הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64454

⸱

10 באוקטובר 2022

 , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

שיטה פשוטה ומדרגית פותחה כדי להעריך את המשמעות התפקודית של גרסאות missense ב- Ube3a, גן שאובדן ורווח תפקודו קשורים הן לתסמונת אנג'למן והן להפרעת ספקטרום האוטיזם.

תקציר

השימוש המוגבר בריצוף ברפואה זיהה מיליוני גרסאות קידוד בגנום האנושי. רבים מהווריאנטים האלה מתרחשים בגנים הקשורים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אך המשמעות התפקודית של הרוב המכריע של הווריאנטים עדיין לא ידועה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של וריאנטים עבור Ube3a, גן המקודד E3 יוביקוויטין ליגאז הקשור הן לאוטיזם והן לתסמונת אנג'למן. שכפול או משולש של Ube3a קשור מאוד לאוטיזם, ואילו מחיקתו גורמת לתסמונת אנג'למן. לפיכך, הבנת הערכיות של שינויים בפעילות החלבון UBE3A חשובה לתוצאות קליניות. כאן מתוארת שיטה מהירה, מבוססת תאים, המשלבת גרסאות Ube3a עם כתב מסלול Wnt. בדיקה פשוטה זו ניתנת להרחבה וניתן להשתמש בה כדי לקבוע את הערכיות ואת גודל השינויים בפעילות בכל גרסה של Ube3a . יתר על כן, המתקן של שיטה זו מאפשר יצירת שפע של מידע מבנה-פונקציה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לקבל תובנות עמוקות על מנגנונים אנזימטיים של UBE3A.

מבוא

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה הפכה את ריצוף האקסומים והגנומים לשגרתי במסגרות קליניות 1,2. זה הוביל לגילוי של מספר רב של וריאנטים גנטיים, כולל מיליוני וריאנטים של מיסנס שבדרך כלל משנים חומצת אמינו אחת בחלבון. הבנת המשמעות הפונקציונלית של וריאנטים אלה נותרה אתגר, ורק לחלק קטן (~2%) מהווריאנטים הידועים של מיסנס יש פרשנות קלינית 1,3.

דוגמה בולטת לבעיה זו היא Ube3a, גן המקודד יוביקוויטין ליגאז E3 המכוון לחלבוני סובסטרט לפירוק4. Ube3a שוכן בתוך כרומוזום 15q11-13 ומתבטא אך ורק באלל 5,6,7 שעבר בירושה אימהית. תצפיות מהגנטיקה של מחלות מצביעות על כך שפעילות לא מספקת או מוגזמת של האנזים UBE3A גורמת להפרעות נוירו-התפתחותיות מובהקות. מחיקת כרומוזום אימהי 15q11-13 גורמת לתסמונת אנג'למן (AS)8, הפרעה המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית קשה, ליקויים מוטוריים, התקפים, התנהגות שמחה עם חיוך תכוף, ותווי פנים דיסמורפיים 8,9,10. לעומת זאת, שכפול או שילוש של כרומוזום אימהי 15q11-13 גורם לתסמונת Dup15q, מצב הטרוגני המוכר כאחת הצורות הסינדרומיות הנפוצות ביותר של אוטיזם11,12,13. בנוסף, ישנם מאות וריאנטים שגויים שזוהו ב- Ube3a, שרובם נחשבים לווריאנטים בעלי משמעות לא ברורה (VUS) מכיוון שמשמעותם התפקודית והקלינית אינה ידועה. לפיכך, יש עניין רב בפיתוח שיטות שיכולות להעריך באופן אמפירי גרסאות Ube3a כדי לקבוע אם הם תורמים למחלות נוירו-התפתחותיות.

