כלבת היא דלקת מוח נגיפית, חריפה, מתקדמת. הגורם האטיולוגי בצורת כדור שייך לסוג Lyssavirus, שלפחות 17 מהם גורמים לכלבת ברחבי העולם (למעט באנטארקטיקה). נגיף הכלבת הוא החבר החשוב ביותר בנגיפי ה-RNA המגוונים הללו. כל היונקים רגישים, כאשר עטלפים וטורפים הם מאגרים משמעותיים. העברה מתרחשת בעיקר לאחר נשיכה. כסוכנים נוירוטרופיים מובהקים, נגיפים מתקדמים באופן צנטריפטלי לאחר הרבדה באמצעות אקסונים מהפריפריה למערכת העצבים המרכזית (CNS) לצורך שכפול, ולאחר מכן לבלוטות הרוק, ומופרשים לרוק. ברחבי העולם, כלבים אחראים למספר הגדול ביותר של מקרי מוות מכלבת, וגורמים לעשרות אלפי מקרי מוות מדי שנה. בהתחשב בממדים זואונוטיים, שיטות מעבדה חיוניות למחקר יישומי ולהודעה על מחלות, מניעה ובקרה בבני אדם, חיות בית וחיות בר. המטרה מאחורי אוסף זה של תשעה מאמרים הקשורים זה בזה היא להציג שיטות המספקות התבוננות פנימית בהתרחשות כלבת, זיהוי, פתוביולוגיה, אפידמיולוגיה, ניהול ושיפור בתרופות ביולוגיות.
כיצד מעריכים כלבת? כלבת צריכה להיות מחלה שניתן להודיע עליה, עם איסוף, ניתוח ופרשנות אפידמיולוגית מתאימה של נתונים. כיום, רוב המקרים מדווחים ממעקב פסיבי, המבוסס על בעלי חיים החושפים בני אדם. למרות שזה עשוי להיראות פשוט למדי לדמיין לכידה בטוחה, ריסון, הרגעה והמתת חסד של חשוד קליני (כלומר, כלב נושך לאבחון כלבת), זה לא קל עבור חלק מחיות הבר. לדוגמה, טייוואן הייתה אזור שנחשב ל"נקי" מכלבת, שהתבסס במקור על מעקב נרחב אחר חיות בית. עם זאת, מתוך הכרה בחשיבותם של מאגרי בעלי חיים אחרים, החוקרים באי הפנו את תשומת ליבם לחיות הבר. כפי שמתאר סו ועמיתיו, האיסוף הממוקד של עטלפים גוססים ומתים מספק הזדמנות לגילוי מינים ייחודיים של וירוס ליסה בטייוואן1. מאמצים כאלה הרחיבו את הרוחב הטקסונומי של סוג ויראלי זה וסיפקו תוכנית סבירה להערכות אחרות באסיה.
אילו רקמות דרושות לאבחון נגיף הליסה? בנוסף לגזירת שיטות מעקב רלוונטיות וזיהוי נכון של מינים, בחירת רקמות בטוחה ומתאימה היא בעלת חשיבות עליונה לאבחון רגיש וספציפי של כלבת. מאזהמאה ה - 19, מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוערכה כרקמה ראשונית. בעלי חיים הומתו, פגריהם נשלחו למעבדה, גולגולות נפתחו, מוחות הוסרו וחלקים נבדקו במיקרוסקופ לאיתור תכלילים ויראליים. עם זאת, משלוח של בעלי חיים שלמים אינו מעשי, במיוחד עם יונקים גדולים כמו בעלי חיים. יתר על כן, לא כל אזורי המוח שימושיים באותה מידה לאבחון. ג'רוויס ועמיתיו מתארים שיטות נתיחה בטוחות ומעשיות ליונקים קטנים וגדולים כאחד הממזערות את סיכון החשיפה ומפחיתות את זמני העיבוד2. יישום המלצות בטיחות ביולוגית כאלה והריכוז בגזע המוח ובמוח הקטן ישפרו את השיטות למעקב מודרני מבוסס מעבדה של כלבת בעלי חיים.
אילו אפשרויות משמשות לזיהוי אנטיגן נגיפי? לאבחון שגרתי של נגיף ליסה נעשה שימוש מאז אמצע המאהה-20 בבדיקת נוגדנים פלואורסצנטיים ישירים (DFA) לתצפית על תכלילים נגיפיים ברקמת מערכת העצבים המרכזית. למרות שבדיקת DFA רגישה וספציפית מאוד, היא דורשת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומשתמשת באצטון כמקבע רקמות. פטריק ועמיתיו מדווחים על שימוש בבדיקה אימונוהיסטוכימית ישירה ומהירה (DRIT) המסתמכת על איסוף גזע המוח, קיבוע פורמלין של טביעות רקמות, שימוש בנוגדנים חד שבטיים או רב-שבטיים המצומדים לביוטין, וזיהוי תכלילים נגיפיים על ידי מיקרוסקופ אור, תוך פחות משעה3. לטרט יש רגישות וסגוליות דומות לבדיקת DFA, והוא מתאים למעקב מבוזר ומשופר מבוסס מעבדה בתנאי שטח. עבור הגדרות מוגבלות במשאבים, בדיקת זרימה ליניארית (LFA) היא שיטה נוספת לאבחון מהיר הדורשת מומחיות טכנית מינימלית, כפי שדווח על ידי Mauti et al.. ניתן לשלוח רצועות בדיקה חיוביות מהשטח למעבדה מרכזית לאישור4.
