רפואיים רבים. עם זאת, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. מיקרוסקופ SRS משתמש לעתים קרובות ביעד טבילה במים עם צמצם מספרי גבוה (NA) ובמעבה טבילת שמן NA גבוה כדי להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה. במקרה זה, הפער בין המטרה לבין המעבה הוא רק כמה מילימטרים. לכן, רוב התאים הסביבתיים המסחריים אינם יכולים לשמש להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול עם כיסוי זכוכית קשיח. מאמר זה מתאר את התכנון והייצור של תא גמיש שניתן להשתמש בו להדמיית תאים חיים בהילוך מהיר עם זיהוי אותות SRS המשודרים במסגרת מיקרוסקופ זקוף. הגמישות של החדר מושגת באמצעות חומר רך - סרט גומי טבעי דק. ניתן להוסיף בקלות את המארז החדש ואת עיצוב התא למערך הדמיה SRS קיים. הבדיקות והתוצאות הראשוניות מראות כי מערכת התא הגמישה מאפשרת הדמיית SRS יציבה, ארוכת טווח ובהילוך מהיר של תאים חיים, אשר תוכל לשמש ליישומי הדמיה ביולוגית שונים בעתיד.

מבוא

מיקרוסקופ אופטי משמש להתבוננות במיקרו-מבנים של דגימות. הדמיה אופטית היא מהירה, פחות פולשנית ופחות הרסנית מטכנולוגיות אחרות1. דימות תאים חיים עם מיקרוסקופ אופטי פותח כדי ללכוד את הדינמיקה של תאים חיים בתרבית במשך תקופה ארוכה2. סוגים שונים של ניגודים אופטיים מספקים מידע ברור על דגימות ביולוגיות. לדוגמה, מיקרוסקופ פאזה אופטי מראה את ההבדל הדק במדדי השבירה על פני מדגם3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נמצא בשימוש נרחב כדי לדמיין ביומולקולות ספציפיות או אברונים תאיים. עם זאת, ספקטרום העירור והפליטה בפס רחב של פלואורסצנטיות גורם בדרך כלל לחפיפה ספקטרלית כאשר מתבצעת הדמיה מרובת צבעים4. מולקולות פלואורסצנטיות רגישות לאור וניתן להלבין אותן לאחר חשיפה תקופתית ארוכת טווח לאור. בנוסף, תיוג פלואורסצנטי עשוי לשנות את הפיזור הביולוגי של המולקולות בתאים5. מיקרוסקופ SRS הוא טכנולוגיית הדמיה כימית ללא תוויות6. הניגודיות של SRS מסתמכת על מעבר רטט של קשרים כימיים ספציפיים. תדירות הרטט של קשר כימי מציגה לעתים קרובות רוחב פס ספקטרלי צר, מה שהופך את זה אפשרי לצלם רצועות ראמאן מרובות באותן דגימות7. מיקרוסקופ SRS הוא כלי ייחודי להדמיית תאים חיים, המספק ניגודים כימיים מרובים באופן נטול תוויות8.

בעוד שהדמיית SRS של תאים לא מוכתמים שימשה במחקרים רבים, הדמיית SRS ארוכת טווח בהילוך מהיר של תאים חיים לא אומצה באופן נרחב. אחת הסיבות לכך היא שלא ניתן להשתמש ישירות בתאים פתוחים מסחריים להדמיית SRS בגלל עוביים הגדול 9,10,11,12. תאים אלה עם מכסה זכוכית מתוכננים בעיקר עבור הדמיה של שדה בהיר או פלואורסצנטי באמצעות מטרת NA גבוהה אחת עם סכימת זיהוי לאחור. עם זאת, הדמיית SRS מעדיפה גילוי משודר הן באמצעות מטרת NA גבוהה והן באמצעות מעבה NA גבוה, אשר משאיר רק מרווח קצר מאוד (בדרך כלל כמה מילימטרים) בין המטרה לבין המעבה. כדי להתגבר על בעיה זו, תכננו תא גמיש באמצעות חומר רך כדי לאפשר הדמיית SRS בהילוך מהיר של תאים חיים באמצעות מסגרת מיקרוסקופ זקוף. בתכנון זה, מטרת טבילת המים הייתה סגורה בתא הרך ויכולה לנוע בחופשיות בתלת מימד למטרות מיקוד והדמיה.