האנזים UBE3A שייך למשפחת התחום HECT (הומולוגית ל-E6-AP C-terminus) של ליגאזות יוביקוויטין E3 שכולן מחזיקות בתחום ה-HECT המפורסם, המכיל את המנגנון הביוכימי הדרוש כדי לקבל יוביקוויטין פעיל מאנזימי E2 ולהעבירו לחלבוני סובסטרט14. מבחינה היסטורית, האפיון של אנזימי E3 הסתמך על מערכות מבחנה משוחזרות הדורשות אנסמבל של חלבונים מטוהרים 4,15,16. שיטות כאלה הן איטיות ועתירות עבודה ואינן ניתנות להערכת הפעילות של מספר רב של גרסאות. בעבודה קודמת, UBE3A זוהה כמפעיל את מסלול ה-Wnt בתאי HEK293T על ידי ויסות תפקוד הפרוטאזום כדי להאט את הפירוק של β-קטנין17. תובנה זו מאפשרת את השימוש בכתבי מסלול Wnt כשיטה יעילה ומהירה לזיהוי גרסאות אובדן ורווח של פונקציה של Ube3a18. הפרוטוקול שלהלן מתאר בפירוט שיטה ליצירת וריאנטים של Ube3a וכן כתב מבוסס לוציפראז להערכת שינויים בפעילות של וריאנטים של Ube3a.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיבוט מוטגנזה ליצירת גרסאות Ube3a

  1. שכפלו את כל גרסאות Ube3a לפלסמיד pCIG2 (איור 1A), וקטור ביקיסטרוני המכיל מקדם עוף-β-אקטין ואתר כניסה לריבוזום פנימי (IRES) עבור ביטוי EGFP19. מבנים באורך מלא של Ube3a מכילים רצף תגי Myc מסוף N והם משוכפלים ל-pCIG2 באמצעות אתר SacI בגודל 5' ואתר XmaI בגודל 3 אינץ'. בנוסף, אתרי EcoRI, EcoRV ו-PstI טבעיים בתוך רצף הקידוד Ube3a משמשים גם להחלקת שברים.
    הערה: ניתן להשיג גרסאות לא מזוהות עבור Ube3a באמצעות הספרות ובמאגרים נגישים לציבור כגון מסד הנתונים ClinVar1. גרסאות נוספות שאינן מדווחות ניתן להשיג באמצעות תקשורת אישית עם מרכזים רפואיים.
  2. השתמש בשיטת מוטגנזה דו-שלבית מותאמת של מגה-פרימר20 כדי להכניס מוטציות למסגרת הקריאה של Ube3a . בשלב הראשון, תכננו את האוליגונוקלאוטיד המוטגני המכיל את המוטציה הרצויה (הדוגמה המוצגת בפרוטוקול זה היא יצירת וריאנט UBE3A Q588E) שלצדו לפחות 30 זוגות בסיסים (bp) של הומולוגיה 5′ ו-3′ למוטציה (איור 1B וטבלה 1).
  3. השתמשו באוליגונוקלאוטיד המוטגני יחד עם אוליגונוקלאוטיד משלים עבור ה-PCR בסיבוב הראשון כדי ליצור מגה-פרימר של 200-400 bp המכיל את המוטציה (איור 1C; טבלה 2 וטבלה 3). השתמש בכל 50 μL של נפח התגובה PCR עבור אלקטרופורזה ג'ל agarose באמצעות ג'ל 1% וטיהור ג'ל לאחר מכן (טבלת חומרים). יש להצמיד את מוצר ה-PCR ב-30 μL שלH2O שעבר דה-יוניזציה (diH2O) לשימוש בסיבוב השני של ה-PCR בשלב הבא.
  4. הגדר את ה-PCR בסיבוב השני כפי שצוין (איור 1C; טבלה 2 וטבלה 3). שלב זה ייצור מקטעי דנ"א גדולים יותר (בדרך כלל באורך של ~1-1.5 קילובייט) המכילים את אתרי המוטציה וההגבלה הסופית המתאימים לשיבוט משנה (איור 1C).
  5. לאחר השלמת תגובת ה-PCR, יש לטהר את המוצר המתקבל באמצעות ערכת טיהור PCR (טבלת חומרים). יש לעכל ב-30 μL ולעכל את כל המוצר המטוהר ואת מבנה ה-pCIG2 Ube3a WT עם אנזימי ההגבלה המתאימים (הדוגמה מראה עיכול עם EcoRI ו-XmaI).
  6. לאחר שעתיים של עיכול בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, פתרו את תוצרי העיכול באמצעות אלקטרופורזה בג'ל אגרוז (1% ג'ל), וטיהרו את המוצרים המתאימים באמצעות ג'ל. הגדר קשירת בהתאם לפרוטוקול היצרן (טבלת חומרים), הפוך את מוצרי הקשירה לזן חיידקים DH10B (טבלת חומרים), ולאחר מכן צלחת עם בחירת אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל).
  7. למחרת, בחרו שתיים עד ארבע מושבות כדי לחסן תרביות של 3 מ"ל המכילות מרק לוריא (LB) ו-100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. תנו לתרביות לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור מסלולי עם רעידות (225 סל"ד).
  8. למחרת, השתמש ב-1-1.5 מ"ל של תרבית החיידקים כדי למזער את הדנ"א הפלסמיד (טבלת החומרים). להציל את התרבות הנותרת על ידי הצבתם ב 4 °C (64 °F). סנן את הפלסמידים המצומצמים על ידי ריצוף סנגר באמצעות אוליגונוקלאוטיד שנקשר ~200 bp מהמוטציה הרצויה.
  9. השתמש בתרביות החיידקים שנשמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לחסן מחדש תרביות של 50 מ"ל כדי למידיפרפ את הפלסמיד הנכון (טבלת החומרים). רצף מלא של רצף הקידוד Ube3a כדי לאמת את הרצף הנכון של הדנ"א.
  10. צור מלאי עבודה של פלסמידים בגרסה Ube3a, כמו גם את הכתב המופעל על ידי β-קטנין (BAR)21, TK-Renilla luciferase, Ube3a מת ליגאז (מוטציית UBE3A C820A), וקטור ריק pCIG2 בריכוז של 100 ng/μL באמצעות H2O סטרילי עבור שלבי ההעברה הבאים.

