מאמר שיטה

מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

DOI:

10.3791/64473

⸱

13 בינואר 2023

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, University of Oslo

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול לקביעת סמנים ביולוגיים בשפע נמוך מדגימות סרום מיובשות שהודגמו עם הסמן הביולוגי פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP). חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים משמשים לניקוי והעשרה סלקטיביים של פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי. הפפטיד שנלכד מנותח לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-טנדם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול עם תיאורים מפורטים לניקוי דגימות יעיל של חלבונים בשפע נמוך מדגימות מיובשות. פעולה זו מבוצעת באמצעות פרוטאוליזה מבוססת חרוזים לפני קביעת לכידת זיקה פפטידית פרוטאוטיפית וקביעת ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). ניתן ליישם את ההליך הן על דגימות מיובשות קונבנציונליות באמצעות כרטיסי נייר (למשל, כתמי דם מיובשים [DBSs] וכתמי סרום מיובשים [DSS]), כמו גם על דגימות שנאספו בשיטות דגימה חדשות יותר כגון מיקרו-דגימה סופגת נפח (VAMS). בנוסף לתיאור הליך זה, הכנת חרוזי טריפסין וחרוזים מצופים נוגדנים מוצגת באופן שלב אחר שלב בעבודה זו. היתרונות של ההליך המוצג הם פרוטאוליזה חסכונית בזמן באמצעות חרוזים וניקוי חזק סלקטיבי באמצעות לכידת זיקה פפטידית. ההליך הנוכחי מתאר את קביעת הסמן הביולוגי סרטן ריאות של תאים קטנים (SCLC), פפטיד משחרר פרוגסטרין (ProGRP), בסרום מיובש (הן DSS והן VAMS). נהלים מפורטים להכנת חרוזים מקלים על יישום זרימת העבודה ביישומים חדשים או במעבדות אחרות. הוכח כי התוצאות עשויות להיות תלויות בחומר הדגימה; עבור הפרויקט הנוכחי, נצפו עוצמות אות גבוהות יותר עבור דגימות שנאספו באמצעות VAMS בהשוואה ל- DSS.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרו-דגימה קיימת כבר יותר מ-100 שנה מאז שאיוור באנג תיאר ניטור סוכר מ-DBS ב-19131. לאחר שגאת'רי וסוזי הציגו DBS בשנת 1963 לקביעת פנילאלנין בתינוקות2, הטכניקה הפכה נפוצה יותר ויותר. הדיווחים הראשונים של DBS לדגימה ואחסון של חלבונים נעשו בתחילת שנות השבעים3,4, ועשור לאחר מכן, בשנות השמונים, מצאנו את הדו"ח הראשון של ספקטרומטריית מסות (MS) לקביעת חלבונים מ- DBS5. למרות הקדמה מוקדמת זו, רק לאחר תחילת המאה הפכה קביעת טרשת נפוצה של חלבונים מ- DBS וטכניקות מיקרו-דגימה אחרות לנפוצה יותר.

בהקשר קליני, יש עניין לקבוע חלבונים באבחון ומעקב אחר מחלות, כמו גם למטרות ניטור טיפול וסימום. קביעה ממוקדת זו של אנליטות חלבונים על ידי טרשת נפוצה מכמויות קטנות של דגימות מיובשות עדיין מאתגרת, ולעתים קרובות דורשת הכנת דגימות נרחבת לפני הניתוח.

קביעה כמותית ממוקדת של חלבונים על ידי טרשת נפוצה מבוצעת בדרך כלל על ידי יישום הגישה מלמטה למעלה, עיכול החלבונים לפפטידים לפני הניתוח. הליך זה מייצר מספר עצום של פפטידים, מה שהופך את הניתוח הישיר של הדגימה הביולוגית המעוכלת למאתגר. דרך לעקוף זאת היא ליישם שלב ניקוי זיקה סלקטיבי לפני ניתוח טרשת נפוצה לפני או אחרי העיכול 6,7,8. בדרך זו, החלבון המעניין (או הפפטיד הפרוטאוטיפי שלו, אם שלב לכידת הזיקה מבוצע לאחר העיכול) מבודד באופן סלקטיבי ממטריצת הדגימה לפני הניתוח, ומספק גבולות זיהוי נמוכים יותר9.

למיקרו-דגימה באמצעות כרטיסי DBS יש יתרונות מסוימים בהשוואה לדגימות דם קונבנציונליות, כולל נפח דגימה נמוך, דגימה פחות פולשנית ויציבות אחסון מוגברת. עם זאת, מטריצת הדגימה שונה ויכולה להציג אתגרים אחרים בניתוח (למשל, מטריצת דגימה מיובשת לעומת נוזלית ודם נימי לעומת סרום או פלזמה)10,11. אתגר נוסף שנצפה עם DBS הוא מה שנקרא אפקט המטוקריט, שבו המטוקריט הדם משפיע על נפח המדגם מעובד עוד יותר לניתוח, ולכן מציג שונות בין-אישית בניתוח12. יחידות מיקרו-דגימה חדשות יותר, כגון VAMS שהוצגו בשנת 201413, מטפלות בבעיה זו על ידי איסוף נפח קבוע של דם במקום טיפת דם.