הטמפרטורה האופטימלית לגידול רוב תאי היונקים היא 37 מעלות צלזיוס, בעוד שטמפרטורת החדר תמיד נמוכה ב -10 מעלות מכך. טמפרטורה גבוהה או נמוכה מ 37 °C יש השפעה דרמטית על קצב צמיחת התאים13. לכן, בקרת טמפרטורה של סביבת תרבית התא נדרשת במערכת דימות של תאים חיים. ידוע כי חוסר יציבות טמפרטורה יוביל לבעיות מיקוד במהלך הדמיה ארוכת טווח14. כדי להשיג סביבה יציבה של 37°C, בנינו תא מארז גדול שיכסה את כל מסגרת המיקרוסקופ, כולל שכבת בידוד תרמי מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בתוך תא בקרת הטמפרטורה הגדול, התא הקטן והגמיש עוזר לשמור במדויק על הלחות הפיזיולוגית ועל רמת החומציות באמצעות זרימת האוויר המווסתת בתוספת 5% CO 2 (איור 2). הטמפרטורה והלחות של התאים נמדדו כדי לאשר שהתכנון הדו-תאי סיפק את תנאי תרבית התאים האופטימליים לצמיחת תאים בהדמיית SRS תקופתית ארוכת טווח (איור 3). לאחר מכן הדגמנו את היישום של המערכת עבור דימות בהילוך מהיר ומעקב אחר טיפות שומנים (LDs) בתאי סרטן SKOV3 (איור 4, איור 5 ואיור 6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. בניית המתחם הסביבתי במיקרוסקופ

הערה: המארז הסביבתי הגדול הזה של המיקרוסקופ משמש לשליטה בטמפרטורה של גוף המיקרוסקופ וסביבת ההדמיה שיש לייצב ב-37°C (איור 1A).

  1. סמן את מיקומי כפות הרגליים של מסגרת המיקרוסקופ SRS ואת השלב הממונע באמצעות עט סמן על השולחן האופטי. הרכיבו שתי דיאפרגמות איריס מול סורק הגלוונומטר של המיקרוסקופ והתכווננו כך שהמשאבה וקרני הלייזר של סטוקס יעברו דרך מרכז דיאפרגמת הקשתית.
  2. הסר את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה מהטבלה האופטית.
  3. הניחו את יריעת גומי הסיליקון (גודל: 31X29 אינץ', עובי: 1/8 אינץ') על השולחן האופטי (איור 1B).
  4. חותכים את גומי הסיליקון לאורך הסימנים באמצעות סכין, מסירים חתיכות גומי קטנות ומניחים את יריעות הקרמיקה המרובעות MICA (גודל: 6X6 אינץ', עובי: 1/4 אינץ') באותם מיקומים.
    הערה: MICA קרמי הוא חומר קל למכונה15. זה קשה כמו אלומיניום אבל הוא מבודד תרמי מעולה. יריעות קרמיות MICA שימשו לעצירת מעבר חום מהמסגרת והבמה של מיקרוסקופ המתכת אל השולחן האופטי מפלדת אל-חלד. יש לקדוח מספר חורי מעבר ביריעות MICA כדי לאפשר שימוש ב-1/4-20 ברגים להרכבת רגלי המסגרת והבמה.
  5. הזיזו את מסגרת המיקרוסקופ ואת הבמה בחזרה לשולחן האופטי ויישרו בזהירות את כפות הרגליים על יריעות הקרמיקה של MICA לאורך קווי הסמן. השתמש 1/4-20 ברגים כדי להרכיב את המסגרת ואת הבמה על השולחן.
  6. יישר מחדש את הנתיב האופטי SRS. כוונן את תושבות המראה של מראה 1 ומראה 2 כדי לגרום לקרן הלייזר לעבור דרך המרכז של שתי דיאפרגמות הקשתית המותקנות מראש (איור 2).
    הערה: פרטים טכניים של מיקרוסקופ SRS שנבנה במעבדה ושימש לעבודת ההדמיה הנוכחית של תאים חיים מתוארים קודם לכן16. רוחב הדופק של המשאבה וקורות סטוקס הוא ~ 3-4 ps עם פיזור מוט זכוכית. המערכת נשלטת באמצעות תוכנת ScanImage17 .
  7. על גבי בסיס בידוד תרמי זה, הרכיבו את המארז הסביבתי כדי לכסות את כל מסגרת המיקרוסקופ באמצעות חמש חתיכות של יריעות פוליקרבונט גדולות (גודל: 31 x 29 x 28 אינץ ', עובי: 0.25 אינץ ').
    הערה: גודל קופסת המארז נקבע בהתבסס על מידות מסגרת המיקרוסקופ והבמה. יהיה צורך להסיר את הלוח הקדמי של קופסת מארז המיקרוסקופ באופן זמני כדי להתקין את התא הגמיש ולטעון את צלחת תרבית התא.
    1. כדי להרכיב את המארז, בצע עבודות עיבוד פשוטות, כולל חיתוך, קידוח והקשה על חורי בורג בכל קצה של יריעות הפוליקרבונט. חתכו שני חורים גדולים בקוטר של 2.6 אינץ 'בצד ימין ובצד שמאל של המארז כך שיתאימו לצינורות הכניסה והיציאה, בהתאמה. חותכים חור קטן בקוטר של 5 מ"מ על היריעה האחורית כדי לאפשר לקרני הלייזר להיכנס למארז.
  8. אטמו את הקצוות והממשקים של הקופסה באמצעות נייר אלומיניום.
  9. חבר את צינור התעלה הגמיש לכניסה וליציאות היציאה של תיבת המארז כדי לאפשר זרימת אוויר חם במחזור הנשאב ונשלט על ידי מודול המחמם. מקם את החיישן התרמי של מודול החימום בתא הגמיש שבו התאים מתורבתים ומצולמים. הגדר את טמפרטורת היעד על 37 °C (77 °F).
    הערה: ניתן להשתמש בדיפיוזר כדי לקבל פיזור זרימת אוויר אחיד יותר במתחם הסביבתי.

