הפרשת ההפרשה של שורשים היא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על אספסת באמצעות ניתוח מטבולי לא ממוקד.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אוסף של שורש אלפלפה מפריש כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) פתלאט על ייצור מטבוליטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרשות שורשים הן המדיה העיקרית של תקשורת מידע והעברת אנרגיה בין שורשי הצמח לסביבה. השינוי בהפרשת ההפרשה של שורשים הוא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה נועד להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) על ייצור מטבוליטים. ראשית, שתילי אספסת גדלים תחת לחץ DEHP בניסוי תרבית הידרופונית. שנית, הצמחים מועברים לצינורות צנטריפוגות המכילים 50 מ"ל מים אולטרה-טהורים מעוקרים למשך 6 שעות כדי לאסוף הפרשות שורשים. לאחר מכן התמיסות מיובשות בהקפאה במייבש בהקפאה בוואקום. הדגימות הקפואות מופקות ומפורקות באמצעות מגיב bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA). לאחר מכן, התמציות המפורקות נמדדות באמצעות מערכת כרומטוגרף גז יחד עם ספקטרומטר מסה בזמן טיסה (GC-TOF-MS). נתוני המטבוליטים שנרכשו מנותחים לאחר מכן על בסיס שיטות ביואינפורמטיקה. מטבוליטים דיפרנציאליים ומסלולי חילוף חומרים שהשתנו באופן משמעותי צריכים להיחקר לעומק כדי לחשוף את ההשפעה של DEHP על אספסת לאור הפרשות שורש.
מבוא
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) הוא תרכובת כימית סינתטית הנמצאת בשימוש נרחב פלסטיק ופולימרים שונים כמו plasticizer כדי לשפר את הפלסטיות שלהם ואת החוזק. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים הציעו כי DEHP הוא משבש אנדוקריני ויש לו השפעה שלילית על מערכות הנשימה, העצבים והרבייה של בני אדם ובעלי חיים אחרים 1,2,3. בהתחשב בסיכון הבריאותי שלה, הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית, האיחוד האירופי ומרכז ניטור הסביבה של סין סיווגו כולם DEHP ברשימת המזהמים העדיפים. הקרקע נחשבת לכיור חשוב של DEHP בסביבה, בשל יישום חיפוי פלסטיק ודשנים אורגניים, השקיה במי קולחין ויישום חוות בוצה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מטרת פרוטוקול זה היא לספק צינור כללי, מניסוי תרבית הידרופונית ועד אנליזה מטבולית, המכמת את ההשפעה של DEHP על הפרשות שורש אספסת.
1. ניסוי תרבית הידרופונית
הערה: פרוטוקול זה מציג דוגמה לניסוי תרבית הידרופונית אספסת שנועד להשיג שתילי אספסת (Medicago sativa) תחת לחץ של ריכוזים שונים של DEHP. נקבעו שלושה טיפולים: הבקרה ללא תוספות, ותמיסת התזונה זינקה עם 1 מ"ג ק"ג-1 ו-10 מ"ג ק"ג-1 של די(DEHP. ריכוזי DEHP נקבעו על פי התכולה האמיתית של DEHP בקרקע23. לכל טיפול היו שישה עותקים משוכפלים.
- יש לעקר זרעי אספסת עם 0.1% נתרן היפוכלוריט למשך 10 דקות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בניסוי הזה אספו הפרשות שורש אספסת, חילצו ונותחו בהתאם לשיטות לעיל (איור 1). הוקמו שלוש קבוצות טיפול: בקרה, ריכוז נמוך של DEHP (1 מ"ג L−1), וריכוז גבוה של DEHP (10 מ"ג L−1).
בסך הכל התגלו 778 פסגות בכרומטוגרף של הביקורת, מתוכן ניתן לזהות 314 מטבוליטים על פי ספקטרום המסות. כפי שניתן לראות באיור 2, ניתן לסווג את המטבוליטים האלה לשישה סוגים בהתבסס על השפע היחסי: פחמימות (28.6%), חומצות (15.58%), שומנים (13.87%), אלכו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מספק הדרכה כללית כיצד לאסוף ולמדוד את הפרשות השורש של אספסת תחת לחץ DEHP, כמו גם כיצד לנתח את נתוני חילוף החומרים. יש להקדיש תשומת לב רבה לכמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. בניסויים בתרבית הידרופונית, שתילי אספסת תורבתו הידרופונית בבקבוקי זכוכית מלאים בתמיסות מזון עם ריכוזים שונים של DEHP. יש להגן על בקבוקי הזכוכית מפני אור על ידי כיסויים ברדיד אלומיניום לאורך כל תקופת התרבית, על מנת למנוע פוטוליזה של DEHP ולהבטיח אחידות בריכוזי DEHP בכל פתרונות התרבית25,26
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים ידועים או קשרים אישיים שיכלו להשפיע לכאורה על העבודה המדווחת במאמר זה.
תודות
עבודה זו נתמכה במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41877139), הפרויקטים העיקריים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41991335), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFD0800204), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (מס 'BK20161616), תוכנית "135" ותוכנית הגבולות של האקדמיה הסינית למדעים (ISSASIP1615).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אדוניטול | SIGMA | ≥ 99% | |
| זרעי אספסת | האקדמיה למדעי החקלאות של ג'יאנגסו (נאנג'ינג, סין) | ||
| איזון אנליטי | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | עם 1% TMCS, | |
| צנטריפוגה | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| עמודה כרומטוגרפית | Agilent | DB-5MS (30 מ' וזמן; 250 μ m & זמנים; 0.25 μ m) | |
| Di (2-ethylhexyl) phthalate | ד"ר Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | ד"ר Ehrenstorfer | ||
| כרומטוגרפיה גז (GC) | Agilent | 7890A | |
| מכשיר שחיקה | שנחאי Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| ספקטרומטר מסה (MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| מתנול | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| מיקרוצנטריפוגה צינור | Eppendorf | Eppendorf איכות | 1.5 מ"ל |
| תנור | שנחאי Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | תוכנה לניתוח סטטיסטי (העשרת מסלול, טופולוגיה) | ||
| SIMCA16.0.2 | תוכנת ניתוח סטטיסטי (OPLS-DA וכו ') | ||
| מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 סדרת | |
| אולטרסאונד | שנזן Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| מייבש ואקום | Taicang Huamei מפעל מכשירים ביוכימיים | LNG-T98 |
מקורות
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053(2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