פרוטוקול זה מתאר מערך לניתוח סמנים ביולוגיים בשפע נמוך ממיקרו-דגימות מיובשות. לאחר ההדבקה, הדגימה המיובשת מתעכלת, ולאחר מכן, הפפטיד הפרוטאוטיפית מבודד על ידי לכידת זיקה פפטידית. ניתוח המודל הוא הסמן הביולוגי SCLC ProGRP. מכיוון שלא ניתן לקבוע ProGRP באופן אמין מדם שלם, הסרום שימש כמטריצת הדגימה. מוצגות תוצאות מייצגות הן של DSS והן של דגימות סרום שנאספו באמצעות VAMS.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרום מתורמי דם בריאים שימש להכנת פתרונות סטנדרטיים. השימוש בסרום מתורמי דם בריאים בוצע בהתאם לחוק הנורבגי. התקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים. דגימות הסרום נותחו בשיטות בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. הפרוטוקול המתואר הוא גרסה שונה של השיטה שתוארה בעבודה קודמת14. סקירה כללית של הרכב המאגרים והתמיסות ואופן הכנתם ניתן למצוא בטבלה משלימה S1, בעוד שטבלת החומרים מכילה חומרים, ציוד וריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים

  1. חישוב כמות הנוגדנים הדרושה להכנת מספר החרוזים הרצוי. יש להשתמש ב-1 מ"ג נוגדן לכל 50 מ"ג חרוזים מגנטיים.
    הערה: בדרך כלל, 20 μL של תרחיף חרוזים 20 מ"ג / מ"ל משמש לכל דגימה בניסויים הבאים (ראה שלב 5.1).
  2. חשב את נפח הנוגדנים הדרוש להכנת מספר החרוזים הרצוי.
    הערה: נפח הנוגדנים תלוי בריכוז הנוגדנים ויש לחשב אותו עבור כל נוגדן.
  3. העבר את הנפח הרצוי של תמיסת נוגדנים לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון 5 מ"ל. לדוגמה, אם תמיסת הנוגדנים מכילה נוגדן 1 מ"ג/מ"ל, השתמש ב-0.4 מ"ל להכנת 1.0 מ"ל של תרחיף חרוזים (20 מ"ג חרוזים/מ"ל עם 1 מ"ג נוגדן/50 מ"ג חרוזים).
    הערה: הנוגדנים צריכים להיות במאגר ללא אמין. השתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגות דלות חלבון עבור כל התמיסות המכילות חלבונים כדי למנוע אובדן אנליט עקב ספיחה.
  4. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי קטן לתמיסת הנוגדנים וכווננו את רמת החומציות ל-2.5 תוך ערבוב מתמשך. השתמש במד pH עם מיקרו אלקטרודה כדי למדוד את ה- pH ולהתאים את ה- pH על ידי הוספה מדורגת של נפחים מוגדרים של 1.0 M HCl (התחל על ידי הוספת חלקים של 10 μL של 1.0 M HCl והפחת את עוצמת הקול ככל שה- pH מתקרב ל- 2.5). רשום את הנפח הכולל של 1.0 M HCl הדרוש כדי להתאים את ה- pH ל -2.5.
  5. הסר את אלקטרודת המיקרו ודגר על הנוגדן החומצי על קרח על מערבל מגנטי למשך שעה אחת.
    הערה: טיפול חומצי בנוגדן מבוצע כדי לקדם את הכיוון הנכון של הנוגדנים על החרוז. ניתן להפחית את ריכוז ה-HCl ל-0.5 M או 0.2 M HCl, בהתאם לריכוז החיץ בתמיסת הנוגדנים.
  6. נטרול תמיסת הנוגדנים. השתמש במד pH עם אלקטרודת מיקרו כדי למדוד את ה- pH ולהתאים את ה- pH ל- 7 על ידי הוספה מדורגת של נפחים מוגדרים של 1.0 M NaOH (התחל עם חלק של 10 μL והפחת את הנפח ככל שה- pH מתקרב ל- 7). רשום את הנפח הכולל של 1.0 M NaOH הוסיף.
    הערה: ריכוז NaOH צריך להיות זהה לריכוז HCl המשמש בשלב 1.4. NaOH הוא קורוזיבי מאוד; יש להשתמש בציוד מגן, כולל כפפות והגנה מתאימה לעיניים.
  7. חשב את הנפח הרצוי של חרוזים מגנטיים מופעלים טוסיל לשימוש.
    הערה: בדרך כלל, מומלץ להשתמש 20 מ"ג חרוזים/מ"ל בעת ביצוע צימוד בקנה מידה קטן. יש להשתמש במינימום של 5 מ"ג חרוזים.
  8. מערבבים היטב את תרחיף החרוזים המגנטי על מערבל מערבולת ומוציאים נפח המכיל את הכמות הרצויה של תרחיף חרוזים. לדוגמה, כדי להכין 1 מ"ל של השעיית חרוזים, למשוך נפח המכיל 20 מ"ג של חרוזים (667 μL אם ריכוז החרוזים הוא 30 מ"ג / מ"ל).
  9. הניחו את מתלה החרוזים על מדף מגנטי למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנטנט. לשטוף את החרוזים 2x עם נפח שווה של סוג 1 H2O (667 μL אם תמיסת חרוזים 30 מ"ג / מ"ל משמש להכנת 1 מ"ל של 20 מ"ג / מ"ל חרוזים מצופים נוגדנים). מערבבים באמצעות מערבל מערבולת לאחר כל תוספת של תמיסת כביסה ומניחים על המדף המגנטי למשך דקה אחת לפני הסרת הסופרנטנט.
  10. הוסף את הדברים הבאים לחרוזים המגנטיים: נוגדן מטופל בחומצה, חיץ בוראט 0.5 M (pH 9.5) (1/5 מהנפח הכולל מכיוון שהריכוז הסופי צריך להיות 0.1 M; זה שווה ל- 0.2 מ"ל להכנת 1 מ"ל של תרחיף חרוזים), ומאגר צימוד לצימוד נוגדנים (להכנת 1 מ"ל של חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים, נפח מאגר הצימוד צריך להיות שווה ל- 1 מ"ל - נפח נוגדן מטופל בחומצה - 0.2 מ"ל מאגר בוראט). מערבבים באמצעות מערבל מערבולת.
    הערה: נפח הנוגדן שטופל בחומצה שווה לנפח תמיסת הנוגדנים (0.4 מ"ל בהכנת 1 מ"ל של תרחיף חרוזים באמצעות תמיסת נוגדנים של 1 מ"ג/מ"ל) + נפח של 1.0 M HCl המשמש להתאמת ה- pH ל- 2.5 + נפח של 1.0 M NaOH המשמש להתאמת ה- pH ל- 7).
    הערה: ניתן למצוא את ההרכב של חיץ בוראט 0.5 M (pH 9.5) וחיץ צימוד לצימוד נוגדנים בטבלה משלימה S1.
  11. סובבו בטמפרטורת הסביבה למשך הלילה באמצעות מערבל דוגמיות מקצה לקצה, רצוי עם סיבוב ורטט הדדיים.
  12. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 239 × גרם. מניחים את הצינור על המגנט למשך 2 דקות ומסירים את הסופרנטנט.
  13. שטפו את החרוזים 2 x 2 שעות ופעם אחת למשך הלילה על ידי סיבוב במאגר האחסון לחרוזי נוגדנים בטמפרטורת הסביבה באמצעות מערבל דגימות מקצה לקצה. השתמש באותו אמצעי אחסון כמו אמצעי האחסון הכולל בשלב 1.10. מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת ומסירים את הסופרנאטנט בין כל כביסה.
    הערה: ניתן למצוא את הרכב מאגר האחסון עבור חרוזי נוגדנים בטבלה משלימה S1.
  14. יש לאחסן במאגר הרצוי (למשל, אותו מאגר כמו בשלב 1.13) באמצעות ריכוז המלאי הרצוי של חרוזים (בדרך כלל 20 מ"ג/מ"ל). מאחסנים במקרר.