2. הרכבת התא הגמיש

  1. הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה 1 (חומר: אלומיניום 6061) על האף של המטרה באמצעות שלושה ברגים קבועים (איור 2).
  2. הרכיבו את פיסת האלומיניום הגלילית החלולה 2 במכונה למחזיק הדגימה באמצעות ארבעה ברגים 1/4-20 (איור 2).
    הערה: יש לשנות את מחזיק הדגימה כך שיחזיק את צלחת תרבית התאים בתחתית הזכוכית בקוטר 50 מ"מ. קדח חור במרכז מחזיק הדגימה באמצעות מסור חור בגודל 1-7/8 אינץ '. נטרל את החור באמצעות מסור חור 50 מ"מ ושמור על עומק החור ~ 1 מ"מ.
  3. התאימו את מחזיק הדגימה לחתיכת אלומיניום 2 על הבמה הממונעת והרכיבו אותו באמצעות ברגים.
  4. הניחו את שרוול סרט הגומי הטבעי (עובי: 0.01 אינץ'; מודבק בדבק ציאנואקרילט) בין שני חלקי האלומיניום המיוצרים במכונה והרכיבו אותו באמצעות גומיות בכל קצה.
  5. חבר את גליל CO2 דחוס למודול מערבל הגז באמצעות צינורות ומחברים מתאימים. הגדר את לחץ הכניסה CO2 על 20-25 psi. השתמש בחיישן CO2 מובנה ובבקר כדי להבטיח שמודול מערבל האוויר יכול לווסת ולערבב 5%CO2 בזרימת האוויר. השתמש במסננים מוטבעים כדי לנקות את זרימת האוויר.
  6. באמצעות צינורות ומחברים מתאימים, כוונו את האוויר המעורב (עם 5% CO2) לבקבוק המים המעוקרים שהונחו על הפלטה החשמלית, ולאחר מכן כוונו את האוויר הלח לתא הגמיש. כוונו את הפלטה החמה ל-37°C. בוערו את זרימת האוויר במים החמים כדי להגביר את הלחות של זרימת האוויר.

