מאמר שיטה

בדיקת סינון תוכן גבוהה לזיהוי תרכובות ציטוטוקסיות תאיות תלויות נוגדנים

DOI:

10.3791/64485

⸱

18 באוגוסט 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Chemistry, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Doctoral School of Molecular Medicine, University of Debrecen, 3National Academy of Scientist Education, University of Debrecen, 4ELKH-DE Cell Biology and Signaling Research Group

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג טכניקה אוטומטית, מבוססת תמונה, בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות המווסתות הרג תאי סרטן שד בתיווך תאי הרג טבעיים בנוכחות נוגדן אנטי-HER-2 טיפולי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונותרפיה עם נוגדנים ספציפיים לאנטיגן או מעכבי בקרה חיסונית חוללה מהפכה בטיפול בסרטן השד. תאי סרטן השד המבטאים את קולטן גורם הגדילה האפידרמיס HER2 יכולים להיות ממוקדים על ידי נוגדן נגד HER-2 trastuzumab. ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) היא מנגנון חשוב המעורב בפעילות האנטי-סרטנית של HER-2. Trastuzumab הקשורים לתאים סרטניים יכול להיות מזוהה על ידי קולטני Fc של תאים משפיעים ADCC (למשל, תאי הרג טבעי (NK), מקרופאגים, גרנולוציטים), הפעלת הפעילות ציטוטוקסית של תאים חיסוניים אלה המוביל למוות תאים סרטניים. יצאנו לפתח בדיקה מבוססת תמונה לכימות ADCC כדי לזהות תרכובות אפנן ADCC חדשות על ידי סינון תוכן גבוה. בניסוי, תאי סרטן השד JIMT-1 בעלי ביטוי יתר של HER2 מתורבתים יחד עם תאי NK-92 בנוכחות טרסטוזומאב, ומוות תאי המטרה מכומת על ידי מיקרוסקופ אוטומטי וניתוח תמונה כמותי. תאי המטרה נבדלים מתאי אפקט בהתבסס על פלואורסצנטיות ה-EGFP שלהם. אנו מראים כיצד ניתן לבדוק ספריות מורכבות בבדיקה כדי לזהות תרופות אפנן ADCC. לשם כך הוצבה פלטת בדיקה של ספריית תרכובת באמצעות כימיקלים עדינים שנבחרו באופן אקראי ממדף המעבדה. שלוש תרכובות מערערות יציבות מיקרוטובולים (קולכיצין, וינקריסטין, פודופילוטוקסין) הצפויות להפריע לנדידת תאי NK ולפירוק תאי NK נכללו גם הן בספריית הבדיקה. מסך הבדיקה זיהה את כל שלוש תרכובות הבקרה החיוביות כפגיעות המוכיחות את התאמת השיטה לזיהוי תרופות משנות ADCC בספרייה כימית. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבצע מסכי ספרייה מורכבים כדי לזהות תרכובות משפרות ADCC שיכולות לשמש כסוכני טיפול אדג'ובנטיים לטיפול בחולים המקבלים אימונותרפיה אנטי-סרטנית. בנוסף, השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי תופעות לוואי בלתי רצויות מעכבות ADCC של תרופות טיפוליות הנלקחות על ידי חולי סרטן עבור אינדיקציות שונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אימונותרפיה עם נוגדנים אנטי-סרטניים, מעכבי בקרה חיסונית, או תאי T (CAR-T) המבטאים קולטן אנטיגן כימרי מייצגת גישה רבת עוצמה לטיפול בסרטן 1,2,3. Trastuzumab הוא נוגדן חד שבטי אנושי anti-HER-2 (קולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2) המשמש לטיפול בסרטן שד חיובי HER-2 בשלב מוקדם או גרורתי, כמו גם סרטן קיבה גרורתי חיובי HER-2 4,5,6. זה פועל בעיקר על ידי עיכוב ההשפעה מגרה התפשטות של גורם גדילה אפידרמיס4. עם זאת, דווח כי trastuzumab גורם ביעילות למוות של תאים סרטניים גם אם התאים הסרטניים איבדו את תגובתם לגירוי HER-27. השפעה פרדוקסלית זו של הנוגדן נובעת מציטוטוקסיות תלויית תאים (ADCC)7. ADCC יכול להיות מתווך על ידי תאי הרג טבעי (NK), גרנולוציטים ומקרופאגים הידועים ביחד כתאי ההשפעה של ADCC 8,9. אם נוגדן, כגון trastuzumab, נקשר לתאי הגידול, אז תאים משפיעים אלה משתמשים בקולטני Fc שלהם כדי לקשור את האזור הקבוע (Fc) של הנוגדן. הנוגדן מגשר בין תאי הגידול לבין תאי ההשפעה נושאי קולטן Fc, וגורם לשחרור המתווכים ציטוטוקסיים שלהם10. תאי הרג טבעיים משחררים את המטען ציטוטוקסי של הגרגירים שלהם המכילים פרפורין כדי ליצור נקבוביות בקרום תא המטרה וגראנזים (המפעיל מסלולי איתות מוות תאי) לתוך סינפסת החיסון, מה שמוביל לאפופטוזיס של התאים הסרטניים (ראו איור 1).