2. הכנת 2 מ"ל של חרוזי טריפסין משותקים (20 מ"ג / מ"ל חרוזים)

  1. הוסף 20 מ"ל של 1 מ"ל HCl ל -2 מ"ל של חרוזי אגרוז המופעלים על ידי NHS כדי לשטוף את החרוזים.
  2. מערבבים וצנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.
  3. הוסף 20 מ"ל של חיץ פוספט 0.1 M (pH 7.8). מערבבים בעזרת מערבולת מערבולת וצנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.
    הערה: ניתן למצוא את ההרכב של חיץ פוספט 0.1 M (pH 7.8) בטבלה משלימה S1.
  4. הוסף 2 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל טריפסין (מומס במאגר צימוד קר לצימוד טריפסין).
    הערה: ניתן למצוא את הרכב חיץ הצימוד לצימוד טריפסין בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר.
  5. יש לדגור במשך 25 דקות ב-22°C וב-1,100 סל"ד באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה. צנטריפוגה בעוצמה של 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.
  6. הוסף 2 מ"ל של חיץ שינוי להכנת חרוזי טריפסין ודגר במשך 20 דקות ב 22 ° C ו 1,100 סל"ד באמצעות מערבל מבוקר טמפרטורה. צנטריפוגה בעוצמה של 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.
    הערה: הרכב חיץ השינוי להכנת חרוזי טריפסין ניתן למצוא בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר.
  7. מוסיפים 10 מ"ל של חיץ חוסם להכנת חרוזי טריפסין ודגרים במשך 10 דקות ב-22°C וב-1,100 סל"ד באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה. צנטריפוגה בעוצמה של 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.
    הערה: הרכב החיץ החוסם להכנת חרוזי טריפסין ניתן למצוא בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר.
  8. מוסיפים 2 מ"ל של מאגר אחסון, מערבבים באמצעות מערבל מערבולת ומאחסנים במקרר עד לשימוש.
    הערה: ניתן למצוא את הרכב מאגר האחסון עבור חרוזי טריפסין בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר.

3. דגימת DSS/VAMS ומיצוי לאחר מכן של סרום מיובש

  1. הכינו תקנים על ידי הקפצת הסרום עם ProGRP (או החלבון המעניין) ברמה המתאימה. שמור על נפח הזינוק ≤ 1% מעוצמת הקול הכוללת.
    הערה: כאן, תמיסת מלאי של 295 מיקרוגרם / מ"ל ProGRP במים שימשה להכנת תקני סרום ספייק.
  2. מערבבים את התקנים על מערבל מערבולת.
  3. יש למרוח 10 μL של סרום (תקני ספייק) על כרטיסי DBS או לאפשר איסוף של 10 μL של סרום על ידי VAMS (10 μL) באמצעות הנחיות היצרן. עבור DSS, ודא שהנקודה נמצאת בתוך העיגול המנוקד.
  4. יש לייבש באוויר בטמפרטורת הסביבה למשך שעתיים לפחות.
  5. חתכו את כל המקום והעבירו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 2 מ"ל או הסירו את ה-VAMS מהמחזיק והניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 2 מ"ל.
  6. הוסף 1,000 μL של 100 mM תמיסת אמוניום ביקרבונט (ABC). יש לחלץ את הסרום המיובש מהנקודה/VAMS למשך שעה אחת ב-22°C באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה ב-1,000 סל"ד.
  7. העבירו את התמצית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל דל חלבון עבור פרוטאוליזה טריפטית.

4. עיכול תמציות DSS/VAMS

  1. השתמש 30 μL של חרוזי טריפסין (כפי שהוכן בסעיף 2) לכל דגימה. העבירו נפח המכיל חרוזי טריפסין לכל הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל דל חלבון, צנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות, והוציאו את הסופרנטנט.
  2. לשטוף את חרוזי טריפסין 2x עם 1 מ"ל של קר 50 mM ABC, לפני resuspending באותו נפח כי היה pipeted החוצה. צנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות ולהסיר את הסופרנאטנט בין השלבים.
  3. הוסף 30 μL של חרוזי טריפסין שטופים לכל תמצית DSS/VAMS כדי להתחיל את העיכול.
  4. יש לדגור במשך שעתיים ב-37°C וב-1,000 סל"ד באמצעות מערבל מבוקר טמפרטורה או דומה. צנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות ומעבירים את הסופרנאטנט (לא חרוזים) לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 2.0 מ"ל דל חלבון.
  5. הוסף 25 μL של 14 ng/mL תמיסת תקן פנימית (IS) המכילה את הפפטיד ALGNQQQPSWDSEDSSNF [K_13C6_15N2] בתמיסת ABC של 100 mM.