3. הכנה לניסויי הדמיה של SRS תאים חיים בהילוך מהיר

  1. נגבו את כל חלקי התא הגמיש באתנול 70%, כולל האף, מטרת טבילת המים ומחזיק הדגימה.
  2. לטהר את כל מערכת המארז באמצעות מנורת UV הממוקמת במארז למשך 20 עד 30 דקות.
    הערה: אין להישאר בחדר המעבדה במהלך תהליך חיטוי UV מטעמי בטיחות.
  3. תרבית תאי SKOV3 בצלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית בקוטר 50 מ"מ למשך 12 שעות בתנאים פיזיולוגיים רגילים באינקובטור רגיל.
    הערה: התחל את תרבית התאים SKOV318 בארון בטיחות ביולוגית סטנדרטי.
  4. נתק את חתיכת האלומיניום המכונה 2 ממחזיק הדגימה על ידי הסרת הברגים.
    הערה: זוהי הדרך לפתוח את התא הגמיש כדי לטעון את צלחת תרבית התא.
  5. טוענים את צלחת תרבית התא. זכרו להוסיף שמן טבילה על החלק העליון של המעבה לפני הנחת צלחת תרבית התא. הסר את מכסה המנה ולשתק את המנה באמצעות מלחציים.
    הערה: כדי למנוע זיהום, כל הפעולות צריכות להתבצע עם כפפות.
  6. הנמיכו את המטרה למדיה של תרבית התאים למיקוד גס. מנמיכים את חתיכת האלומיניום 2 כדי לתחום את התא הגמיש ולהרכיב אותו על מחזיק הדגימה באמצעות ברגים.
    הערה: כרית כרית גומי סיליקון 2 מ"מ מחוברת לתחתית חתיכת אלומיניום 2 כדי לאטום את הרווח בחוזקה.
  7. הגדר את אספקת האוויר עם 5% CO 2 ו- 19% O2 לתרבית תאים רגילה עם קצב זרימת אוויר של 200 סמ"ק/דקה.
    הערה: ניתן להשתמש בקצב זרימת אוויר נמוך יותר. זה תלוי כמה טוב החדר הגמיש אטום.