2. הכנה והעברה של תאי כליה עובריים אנושיים 293T (HEK293T)

  1. בצע את הבדיקות בתאי HEK293T שגודלו במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו, בתוספת גלוטמין, 10% סרום בקר עוברי (FBS) וחומר אנטיביוטי-אנטימיקוטי כפי שתואר קודםלכן 17. לגדל את התאים באינקובטור סטרילי ולח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  2. באמצעות ארון בטיחות ביולוגית, צלחת תחילה את תאי HEK293T המרחפים על לוחות 96 בעלי תחתית שטוחה שטופלו בתרבית רקמה בצפיפות של 2.2 × 104 תאים לכל באר ב-100 μL של מדיית תרבית ולאפשר להם לגדול בן לילה.
  3. ביום השני, העבירו את התאים בארון בטיחות ביולוגית עם פלסמידים של פיירפליי ורנילה לוציפראז (טבלה 4) ופלסמידים של Ube3a במשולש. בצע את הטרנספקציות ב-10 μL של הנפח הכולל לכל באר באמצעות יחס של 10:1:8 של פלסמידים (50 ng של BAR, 5 ng של TK-Renilla, ו-40 ng של Ube3a פלסמיד לכל באר, בהתאמה), כפי שתואר קודם לכן18, ו-0.4 μL של מגיב טרנספקציה (טבלה 4).
    הערה: עבור כל ניסוי, וקטור ריק (GFP בלבד) וקידוד פלסמיד ליגאז-מת Ube3a גם הם מועברים כדי לשמש כבקרות שליליות.
  4. צור תערובת אב עבור הטרנספקציות עבור כל גרסה בצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל (טבלה 4) ודגירה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, התסיסו בעדינות את תערובת הטרנספקציה על ידי הקשה על הצינור, ולאחר מכן הוסיפו 10 μL של תערובת הטרנספקציה ישירות למדיית הצמיחה הקיימת בבארות.
  5. לאחר מכן, החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לפלסמידים להתבטא במשך 48 שעות. החלפת מדיית הצמיחה אינה הכרחית.
  6. נטר את יעילות ההעברה על ידי פלואורסצנציה של GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאי HEK293T עוברים טרנספקציה יעילה בשיטה זו, ו->80% מהתאים צריכים לבטא GFP לאחר 48 שעות.

