מאמר שיטה

בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

DOI:

10.3791/64485

⸱

18 באוגוסט 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונותרפיה עם נוגדנים ספציפיים לאנטיגן או מעכבי בקרה חיסונית חוללה מהפכה בטיפול בסרטן השד. תאי סרטן השד המבטאים את קולטן גורם הגדילה האפידרמיס HER2 יכולים להיות ממוקדים על ידי נוגדן נגד HER-2 trastuzumab. ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) היא מנגנון חשוב המעורב בפעילות האנטי-סרטנית של HER-2. Trastuzumab הקשורים לתאים סרטניים יכול להיות מזוהה על ידי קולטני Fc של תאים משפיעים ADCC (למשל, תאי הרג טבעי (NK), מקרופאגים, גרנולוציטים), הפעלת הפעילות ציטוטוקסית של תאים חיסוניים אלה המוביל למוות תאים סרטניים. יצאנו לפתח בדיקה מבוססת תמונה לכימות ADCC כדי לזהות תרכובות אפנן ADCC חדשות על ידי סינון תוכן גבוה. בניסוי, תאי סרטן השד JIMT-1 בעלי ביטוי יתר של HER2 מתורבתים יחד עם תאי NK-92 בנוכחות טרסטוזומאב, ומוות תאי המטרה מכומת על ידי מיקרוסקופ אוטומטי וניתוח תמונה כמותי. תאי המטרה נבדלים מתאי אפקט בהתבסס על פלואורסצנטיות ה-EGFP שלהם. אנו מראים כיצד ניתן לבדוק ספריות מורכבות בבדיקה כדי לזהות תרופות אפנן ADCC. לשם כך הוצבה פלטת בדיקה של ספריית תרכובת באמצעות כימיקלים עדינים שנבחרו באופן אקראי ממדף המעבדה. שלוש תרכובות מערערות יציבות מיקרוטובולים (קולכיצין, וינקריסטין, פודופילוטוקסין) הצפויות להפריע לנדידת תאי NK ולפירוק תאי NK נכללו גם הן בספריית הבדיקה. מסך הבדיקה זיהה את כל שלוש תרכובות הבקרה החיוביות כפגיעות המוכיחות את התאמת השיטה לזיהוי תרופות משנות ADCC בספרייה כימית. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבצע מסכי ספרייה מורכבים כדי לזהות תרכובות משפרות ADCC שיכולות לשמש כסוכני טיפול אדג'ובנטיים לטיפול בחולים המקבלים אימונותרפיה אנטי-סרטנית. בנוסף, השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי תופעות לוואי בלתי רצויות מעכבות ADCC של תרופות טיפוליות הנלקחות על ידי חולי סרטן עבור אינדיקציות שונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונותרפיה עם נוגדנים אנטי-סרטניים, מעכבי בקרה חיסונית, או תאי T (CAR-T) המבטאים קולטן אנטיגן כימרי מייצגת גישה רבת עוצמה לטיפול בסרטן 1,2,3. Trastuzumab הוא נוגדן חד שבטי אנושי anti-HER-2 (קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2) המשמש לטיפול בסרטן שד חיובי HER-2 בשלב מוקדם או גרורתי, כמו גם סרטן קיבה גרורתי חיובי HER-2 4,5,6. זה פועל בעיקר על ידי עיכוב ההשפעה מגרה התפשטות של גורם גדילה אפידרמיס4. עם זאת, דווח כי trastuzumab גורם ביעילות למוות של תאים סרטניים גם א....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: השלבים העיקריים של זרימת העבודה של הבדיקה מוצגים באיור 2.