5. לכידת פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים

  1. יש להשתמש ב-20 מיקרוליטר של חרוזים מצופים נוגדנים (20 מ"ג/מ"ל כפי שהוכן בסעיף 1) לכל מיצוי. העבירו את כל החרוזים המצופים בנוגדנים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל עם קשירת חלבונים נמוכה, הניחו על המגנט למשך דקה אחת והסירו את מאגר האחסון.
  2. שטפו את החרוזים המצופים בנוגדנים מגנטיים עם 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4, המכיל 0.05% פוליסורבט 20, ו-2 x 1 מ"ל של PBS לפני השעיה מחדש באותו נפח שהוצא החוצה. מערבבים על מערבל מערבולת ומניחים על המגנט למשך דקה אחת בין חילופי חיץ.
    הערה: PBS מכיל 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4ו- 1.8 mM KH2PO4. מומלץ להכין את התמיסה בריכוז של פי 10 ליציבות מוגברת. להרכב של 100 מ"ל של 10x PBS, ראה טבלה משלימה S1. דילול של 10x PBS 10x ישיג pH של ~7.4.
  3. הוסף 20 μL של תרחיף חרוזים מגנטי שטוף לכל צינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון המכיל תמצית DSS/VAMS מעוכלת ו- IS. בצעו מיצוי חיסוני במשך שעה באמצעות מערבל דגימות מקצה לקצה בטמפרטורת הסביבה.
  4. שטפו את החרוזים המגנטיים באמצעות התמיסות הבאות: 500 μL של PBS עם 0.05% (v/v) פוליסורבט 20, 400 μL של PBS, 300 μL של 10 mM Tris HCl (pH 7.4), ו-300 μL של 100 mM ABC.
    1. לאחר הוספת כל תמיסת שטיפה, הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה דל החלבון עם חרוזים ותמיסת שטיפה ממדף המגנטים והפוך בזהירות עד להומוגני. לאחר מכן, הניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה דל החלבון על המגנט למשך 30 שניות, הפכו למשך 30 שניות והניחו על המגנט למשך דקה אחת. הסירו את תמיסת הכביסה.
    2. סובבו מטה את המתלים הנותרים באמצעות מיקרוצנטריפוגה. מניחים על המגנט למשך דקה אחת ומסירים את תמיסת הכביסה שנותרה.
  5. הוסף 15 μL של 2% (v/v) חומצה פורמית מסוג 1 H2O לכל דגימה ודגרה במשך 5 דקות ב 22 ° C ו 1,000 סל"ד באמצעות מערבל מבוקר טמפרטורה, או דומה, כדי לנטרל את הפפטידים שנלכדו. מניחים על המגנט למשך דקה אחת ומעבירים את הפולט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל בעל קשירת חלבונים נמוכה. חזור על הפעולה פעם אחת והעבר את הפולט השני לאותו צינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון כמו הראשון.
  6. הוסף 20 μL של 100 mM ABC לכל פליטה (נפח כולל של 50 μL).
  7. צנטריפוגה (מיקרוצנטריפוגה) ולהעביר 40 μL של eluate למיקרו תוספות עבור בקבוקונים של כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלי ביצועים גבוהים.

6. ניתוח על ידי LC-MS/MS

  1. השתמש ב- micro LC triple quadrupole MS עם יינון אלקטרוספריי לחוסן גבוה.
  2. הכן את מערכת LC-MS/MS לניתוח על ידי ניקוי המשאבות עם שלב A נייד (20 mM FA ב- H 2 O ו- MeCN, 95: 5 v/v) ו- B (20 mM FA ב- H2O ו- MeCN, 5: 95 v/v).
  3. הכנס את העמודה האנליטית (C18, קוטר פנימי של 50 מ"מ x 1 מ"מ [ID], חלקיקי 3 מיקרומטר).
  4. המשך להכין את המכשיר לניתוח על ידי ביצוע הליכי ההפעלה של המכשיר הספציפי.
  5. בתוכנת המכשיר, הגדר את טמפרטורת תנור העמודים ל- 25 מעלות צלזיוס ואת קצב הזרימה ל- 50 מיקרוליטר לדקה (100% שלב A נייד).
  6. אזן את העמודה עם שלב A נייד למשך 15 דקות לפחות.
  7. מקם את הדגימות בדוגם האוטומטי.
  8. הכן את שיטת המכשיר לניתוח של הפפטיד הטריפטי הספציפי ל- ProGRP ALGNQQPSWDSEDSSNFK, וה- IS.
    הערה: מספר פרמטרים של שיטה הם ספציפיים למכשיר ויש למטב אותם במכשיר הספציפי שבו נעשה שימוש. פרטים על פרמטרי השיטה המשמשים כאן מתוארים בשלבים 6.9 עד 6.11.
  9. עבור תוכנית השיפוע ב- LC, השתמש בהגדרות הבאות: קצב זרימה: 50 מיקרוליטר לדקה; מזמן 0.0 עד 3.0 דקות: 100% נייד שלב A; מזמן 3.0 עד 18.0 דקות: הפעל מעבר צבע ליניארי מ- 0% ל- 50% שלב B נייד; מזמן 18.0 עד 18.1 דקות: הגדל את שלב B הנייד מ- 50% ל- 100%; מזמן 18.1 עד 20.0 דקות: 100% נייד שלב B; מזמן 20.0 עד 20.1 דקות: הפחתת שלב B נייד מ- 100% ל- 0%; מזמן 20.1 עד 30 דקות: 100% נייד שלב A כדי לאזן מחדש את העמודה (השתמש באמצעי אחסון של 10 עמודות לפחות).
  10. עבור הגדרות MS/MS, הפעל את MS/MS במצב חיובי באמצעות הגדרות התקן המבטיחות יינון יעיל. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במתח ריסוס של +4,000 V, טמפרטורת נימים מחוממת של 270 ° C, חנקן כגז גיליון (5 יחידות שרירותיות), וארגון (2 mTorr) עבור פיצול דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID). אם המכשיר מאפשר, כוון את זרימת ה- LC לבזבז את 2 הדקות הראשונות (0-2 דקות) ואת הדקה האחרונה (29-30 דקות) של הריצה, במקום לתוך MS.
  11. השתמש במעברי ניטור תגובה נבחרים (SRM) עבור (A) פפטיד החתימה (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1,005.45→913.3, 1,005.45→1,028.3 ו- 1,005.45→1,398.5, וכן (B) פפטיד IS SIL (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1,009.45→921.3, 1,009.45→1,036.3 ו- 1,009.45→1,406.5. השתמש באנרגיית התנגשות ממוטבת (35 V בפרוטוקול זה) עבור כל המעברים המנוטרים.
  12. הכן רצף המכיל את הדגימות שיופעלו באמצעות התוכנה הזמינה עבור מערכת LC-MS/MS. הגדר את נפח ההזרקה ל- 10 μL.
    הערה: הקפד להוסיף דוגמאות ריקות ודוגמאות בקרת איכות לפי הצורך.
  13. לחץ על "הפעל רצף" בתוכנת המכשיר כדי להתחיל את הרצף.
  14. נטר את אזור השיא של הפפטיד הטריפטי ALGNQQQPSWDSSNFK שנלכד על ידי זיקה, ספציפי ל-ProGRP, ופפטיד IS SIL שלו.
    הערה: בחירה ואישור של פפטיד החתימה, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, מתואר במקום אחר14.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה כללית של זרימת העבודה האנליטית באמצעות דגימת DSS ו- VAMS מוצגת באיור 1. למעט ההבדלים בשיטת הדגימה, הנהלים זהים. תמונות של הסרום שנדגם באמצעות שתי שיטות הדגימה ניתן לראות באיור 2.