מלבד זיהוי אנטיגן, האם שיטות אחרות מתאימות לאבחון ליסה וירוס? בדיקות DFA, drit ו-LFA שימושיות לאיתור אנטיגנים נגיפיים ברקמות CNS לאחר המוות. עם זאת, רקמות המוח עשויות להתפרק. יתר על כן, במקרים החשודים בבני אדם, בדיקות טרום מורטם רצויות יותר ויכולות לכלול דגימות קליניות חלופיות כגון CSF. ככזה, בדיקות מולקולריות שימושיות מאוד לאיתור כמויות קטנות של חומצות גרעין נגיפיות. Marston et al. ו-Wang et al. מתארים טכניקת תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת ומקוננת, בהתאמה, שהיא מהירה, רגישה וספציפית 5,6. תשומת לב קפדנית כזו לפרטים כדי למזער את זיהום הדגימה ותכנון נכון של פריימר מאפשרים אבחון ראשוני על פני הספקטרום של נגיפי ליסה.
לאחר האבחון, האם מיקרוסקופיה קונבנציונלית מתאימה לתובנות מודרניות על פתוביולוגיה של נגיף הליסה? שימוש בשיטות מיקרוסקופיות דו-ממדיות בלבד עלול לגרום להחמצת אלמנטים קריטיים in vivo בהקשר ובמורכבות. עם זאת, באמצעות מטרות מרחק עבודה חופשי ארוך, ניתן לדמות רקמות נגועות בנגיף על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי קונפוקלי קונקונציונאלי ברזולוציות גבוהות, כפי שמפורט על ידי Zaeck et al., כדי לדמיין את התפלגות הפתוגנים ולהעריך טוב יותר פרטים עדינים על פתוגנזה ויראלית, התפשטות, טרופיזם ופלישה עצבית7.
האם יש חלופות למדידת עוצמת חיסון הכלבת? השיטות הנוכחיות למדידת עוצמת חיסון הכלבת דורשות מספר רב של מכרסמי מעבדה. עם זאת, עלויות, מרווחי אמון וסוגיות רווחה מחייבים חלופה. גליקופרוטאין של נגיף הכלבת מעורר נוגדנים מנטרלי הנגיף לאחר החיסון. כפי שנמסר על ידי ג'לט וטורדו, ניתן להשתמש בבדיקת ELISA במבחנה במקום בבעלי חיים כדי למדוד את התוכן היחסי של חיסוני נגיף הכלבת, תוך שימוש בנוגדנים חד שבטיים ספציפיים מאוד8.
האם ניתן להסיק על צריכת פיתיון חיסון דרך הפה על ידי חיות בר באמצעות סמנים ביולוגיים? מלבד חיסון פרנטרלי של בני אדם וחיות בית, חיסון אוראלי של אוכלי מזון פראיים פועל מאז שנות ה-70. מלבד מדידת החיסון החיסוני או היעילות הנובעת מכך בקרב אוכלוסיות של שועלים, דביבונים, בואש וכו' על ידי זיהוי מקרה, ניתן להשתמש בסמנים ביולוגיים כדי להסיק מגע וצריכה של פיתיונות עמוסים בחיסונים. מבחינה היסטורית, זיהוי טטרציקלין משולב מפתיונות נעשה בעצמות או בשיניים של בעלי חיים. אלטרנטיבה לאיסוף רקמות קשות כאלה היא מדידה סרולוגית של סמן ביולוגי אחר, כגון חומצה יופנוקסית. ברנטסן ועמיתיו מדווחים על ניתוחים של נגזרות כאלה בסרה של נמיות, מאגר טבעי חשוב באסיה, שהוכנס לאזור הקריבי9. לאחר צריכת פיתיון המכיל את הסמן הביולוגי הזה על ידי נמיות בשבי, הם חילצו חומצות יופנוקסיות לאצטוניטריל וניתחו סרום של בעלי חיים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה. סימון הולם התגלה במשך מספר שבועות לאחר צריכת הפיתיונות ונגזרות כאלה יכולות להתאים להערכת שטח של ספיגת פיתיון עמוס חיסון בבעלי חיים חופשיים.
בין היתר בשל מגיפת COVID-19 המתמשכת, צפויות שיטות וירולוגיות משופרות במעקב משופר אחר נגיף הליסה, גילוי פתוגנים, אבחון מאשר ואפיון וריאנטים. קריאה על טכניקות שונות בספרות שנבדקה על ידי עמיתים היא בדרך כלל הצעד הראשון עבור אדם מעוניין. עם זאת, התבוננות ישירה ברצף צעדים, ושמיעת ההקשר ממפעיל מנוסה, מסירה ניואנסים ופרשנות שגויה. פרוטוקולי מעבדה ושדה נוכחיים ועתידיים הקשורים לכלבת, כפי שהומלץ על ידי ה-OIE וארגון הבריאות העולמי, יכולים להפיק תועלת מאוספי שיטות חזותיות נוספות כדי לסייע לחוקרים חדשים, במיוחד במדינות מתפתחות.