figure-protocol-1
איור 2: זרימת עבודה של מסך ADCC. תאי מטרה JIMT-1-EGFP שנזרעו לתוך 96 צלחות HCS באר מטופלים בתרופות של ספריית התרכובת. בתורו, תאי NK (אפקטור) לא מוכתמים ו trastuzumab מתווספים, ואת הצלחת הוא imaged ב 0 נקודת זמן ולאחר 3 שעות של הדגירה. הערכת ADCC מבוססת על השינוי במספר תאי היעד בני קיימא (פני השטח הנצמדים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים כיצד הבדיקה פועלת בחיים האמיתיים, יצרנו ספריית בדיקות של 16 תרכובות שנבחרו באופן אקראי ממדפי המעבדה (איור 3). בנוסף, DMSO נכלל גם כבקרה שלילית, ושלוש תרכובות מעכבות פילמור מיקרוטובול (קולכיצין, וינכריסטין ופודופילוטוקסין) כבקרות חיוביות. אלה האחרונים היו צפויים לעכב ADCC על ידי הפרעה לנדידת תאי NK לתאים הסרטניים ופירוק תאי NK. כל תרכובות הבדיקה וה-DMSO הונחו על לוח ספריית הבדיקה ברביעיות, ו-DMSO נוסף גם לעמודה הראשונה והאחרונה של הלוח (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תגובת ADCC תוארה לפני זמן רב יחסית. אירועים מולקולריים מרכזיים של התהליך תוארו גם הם19. השיטות למדידת ADCC נעות בין בדיקת שחרור כרום רדיואקטיבי בתקן הזהב, מבחני שחרור אנזימים ציטופלזמיים למספר ציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנטיות או מבחני מיקרו-לוחות20. עם זאת, מגבלה נפוצה של בדיקות אלה היא שהן אינן ניתנות להתאמה ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. בעבר, פיתחנו בדיקת HCS מבוססת תמונה המתאימה לסינון ספריות מורכבות עבור תרופות משנות ADCC18. עם זאת, לבדיקה שפות.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV קיבלה מימון ממענקי משרד המחקר, הפיתוח והחדשנות הלאומי GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE ו-OTKA K132193, K147482. תאי CD16.176V.NK-92 התקבלו מד"ר קרי ס. קמפבל (מרכז פוקס צ'ייס, Philapedlphia, PA, מטעם Brink Biologics, lnc. סן דייגו, קליפורניה), מוגנים על ידי פטנטים ברחבי העולם, וקיבלו רישיון על ידי Nantkwest, lnc. המחברים מודים לגיורגי ורב ולארפד שור על עזרתם בשימוש בקו התאים NK-92 ועל הייעוץ הטכני.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-fluorouracilApplichemA7686בספרייה מורכבת
96 בארות Cell Carrier Ultra platePerkinElmerLLC 6055302
BetulinSigmaB9757בספריית תרכובות
CD16.176V.NK92 תאיםNankwest Inc. 
CeruleninChemCruzsc-396822בספרייה מורכבת
CisplatinSanta Cruz Biotechnologysc-200896בספרייה מורכבת
ColchicineSigmaC9754בספרייה מורכבת
Concanavalin-ACalbiochem234567בספרייה מורכבת
DexamethasoneSigmaD4902ב ספריית תרכובות
DMEM/F-12 בינוניSigmaD8437ב-JIMT-1 EGFP בינוני
DMSOSigmaD2650בספרייה מורכבת
EtoposideSigmaE1383E1383
סרום בקר עוברי (FBS)BioseraFB-1090/500JIMT-1 EGFP ו-NK medium
FisetinSigmaF4043בספרייה
מורכבתרובוט טיפול בנוזלים Freedom EVOTECAN
GallotanninFluka Chemical Corp.16201בספרייה מורכבת
גלוטמיןגיבקו35,050– 061בתוכנת הרמוניה בינונית NK
 PerkinElmer
נוגדן חד שבטי אנטי-HER2 אנושי (Herzuma)EGIS Pharmaceuticals, בודפשט הונגריהN/A
Humulin R (אינסולין)Eli LillyHI0219JIMT-1 EGFP בינוני
IL-2Novartis Hungá ria Kft.PHC0026במדיום NK
IsatinSigma114618בספריית התרכובות
חומצות אמינו לא חיוניות MEM (MEM-NEAA)Gibco11,140– 050במדיום NK
Na-pyruvateLonzaBE13-115Eבמדיום NK
NaringeninSigmaN5893בספרייה מורכבת
NQDI-1SigmaSML0185בספרייה מורכבת
Opera Phenix ציוד ניתוח תוכן גבוהPerkinElmer
Penicillin– סטרפטומיציןBioseraLM-A4118JIMT-1 EGFP ו-NK בינוני
PentoxyfillineSigmaP1784בספריית תרכובות
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)LonzaBE17-517Qלשטיפת התאים
PodophyllotoxinSigmaP4405בספריית התרכובות
קוורצטיןSigmaQ4951בספריית
תרכובותחומצה טאניתSigmaT8406בספריית תרכובות
TemozolomideSigmaT2577בספריית תרכובות
טריפן כחול 0.4% תמיסהSigmaT8154לספירת תאים
Vincristine sulfateSigmaV0400000בספריית תרכובות
α-MEMSigmaM8042במדיום NK

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
  2. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NKTrastuzumabHER2ADCC

מאמרים קשורים