שתי צורות הדגימה (VAMS ו-DSS) מתאימות לדגימה של סרום המכיל ProGRP. ניתן לראות זאת באיור 3 , שם כרומטוגרמות טרשת נפוצה של הפפטיד הפרוטאוטיפי ופפטיד IS SIL מדגימת DSS ו-VAMS מוצגות. בנוסף, כרומטוגרמה MS לאחר ניתוח של מדגם בקרה המורכב מ 10 μL של דגימת סרום נוזלי ספייק מעובד באותו אופן כמו דגימות מיובשות כלול. האחרון דולל באותו נפח כמו נפח תמיסת מיצוי DSS/VAMS, עבר עיכול באמצעות חרוזי טריפסין ונוקה באמצעות לכידת זיקה פפטידית.

בהשוואה בין דגימת VAMS לדגימת DSS (איור 4), VAMS מספק יחס שטח פפטיד פרוטאוטיפי / IS גבוה יותר מאשר DSS. זה מצביע על כך שייתכן אובדן של חלבון המטרה ProGRP לנייר המשמש ל- DSS (תאית טהורה). בהשוואה לדגימת ביקורת, שבה הסרום אינו מיובש לפני עיבוד וניתוח נוספים (איור 4), נראה כי VAMS מספק יחסי שטח דומים לדגימת הבקרה (מבחן t דו-זנבי, עמ≤ 0.65), מה שמצביע על כך שאין אובדן לחומר הדגימה, בעוד ש-DSS מספק יחס שטח נמוך משמעותית (מבחן t דו-זנבי, עמ' ≤ 0.005), המציין אובדן לחומר הדגימה.

הערכה קצרה בוצעה באמצעות VAMS. לינאריות הוצגה בין 10 ל-1,000 ננוגרם/מ"ל (R2 = 0.9996), עם גבול זיהוי (LOD, S/N = 3) של 6.7 ננוגרם/מ"ל. ה- LOD נחשב משביע רצון מכיוון שהניתוח בוצע על מרובע משולש ישן למדי (2008) עם עמודת זיהוי של 1 מ"מ. יכולת החזרה של כל הרמות עם S/N > 10 נחשבה גם היא משביעת רצון עם RSD בין 7% ל -17% (n = 3), באמצעות תיקון IS.