4. ערוך ניסויי הדמיה של SRS תאים חיים בהילוך מהיר

  1. כוונן את אורך גל הלייזר ל- 805 ננומטר כדי לכוון להיסטת ראמאן 2854 ס"מ-1 , המיוחסת לרטט של קשרים כימיים CH2 . השתמש בעוצמת לייזר נמוכה כדי להפחית את נזקי האור לתאים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בהספק ממוצע ~ 15 mW של לייזר המשאבה ו~ 7.5 mW של לייזר סטוקס (קבוע ב- 1,045 ננומטר) להדמיית תאים חיים לטווח ארוך.
    הערה: עוצמת לייזר גבוהה יותר תניב איכות הדמיה SRS טובה יותר. עם זאת, עוצמת לייזר גבוהה מדי תגרום נזק לאור לתאים חיים. יש פשרה בין איכות התמונה לבין נזקי האור.
  2. התאם ומקד את המטרה כדי להשיג הדמיית SRS טובה של התאים באמצעות לחצן FOCUS בלוח הבקרה הראשי של התוכנה. כדי לבצע מיקוד מהיר, הגדר את מספר הפיקסלים להיות 512 × 512 פיקסלים עם זמן שהייה של 4.8 μs בחלונית CONFIGURATION .
  3. הגדר את טווח הכניסה של מגבר הנעילה (בדרך כלל 5 mV) להיות כפול ממתח האות המרבי. הגדר את המסנן במעבר נמוך כך שיהיה זהה לזמן השהייה של הפיקסלים (4.8 μs).
    הערה: מערכות SRS שונות שנבנו במעבדה עשויות להשתמש בהגדרות שונות של איסוף נתונים.
  4. לאחר השגת מיקוד טוב, הגדר את רזולוציית ההדמיה להיות 2,048 × 2,048 פיקסלים עבור שדה ראייה של175 מיקרומטר 2 לרכישת תמונות באיכות גבוהה. בדוק את הפונקציה SAVE בחלונית MAIN CONTROLS ובדוק את ערוץ SRS בחלונית CHANNELS . הגדר את מרווח הזמן בין שתי מסגרות ל- 180 שניות (3 דקות) בערוץ הפקדים הראשיים. הגדר את מספר הרכישה ל- 480 עבור הדמיה בהילוך מהיר במשך 24 שעות.
    הערה: ניתן להשתמש ברזולוציית הדמיה נמוכה יותר בהתאם למטרת הניסויים.
  5. הפעל רכישת הדמיה אוטומטית באמצעות הפונקציה LOOP בלוח הבקרה הראשי .
    הערה: בדוק אם יש סחף מוקד עקב חוסר יציבות טמפרטורה בשעה הראשונה של ההדמיה. ייתכן שההדמיה של השעה הראשונה לא תהיה יציבה. בדוק את המיקוד כל 2-3 שעות במהלך סשן ההדמיה בהילוך מהיר.
  6. עבד את התמונות שנאספו באמצעות ImageJ19. השתמש בשתי השיטות הבאות לכימות LD: (i) יחס שטח גוף התא LD/תא, ו- (ii) עוצמת SRS הממוצעת של LDs הכולל. מדוד את שטח גוף התא על-ידי סף ואפס של הפיקסלים הלא-תאיים בתמונות SRS ב- 2,854 cm-1. מדדו את האזור והעוצמה של LD באמצעות סף ואפס של פיקסלים שאינם LD בתמונות SRS.
    הערה: פרטים נוספים על עיבוד תמונה SRS דווחו בעבר16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ייצרנו והרכבנו את מערכת התאים הגמישים להדמיית SRS בהילוך מהיר (איור 1 ואיור 2), ולאחר מכן הערכנו את ביצועי המערכת. הטמפרטורה בתוך המתחם הסביבתי של המיקרוסקופ הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס הצפויות בתוך שעה אחת, מה שלא השפיע באופן משמעותי על טמפרטורת החדר (איור 3A). הטמפרטורה בתא הגמיש הגיעה ל-37 מעלות צלזיוס תוך שעה וחצי, והיא נשמרה ביציבות ב-37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לפחות (איור 3B). הלחות היחסית בתא הגמיש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מיקרוסקופ SRS של תאים חיים בהילוך מהיר הוא טכניקת הדמיה חלופית למעקב אחר מולקולות באופן נטול תוויות. בהשוואה לתיוג פלואורסצנטי, הדמיית SRS אינה מלבינה פוטו, ומאפשרת ניטור ארוך טווח של מולקולות. עם זאת, נכון להיום, מערכת הדמיה של תאים חיים במיקרוסקופ SRS זקוף אינה זמינה מסחרית. בעבודה זו פותחה מערכת דימות תאים חיים עם קופסת מארז מיקרוסקופ יציבה מבודדת תרמית ותא רך פנימי גמיש כדי לאפשר דימות בהילוך מהיר SRS משודר. במערך זה, תיבת המארז הגדולה שומרת על יציבות טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, בעוד שהתא הרך הפנימי מספק אוויר לח כד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