3. מדידת פעילות לוציפראז

הערה: פעילות לוציפראז מוערכת באמצעות מערכת זמינה מסחרית הבודקת הן את Firefly והן את Renilla luciferase (טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן.

  1. שאפו בזהירות את מדיית התרבית מתאי HEK293T שעברו טרנספקציה, ולאחר מכן שטפו את התאים בתמיסת מלח קרה עם מאגרי פוספט (PBS). שאפו את ה-PBS והניחו את התאים על ידי הוספת 25 μL של חיץ ליזיס שאינו דנטורינג ודגירה במשך 15 דקות עם נדנדה עדינה על קרח.
  2. לאחר מכן, הוסף 20 μL של ליזאט שנוצר (אין צורך בצנטריפוגה) לתוך צלחת בדיקה חדשה של 96 בארות המכילה 100 μL של מגיב מצע לוציפראז Firefly. מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי הקשה.
  3. טען את הצלחת על קורא צלחות ומדוד את עוצמת האור באמצעות גלאי עליון עם גובה קריאה של 1 מ"מ וזמן אינטגרציה של 1 שניות.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את הרווח של הגלאי בהתבסס על עוצמת האות.
  4. מיד לאחר קריאת לומינסנציה של פיירפליי לוציפראז, הוסף 100 μL של מצע Renilla luciferase לבארות. צעד זה מרווה בו זמנית את פעילות לוציפראז Firefly תוך הערכת פעילות רנילה לוציפראז. מערבבים את הדגימות על ידי תסיסה עדינה של הצלחת ומודדים שוב את הלומינסנציה כדי להעריך את פעילות רנילה לוציפראז.
    הערה: בעוד שניתן להשתמש בלוחות אחרים לבדיקה זו, שימוש בלוחות עם מסגרות שחורות ובארות לבנות יספק את התוצאות הרגישות ביותר מכיוון שהדבר מגביר את אות לוציפראז תוך מזעור הרעש.
  5. לכמת את תגובות הכתבים כיחס לוציפראז של פיירפליי ל-Renilla luciferase (Firefly/Renilla), ולממוצע את הערכים של מדידות המשולש. לאחר מכן, נרמל את הערך Firefly/Renilla עבור כל וריאנט כנגד הערכים עבור תאים מסוג בר (WT) Ube3a המבטאים כדי להשוות את הפעילות היחסית של חלבונים משתנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סריקה פונקציונלית בקנה מידה גדול של וריאנטים של Ube3a missense מזהה נוף רחב של מוטציות אובדן ורווח של תפקוד
עבודה קודמת עם מוטנטים של Ube3a הציעה שתגובת Wnt יכולה לשמש ככתב של פעילות החלבון UBE3A התאית. תצפיות אלה הורחבו, ונערכו ניסויי ולידציה נוספים כדי לחקור אם בדיקת BAR מתאימה לדיווח על מגוון פעילויות UBE3A בתא. ראשית, תאי HEK293T עברו טרנספקציה עם כמויות משתנות של דנ"א פלסמיד המקודד ל-WT Ube3a אנושי. הניסוי הזה הראה שתגובת ה-BAR משתנה באופן ליניארי עם כמות ה-Ube3a