לכידת זיקה יכולה להתבצע לפני ואחרי שלב העיכול על ידי לכידת החלבון המעניין או הפפטיד הפרוטאוטיפי שלו. ההליך הנוכחי מתאר לכידת זיקה פפטידית. יתרון של גישה זו בהשוואה ללכידת חלבונים הוא שרק הפפטיד המעניין נלכד, וניקוי דגימה יעיל עוד יותר מושג. זה מודגם באיור 5, המראה כרומטוגרמה מורכבת יותר של סריקה מלאה עם יותר רעש לאחר לכידת חלבונים בהשוואה לאחר לכידת פפטידים. הדגימות שנותחו באיור 5 לא נדגמו באמצעות דגימת DSS או VAMS; עם זאת, הסרום הוא גם מטריצת הדגימה, ולכידת זיקה מבוצעת באמצעות אותו נוגדן המשמש ללכידת פפטיד בהליך המתואר.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של זרימת העבודה האנליטית באמצעות דגימת DSS ו-VAMS. קיצורים: DSS = כתם סרום מיובש; VAMS = מיקרו-דגימה סופגת נפחית; LC-MS/MS = כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תמונות של סרום שנדגמו בשיטות שונות . (A) כרטיס תאית DBS ו-(B) VAMS. קיצורים: DBS = כתם דם יבש; VAMS = מיקרו-דגימה סופגת נפחית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: כרומטוגרמות טרשת נפוצה מייצגות של הפפטיד הפרוטאוטיפי ופפטיד IS SIL לאחר דגימת DSS ו-VAMS, כמו גם דגימת סרום ספייק שנוספה ישירות לתמיסת החילוץ. הכרומטוגרמות של טרשת נפוצה מראות דגימות של 10 μL בסרום עם 1.5 מיקרוגרם/מ"ל של ProGRP ומוחלות על (A) VAMS, (B) כרטיס הדגימה של התאית (עבור DSS), או (C) ישירות על מאגר המיצוי (דגימת בקרה). עשרים וחמישה מיקרוליטר של 14 ננוגרם/מ"ל הוא פפטיד סיל שנוסף לכל הדגימות לפני לכידת זיקה פפטידית. קיצורים: DSS = כתם סרום מיובש; VAMS = מיקרו-דגימה סופגת נפחית; MS = ספקטרומטריית מסות; ProGRP = פפטיד משחרר פרוגסטרין; IS = תקן פנימי; SIL = איזוטופ יציב מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תוצאות מייצגות של יחס השטח ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS עבור דגימות סרום עם ProGRP והוחלו (10 μL) על VAMS, DSS או ישירות על תמיסת מיצוי (דגימת ביקורת). ריכוז ProGRP הוא 1.5 מיקרוגרם/מ"ל, n = 4 לכל מצב; 25 μL של 14 ng/mL הוא פפטיד SIL מתווסף לכל הדגימות לפני לכידת זיקה פפטידי. *מציין כי יחס השטח שונה באופן משמעותי מדגימות שהוחלו על VAMS ( מבחן t דו-זנבי, p≤ 0.005). קווי שגיאה הם ± סטיית תקן. קיצורים: DSS = כתם סרום מיובש; VAMS = מיקרו-דגימה סופגת נפחית; ProGRP = פפטיד משחרר פרוגסטרין; IS = תקן פנימי; SIL = איזוטופ יציב מסומן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: השוואה בין כרומטוגרמות שיא בסיס (ניתוח אורביטרפ סריקה מלאה) לאחר מיצוי חלבון שלם (כחול) ומיצוי פפטיד אפיטופ פרוטאוטיפי (אדום). כרומטוגרמות יונים שחולצו של פפטיד אפיטופ פרוטאוטיפי (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) מוצגות מימין. סרום עם 150 ng mL−1 ProGRP שימש כדגימה. איור זה הודפס מחדש מתוך Levernæs et al.14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה S1: סקירה כללית של הרכב המאגרים והפתרונות ואופן הכנתם. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר מכיל מידע על אופן ביצוע מספר שלבים חשובים בניתוח סמנים ביולוגיים בשפע נמוך ממיקרו-דגימות מיובשות (DSS ו-VAMS), כולל הכנת חרוזי טריפסין וחרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. בהתבסס על ניסיון קודם, אנו תמיד מטפלים בנוגדן עם חומצה לפני אימוביליזציה של חרוזים כדי לשפר את כיוון הנוגדנים15.

אחד השלבים הקריטיים בהליך זה הוא בחירת פורמט המיקרו-דגימה המתאים ביותר. ראשית, יש לשקול אם ניתן לקבוע את האנליט המדובר מדם שלם, או אם הריכוז מושפע מתאי הדם ויש לקבוע אותו בסרום או בפלזמה (באשר לניתוח המודל, ProGRP).

לשתי הגישות המבוססות על נייר ופולימרים יש יתרונות ומגבלות; עבור ProGRP, VAMS מספק יתרון ברור ביחס להתאוששות אנליטית לאחר חילוץ מהדוגם. עם זאת, ניתן כנראה למטב זאת באמצעות פתרון חילוץ שונה עבור דגימות DSS. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון אינטראקציה פוטנציאלית זו בין האנליטי לבין חומר הדגימה מכיוון שהיא עלולה לגרום לשונות אנליטית מוגברת ולמגבלות גילוי גבוהות יותר. מכיוון שה- IS המשמש הוא פפטיד SIL ונוסף לראשונה לאחר העיכול, IS מתקן את השלבים הבאים לאחר העיכול (למשל, מיצוי זיקה וניתוח LC-MS/MS). תיקון IS אינו אפשרי עבור חילוץ מ DSS/VAMS ואת שלב העיכול.

שני סוגים של חרוזים משמשים בהליך: חרוזי טריפסין לעיכול לאחר מיצוי דגימת הסרום מהדוגם, וחרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים ללכידת הפפטיד הפרוטאוטיפית לאחר העיכול. סיבה עיקרית לשימוש בחרוזי טריפסין, בנוסף להאצת העיכול, היא כדי למזער את פעילות הטריפסין השיורית בדגימה במהלך לכידת הזיקה. זה חשוב כדי למנוע פרוטאוליזה טריפטית של mAb במהלך לכידת אהדה.

חרוזי אגרוז שימשו להכנת חרוזי טריפסין, ואילו חרוזים מגנטיים שימשו להכנת חרוזים מצופים נוגדנים. חרוזי אגרוז זולים יותר מחרוזים מגנטיים אך יש להם מגבלה שהפרדת החרוזים מהתמיסה דורשת צנטריפוגה. זה הופך את ההפרדה של חרוזים וסופרנאטנט לפחות יעילה מאשר בשימוש בחרוזים מגנטיים. בנוסף, אוטומציה של זרימת העבודה קשה באמצעות חרוזים agarose. עם זאת, חרוזים מגנטיים המופעלים על ידי NHS זמינים וניתן להשתמש בהם לזרימת עבודה יעילה ואוטומטית יותר להכנת דגימות.

מיקרו-דגימה היא מגמה חשובה בביואנליזה של תרופות וסמנים ביולוגיים. אתגר אחד בגישה הנוכחית הוא הכמות המוגבלת של נפח הדגימה (10 μL), אשר עשוי להיות בעל חשיבות מיוחדת בקביעת אנליטים בעלי שפע נמוך מאוד כגון ProGRP (pg/mL-low ng/mL level). עם זאת, ניתן לעקוף אתגר זה באמצעות ציוד אנליטי חדיש. עבור אנליטים אלה בעלי שפע נמוך, הבחירה בהכנת הדגימה היא קריטית, וניקוי דגימה סלקטיבי באמצעות לכידת זיקה מבוססת נוגדנים נדרש לרוב. מכיוון שלכידת פפטיד הוכחה כמספקת תמציות נקיות יותר ומגבלות זיהוי נמוכות יותר מאשר לכידת חלבונים (באמצעות אותו נוגדן)14, השיטה הנוכחית מתמקדת בגישה זו בשילוב עם מיקרו-דגימה. יתרון נוסף של גישת לכידת הפפטידים הוא שפפטיד IS SIL מתקן גם עבור שלב לכידת הזיקה.