אנו רוצים להודות לצוות העיצוב הבכיר לתואר ראשון לשנת 2019 (סוק צ'ול יון, איאן פוקסטון, לואיס מאזה וג'יימס וולש) באוניברסיטת בינגהמטון על התכנון, הייצור והבדיקה של קופסת מארז המיקרוסקופ. אנו מודים לסקוט הנקוק, אולגה פטרובה ופביולה מורנו אוליבס מאוניברסיטת בינגהמטון על הדיונים המועילים. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R15GM140444.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק> מיקרוסקופ SRS שנבנה במעבדהhttps://rdcu.be/cP6ve
מגבר נעילה HF2LI 50 מגה-הרץציריך אינסטרומנטסHF2LI
דיאפרגמת איריסThorlabsInc SM1D12
תושבת מראה קינמטיתThorlabs IncKM100
מסגרת מיקרוסקופNikon IncFN-1
שלב מיקרוסקופיה ממונעתמעבה טבילה בשמןZ-Deck
C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)Nikon IncMBL71405
מטרת טבילה במים (CFI75 Apo 25XC W 1300)Nikon IncMRD77225
<חזק>חומרים וחלקים למארז המיקרוסקופ (31 אינץ' x 29 אינץ' x 28 אינץ' אורך x רוחב x גובה)
מודול מחמם AirthermWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SAT-1W
בקר מחמם Airtherm, CO2 וצג לחותWorld Precision Instruments (WPI)AIRTHERM-SMT-1W
מודול מיקסר אוויר/CO<תת>2 WorldPrecision Instruments (WPI)ECU-HOC-W
צינור צינור גמיש (2-1/2 אינץ' ID, 2-3/4 אינץ' OD)מקמאסטר-קאר56675K71
קרמיקה זכוכית-נציץ בטמפרטורה גבוהה, קלה למכונה (6 אינץ' x 6 אינץ', עובי 1/4 אינץ')מקמאסטר-קאר8489K62
יריעות פוליקרבונט (עובי 0.25 אינץ')מקמאסטר-קאר8574K286
יריעות גומי סיליקון (36 אינץ' x 36 אינץ', עובי 1/8 אינץ')McMaster-Carr5827T43
<חזק>חומרים וחלקים לתא גמיש
פלטה חמהMcMaster-Carr31745K11
מסנן מוטבע בטוהר גבוה, 1/4 NPTMcMaster-Carr6645T18
מסור (קוטר חיתוך 1-7/8 אינץ')McMaster-Carr4066A34
מסור (קוטר חיתוך 50 מ"מ)McMaster-Carr4556A19
צינורות גומי סיליקון בטמפרטורה גבוהה, רכים, 2 מ"מ ID, 5 מ"מ ODMcMaster-Carr5054K313
מסנן מוטבע (1/4 NPT, 40 מיקרון)McMaster-Carr98385K843
צינור עגול אלומיניום רב תכליתי 6061 (עובי דופן 1/8 אינץ', 4 אינץ' ' OD)McMaster-Carr9056K42
רב תכליתי 6061 צינור עגול אלומיניום (עובי דופן 3/4 אינץ', 3-3/4 אינץ' OD)מקמאסטר-קאר9056K47
מוט אלומיניום רב תכליתי 6061 (12 אינץ' x 12 אינץ', עובי 1/4 אינץ')מקמאסטר-קאר8975K142
מוט אלומיניום רב תכליתי 6061 (8 אינץ' x 8 אינץ', עובי 3/8 אינץ' ')McMaster-Carr9246K21
אף אובייקטיבי (יחיד)Nikon IncFN-MN-H
מחזיק מדגם (שונה)Pre ScientificHZ202
סרט גומי טבעי דק במיוחד (עובי 0.01'')McMaster-Carr8611K13
צנצנת זכוכית הניתנת לאטימה בוואקוםMcMaster-Carr3231T44
Software
MATLABMathWorks
ImageJ (פיג'י)imagej.net
ScanImageVidrio Technologies, LLCתוכנת הדמיה SRS
<חזק>חומרים להדמיית תאים חיים
מכסים כלי תרבית סטריליים עם תחתית זכוכית (Dia.x H, 50 x 7 מ"מ)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית (EMS)70674-02
מדיום תרבית תאים DMEMThermoFisher Scientific11965092
סרום בקר עוברי (FBS)ThermoFisher Scientific26140079
LysoSensor צבע פלואורסצנטי DND-189ThermoFisher ScientificL7535 (Invitrogen)
חומצה אולאיתMilliporeSigma364525
קו תאים SKOV3ATCCHTB-77
(

מקורות

  1. Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
  2. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  3. Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging in biomedicine. Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).
  4. Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  5. lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004(2020).
  6. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870(2015).
  7. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  8. Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
  9. Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
  10. Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365(2020).
  11. Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
  12. Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
  13. Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
  14. Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
  15. Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
  16. Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
  17. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
  18. Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416(2021).
  19. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  20. Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
  21. Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
  22. Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
  23. Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
  24. Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003(2022).
  25. Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
  26. Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353(2022).
  27. Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
  28. Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
  29. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  30. Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
  31. Cole, R. Live-cell imaging: the cell's perspective. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).
  32. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
  33. Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
  34. Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. Mechanoreciprocity in cell migration. Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).
  35. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SRS

מאמרים קשורים