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה ומדרגית להערכת הפעילות האנזימטית של גרסאות Ube3a. ישנם מספר פרטים טכניים המחייבים שיקול דעת זהיר בעת שימוש בבדיקה זו. שיקול אחד הוא הבחירה בפלסמידים של כתב Wnt המשמשים בבדיקה זו. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש באופן ספציפי ב-β-catenin מופעל reporter (BAR)21, כתב המכיל שרשור של 12 רכיבי תגובה של גורם תאי T (TCF) המופרדים על ידי רצפי מקשרים שתוכננו במיוחד כדי למזער רקומבינציה ואובדן של אתרי קשירת TCF. ישנם פלסמידים נוספים מבוססי Wnt המבוססים על לוציפראז המתו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרס גשר לעצמאות של קרן סימונס (פרס SFARI #387972; J.J.Y.), פרס חוקר צעיר של NARSAD מהקרן לחקר המוח וההתנהגות (J.J.Y.), מלגת מחקר מקרן אלפרד פ. סלואן (J.J.Y.), ומענקי מחקר מקרן תסמונת אנג'למן (J.J.Y.), קרן וייטהול (J.J.Y.) ו- NIMH (R01MH122786; ג'יי.ג'יי.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין-EDTA (1x), פנול אדוםGibco25300-054
1 Kb סולם DNALambda BiotechM108-S
100 bp סולם DNALambda BiotechM107
10x מאגר עבור T4 DNA Ligase עם 10 מ"מ ATPניו אינגלנד BioLabsB0202A
5x Phusion HF מאגר תגובהניו אינגלנד BioLabsB0518S
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתקורנינג30004CI
שחור/לבן Isoplate-96 מסגרת שחורה צלחת באר לבנהPerkinElmer6005030
Carbenicillin מלח דיסודיוםהמערב התיכון ScientificKCC46000-5
תא ספירת תאים רוזנת  שקופיותInvitrogen מאת Thermo Fisher ScientificC10283
Countess II מונה סלולרי אוטומטי טכנולוגיותמכונת ספירת תאים
אוליגוס DNA מותאם אישיתטכנולוגיות DNA משולבות (IDT)
דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) תערובת פתרונותניו אינגלנד BioLabsN0447S
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובטגיבקו10569044מדיום בזאלי לתמיכה בצמיחה של קו תאים HEK293T
DPBS (1x)Gibco14190-136
מערכת בדיקת מדווח כפול לוציפראזPromegaE1910
EcoRI-HF ניו אינגלנד BioLabsR3101Sאנזים הגבלה
סרום בקר עוברי, מוסמך, מומת בחוםGibco16140071סרום בקר עוברי
פישרברנד מנות תרבית רקמות מטופלות פני השטחפישרברנדFB012924
FuGENE 6 מגיב טרנספקציהPromegaE2691
טעינת ג'ל צבע סגול (6x)ניו אינגלנד BioLabsB7024A
ATCCCRL-3216
יעילות גבוהה ig 10B תאים מוכשרים כימיתגנומיקה שלמה1011-12תאי E. coli DH10B
ערכת מידי פלסמיד HiSpeedQiagen12643Midi prep
pCIG2 פלסמיד
pGL3 BAR פלסמיד
HF DNA פולימראזניו אינגלנד BioLabsM0530LDNA פולימראז
ProFlex 3 x 32 באר מערכת PCRמערכות ביולוגיות יישומיות על ידי טכנולוגיותThermocycler
pTK Renilla פלסמיד
QIAprep ספין Miniprep Kit (250)Qiagen27106Mini prep
QIAquick ג'ל מיצוי ערכת (250)Qiagen28706טיהור
ג'לערכת טיהור PCR מהירה QIAquick (250)Qiagen28106טיהור PCR
rCutSmart Bufferניו אינגלנד BioLabsB6004S
SacI-HFניו אינגלנד BioLabsR3156Sאנזים הגבלה
סינרגיה HTX קורא רב-מצביBioTek  קורא צלחות מריץ תוכנת Gen5 v3.08 (BioTek)
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202LLigase
TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, תמיסה פי 50, אלקטרופורזהFisher ScientificBP13324
צלחת תרבית רקמות 96 בארות, FlatBottom FisherbrandFB012931
UltraPure Ethidium Bromide SolutionInvitrogen by Thermo Fisher Scientific
אנזים הגבלהXmaINew England BioLabsR0180S
חיים תאי HEK293T חיים 15585011

מקורות

  1. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
  2. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  3. Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
  4. Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
  5. Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
  6. Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
  7. Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
  8. Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
  9. Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
  10. Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
  11. Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
  12. Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
  13. de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
  14. Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
  15. Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
  16. Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
  17. Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
  18. Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).
  19. Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30(2011).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
  22. Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
  23. Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
  24. Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
  25. Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
  26. Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

יוביקוויטין ליגאזתסמונת אנג'למןספקטרום אוטיסטיבדיקה מבוססת תאיםתאי HEK293Tרפורטר לוסיפראזבדיקת BARניתוח מוטציות
שיטה מדרגית ומבוססת תאים להערכה פונקציונלית של גרסאות Ube3a
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.