בעבודה זו, נוגדן המכוון לחלבון שימש ללכידת פפטידים. זהו יתרון מכיוון שהזמינות של נוגדני מדף המכוונים לחלבונים גבוהה יותר מאשר נוגדני מדף המכוונים לפפטידים פרוטאוטיפיים. עם זאת, כדי שנוגדן אנטי-חלבוני יוכל ללכוד ביעילות פפטיד פרוטאוטיפי, האפיטופ צריך להיות שלם לאחר עיכול החלבון. בנוסף, עבור נוגדנים רבים, האפיטופ המדויק אינו ידוע, מה שהופך את החיפוש אחר נוגדן אנטי חלבון מייגע. זה מגביל את מספר הנוגדנים האנטי-חלבוניים הזמינים המתאימים ללכידת פפטידים. ההליך המתואר מודגם באמצעות סרום כמטריצה ו- ProGRP כניתוח המטרה. ההליך נועד להיות ישים על מטריצות אחרות וניתוחי מטרה אחרים. במקום להשתמש בנוגדן אנטי-חלבוני זמין מסחרית ללכידת זיקה של הפפטיד הפרוטאוטיפי, ניתן להשתמש גם בנוגדנים אנטי-פפטידים בהתאמה אישית. יעילות הניקוי של לכידת פפטידים בהשוואה ללכידת חלבונים מודגמת באיור 5. על ידי החלפת חרוזי אגרוז המשמשים להכנת חרוזי טריפסין בחרוזים מגנטיים, ההליך צריך להיות תואם גם לתחנות עבודה להכנת דגימות רובוטיות בשוק.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מאוד לפרופ' אליזבת פאוס מבית החולים הנורבגי רדיום (בית החולים האוניברסיטאי של אוסלו, אוסלו, נורבגיה) על מתן תקן ProGRP והנוגדן החד-שבטי נגד ProGRP, M18. דמי הפרסום כוסו על ידי מענק מ-Apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen ו- Léon Reubsaet הם שותפים בקונסורציום הרשת הלאומית של תשתיות פרוטאומיקה מתקדמות (NAPI), הממומן על ידי תוכנית INFRASTRUKTUR של מועצת המחקר של נורבגיה (מספר פרויקט: 295910).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטית N-hydroxysuccinimide esterCarbosynt (Staad, שוויץ)FA33719יש לאחסן במקפיא מתחת ל-20 מעלות; C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6
_15N2] (≥ 95%)		Innovagen (לונד, שוודיה)לא ישיםאחסן במקפיא מתחת ל-20 מעלות; C
אמוניום ביקרבונט BioUltra (≥ 99.5%)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)09830-500G
Aquasil C18 עמודה, 3 ומיקרו; m, 50 מ"מ x 1 מ"מThermo scientific (וולת'ם, MA, ארה"ב)77503-051030עמודה אנליטית תואמת ל-100% פאזה ניידת מימית
בנזמידין (≥ 95.0%)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)12072יש לאחסן במקרר בטמפרטורה של 2-6 מעלות; C
קלסיום כלוריד דיהידרט  (> 99%)Sigma Aldrich (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)223506-500G
צנטריפוגה 5804Eppendorf (המבורג, טיסקלנד)5804000010
ProGRP משובט איזופורם 1בית חולים רדיום, בית החולים האוניברסיטאי אוסלו (אוסלו, נורבגיה)לא ישיםיש לאחסן במקפיא מתחת ל-20 מעלות; C
דיסודיום הידרוגנפוספט דיהידראט (פרו-אנליזה) סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)30435-500G
דיסודיום מימן-פוספט דודקהידראט (פרו-אנליזה) Merck (דרמשטדט, טיסקלנד)1.06579.0500
Dynabeads M-280 tosylactivated 10 מ"לInvitrogen (קרלסבד, ארה"ב)14204יש לאחסן במקרר בטמפרטורה של 2-6 מעלות; C
DynaMag-2Invitrogen (קרלסבד, ארה"ב)123-21D
אתנולמין (פרו-אנליזה, ≥ 99%)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)#02400
חומצה פורמית (≥ 99%) עבור LC-MSVWR INTERNATIONAL (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב)84865.260
כרטיס תאית FTA DMPK-CWhatman (קנט, בריטניה)WB129243כרטיס
DBSבקבוקוני HPLC, זכוכית שקופה, 1.5 מ"ל, 32 x 11.6 מ"מ, חבילה נקייהNerliens Meszansky (אוסלו, נורבגיה)LPP 11 09 0519
מערבל דגימה של HulamixerInvitrogen (קרלסבד, ארה"ב)101561503016מערבל לדוגמה עם ערבוב מקצה לקצה וסיבוב הדדי ורטט
סרום אנושי מתורמי דם בריאיםBloodbank, Ullevå l, בית החולים האוניברסיטאי אוסלו (אוסלו, נורבגיה)לא ישיםיש לאחסן במקפיא מתחת ל-20 מעלות; C
אידוי חומצה הידרוכלורית 37% (Emsure לניתוח)Merck (דרמשטדט, טיסקלנד)1.00317.1000
מערכת LC-MS/MS: מערכת Ultimate 3000 (דגימה אוטומטית, WPS-3000TRS; מיקרו-משאבה, גפ"מ-3400M; מנהל זרימה, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) וגישה קוונטית TSQ. נשלט על ידי Xcalibur 2.2 SP1.48Thermo scientific (וולת'אם, MA, ארה"ב)לא ישים
LiChrosolv Acetonitrile hypergrade עבור LC-MSMerck (דרמשטדט, טיסקלנד)1.00029.2500
LL Biotrode, אלקטרודת זכוכית משולבתMetrohm (Herisau, Sveits)6.0224.100
מערבל מגנטי, סוג M10Franz Morat KG (אייזנבאך, גרמניה)10236
תוספות מיקרו, זכוכית (31 x 6 מ"מ, 0.1 מ"ל)VWR International (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב)548-0006
MilliQ אינטגרל 3 עם Q-PODMerck Millipore (מולסהיים, צרפת)ZRXQ003T0לייצור
נוגדן חד שבטיM18 בית החולים רדיום, בית החולים האוניברסיטאי אוסלו (אוסלו, נורבגיה)לא ישיםיש לאחסן במקרר בטמפרטורה של 2-6 מעלות; C
Neoteryx Mitra מיקרו-דגימה (10 μ L) 4 דגימה צדפהפישר סיינטיפיק (וולת'אם, MA, ארה"ב)NC1382947
חרוזי ספרוז המופעלים על ידי NHS 4 זרימה מהירהסיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)GE17-0906-01חרוזי אגרוז, מאחסנים במקרר בטמפרטורה של 2-6 מעלות; C
Optifit, קצות פיפט למילוי, 10 מ"לSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)613-2911
Optifit, קצות פיפט למילוי, 10 μ LSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)790012
Optifit, קצות פיפט למילוי, 1,000 μ LSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)791002
Optifit, קצות פיפט למילוי, 200 μ LSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)790202
אלקטרודה מזכוכית pHMetrohm (Herisau, Sveits)6.0233.100
מד pH 744Metrohm (Herisau, Sveits)8.744.1003
Pipet 10 מ"לSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)725090
Pipet m10 ומיקרו; L Sartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)725020
Pipet m100 ומיקרו; LSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)725050
Pipet m1,000 ומיקרו; LSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)725070
Pipet m20 ומיקרו; LSartorius Biohit (הלסינקי, פינלנד)725030
אשלגן כלורי (KCl ≥ 99.9%)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)P-3911
אשלגן דיהידרוגנפוספט (פרו אנליזה)Merck(דרמשטדט, טיסקלנד)1.04873.0250
חלבון LoBind Eppendorf שפופרת 0.5 מ"לEppendorf (המבורג, טיסקלנד)525-0133 (0030 108.094)
חלבון LoBind Eppendorf שפופרת 1.5 מ"לEppendorf (המבורג, טיסקלנד)525-0132 (0030 108.116)
חלבון LoBind Eppendorf שפופרת 2.0 מ"לEppendorf (המבורג, טיסקלנד)525-0134 (0030 108.450)
חלבון LoBind Eppendorf שפופרת 5.0 מ"לEppendorf (המבורג, טיסקלנד)525-0792 (0030108.302)
מספרייםSigma Aldrich (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)Z186716-1EA
נתרן אזיד (BioUltra; ≥ 99.5%)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)71289-5G
נתרן כלורי (לניתוח)Merck (דרמשטדט, טיסקלנד)1.06404.1000
נתרן דיהידרוגנפוספט מונוהידראט (פרו אנליזה)Merck (דרמשטדט, טיסקלנד)1.06346.0500
נתרן הידרוקסיד (AnalaR NORMAPUR)VWR International (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב)28244.295
נתרן טטרבוראט דקהידראט (≥ 99. %)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)S9640-500G
מיני צנטריפוגהLABNET International (אדיסון, ניו ג'רזי, ארה"ב)מגנט ערבוב C1301
, 25 מ"מ x 6 מ"מ Ø, לייבולד עגול(קלן, גרמניה)666  851
סטיוארט  מערבל מערבולת מדעי SA8סטיוארט (סטפורדשייר, בריטניה)Z648531-1EA
צינורות צנטריפוגה SuperClear (15 מ"ל)VWR International (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב)525-0150
צינורות צנטריפוגה SuperClear (50 מ"ל)VWR International (רדנור, פנסילבניה, ארה"ב)525-0155
נוחות תרמומיקסר 1.5 מ"לאפנדורף (המבורג, טיסקלנד)53,55,27,831מערבל מבוקר טמפרטורה
בסיס טריזמה (דרגת ריאגנט, > 99.0%)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)T6066טריס(הידרוקסימתיל)אמינומטן (טריס) 
טריזמה הידרוכלוריד (דרגת ריאגנט, ≥ 99.0%)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)T3253-100Gטריס (הידרוקסימתיל)אמינומטן הידרוכלוריד (טריס הידרוכלוריד)
טריפסין (מטופל ב-TCPK מלבלב בקר, 10,000-15,000 יחידות BAEE/מ"ג חלבון)סיגמא אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)T8802יש לאחסן במקפיא מתחת ל-20 מעלות; C
Tween 20Sigma Aldrich (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)P7949-500MLפוליסורבט 20
פינצטהSigma Aldrich (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)TEM-78511-27
מכסי בקבוקון, לבן, 9 מ"מNerliens Meszansky (אוסלו, נורבגיה)LPP 09 15 0981
מיקרו-דגימה מיטרה עם טכנולוגיית VAMS (מיקרו-דגימה סופחת נפחית), 10 ומיקרו; L, צדפה 4 דוגמאותNeoteryx (טורנס, קליפורניה, ארה"ב)
מים מסוג 1

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bang, I. B. Fresenius. Zeitschrift für analytische Chemie. 52 (7), 521-523 (1913).
  2. Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
  3. Laurell, C. B. A screening test for α1-antitrypsin deficiency. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).
  4. Thielmann, K., Aquino, A. M. Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure. Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).
  5. Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn). Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).
  6. Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers. Analytica Chimica Acta. 1182, 338714(2021).
  7. Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, Supplement C 132-139 (2017).
  8. Neubert, H., et al. Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).
  9. Pan, S., et al. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications. Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).
  10. Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).
  11. Londhe, V., Rajadhyaksha, M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102(2020).
  12. Denniff, P., Spooner, N. The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).
  13. Denniff, P., Spooner, N. Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).
  14. Levernæs, M. C. S., et al. Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies. RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).
  15. Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase. Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Targeted Mass SpectrometryLow Abundance ProteinsVolumetric Absorptive MicrosamplingDried Blood SpotsProtein ProteolysisPeptide Affinity CaptureAntibody Coated BeadsLiquid Chromatography Tandem Mass SpectrometryProgastrin Releasing PeptideProtein Biomarker Analysis

מאמרים קשורים