figure-introduction-1
איור 1: אינטראקציות של אפקטור ותא יעד ב-ADCC. קולטן Fcγ משטח התא של תא ה- NK המשפיע מזהה את אזור Fc של נוגדן ה- trastuzumab נגד HER2 הספציפי למולקולת HER2 המבוטאת על פני השטח של התא הסרטני. לפיכך, מה שנקרא סינפסה אימונולוגית הוקמה בין שני התאים, גרימת exocytosis מכוונת של גרגירים ציטוטוקסיים של התא המשפיע. מולקולות הפרפורין והגרנזים המשתחררות גורמות בסופו של דבר לאפופטוזיס של תא המטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מספר בדיקות פותחו בעבר כדי לכמת ציטוטוקסיות, כולל ADCC. תקן הזהב הוא שיטת שחרור כרום רדיואקטיבי, שבה תאי המטרה מסומנים באיזוטופ רדיואקטיבי 51Cr, ו-ADCC מכומת על ידי מדידת רדיואקטיביות מהסופרנאטנט של תאי המטרה11. בגלל הבעיות הברורות עקב טיפול, אחסון וסילוק מוסדרים בקפידה של תרופות רדיואקטיביות ופסולת, שיטה זו הפכה יותר ויותר לא פופולרית בקרב מדעני החיים. בנוסף, זה לא מקובל על יישומים תפוקה גבוהה גם. מדידת הפעילות של אנזימים (למשל, לקטט-דהידרוגנאז) המשתחררים מתאי המטרה המומתים יכולה לספק חלופה לא רדיואקטיבית לבדיקת 51Cr12. עם זאת, בדיקות אלה אינן מצליחות להבחין בין מוות של תאי מטרה למוות של תאי השפעה. חישת עכבה של מצע תא חשמלי (ECIS) הוכחה כמתאימה לכימות ADCC13, אך ציוד ECIS אינו זמין ברוב המעבדות, והטכניקה אינה תואמת ליישומים/סינון בעלי תפוקה גבוהה. תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי מייצגים חלופה פופולרית בבדיקות ביולוגיה רבות של התא ומשמשים לעתים קרובות ביישומים מבוססי ציטומטריית זרימה או קורא לוחות14,15,16. עם זאת, בדיקות אלה מכילות לעתים קרובות שלבי שטיפה או שאינן תואמות בדרך אחרת ליישומים בעלי תפוקה גבוהה (למשל, טכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה). כמה מבחני ציטוטוקסיות פופולריים, אשר בתיאוריה אמורים להתאים לכימות ADCC, אינם מצליחים לקבוע באופן מהימן יעילות ADCC13. לאחרונה, עם התפשטות המיקרוסקופ הקונפוקלי הפלואורסצנטי, מבדקים מבוססי תמונה, בעלי תוכן גבוה הופכים פופולריים יותר ויותר בתחומים שונים של מדעי החיים17. מצד אחד, ציוד הדמיה של תאים נמצא כיום בכל מקום, ומצד שני, ניתן לאסוף פרמטרים מורפולוגיים כמעט אינסופיים מהתמונות שנרכשו. לכן, יצאנו לפתח בדיקת ADCC תואמת סינון בתוכן גבוה ולהדגים את התאמתו לסינון ספריות מורכבות.

כאן, אנו מציגים בדיקת ADCC מבוססת תמונה ומדגימים כיצד ניתן להשתמש בבדיקה זו עבור סינון תוכן גבוה (HCS) לזיהוי תרכובות אפנון ADCC. המודל מבוסס על תאי מטרה של קרצינומה של השד JIMT-1, תאי השפעה CD16.176V.NK-92 ונוגדן חד שבטי אנושי נגד HER2 trastuzumab. בשיטה זו, ניתן לזהות תרופות שיכולות לשפר את פעולת הרג הגידול של תאי NK או לקבל תובנה לגבי המנגנון של ADCC בתיווך תאי NK על ידי זיהוי מולקולות קטנות המפריעות ל- ADCC. אנו מציעים כי מדעני חיים השואפים לכמת ציטוטוקסיות בתיווך תאים תוך התייחסות מיוחדת ל- ADCC עשויים להפיק תועלת משימוש בבדיקה זו למדע התגלית או לפיתוח תרופות. בדיקה זו עשויה להיות חלופה אם למעבדה יש גישה וניסיון כלשהו בהדמיה פלואורסצנטית וניתוח תמונה כמותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: השלבים העיקריים של זרימת העבודה של הבדיקה מוצגים באיור 2.

figure-protocol-1
איור 2: זרימת עבודה של מסך ADCC. תאי מטרה JIMT-1-EGFP שנזרעו לתוך 96 צלחות HCS באר מטופלים בתרופות של ספריית התרכובת. בתורו, תאי NK (אפקטור) לא מוכתמים ו trastuzumab מתווספים, ואת הצלחת הוא imaged ב 0 נקודת זמן ולאחר 3 שעות של הדגירה. הערכת ADCC מבוססת על השינוי במספר תאי היעד בני קיימא (פני השטח הנצמדים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. ציפוי צלחת HCS

  1. יש לצפות את 96 לוחות ההקרנה בעלי התוכן הגבוה (HSC) במדיום JIMT-1 של 50 μL/באר (DMEM/F-12 בינוני בתוספת 20% נסיוב בקר עוברי (FBS), אינסולין 0.3 U/mL (100 IU/mL, Humulin R ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
  2. הכניסו את הצלחת לאינקובטור CO2 למשך שעה אחת.
    הערה: ציפוי חיוני לחיבור תאי JIMT-1 למשטח הזכוכית של הצלחת.

2. זריעה של תאי חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר JIMT-1 (EGFP)

הערה: תאי JIMT-1 המבטאים EGFP נוצרו בעבודתנו הקודמת18, והתאים גודלו בתרבית צלוחיות תרבית רקמה T25 במדיה JIMT-1 (ראו הרכב בשלב 1.1).

  1. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS סטרילי.
  2. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוק והחזיר את הבקבוק לאינקובטור CO2 למשך 10 דקות.
  3. לאחר הדגירה, הקש על הבקבוק כדי לבדוק אם תאי JIMT-1 מנותקים.
  4. עצור את העיכול עם 2 מ"ל של מדיה JIMT-1 ולאסוף את תרחיף התא לתוך צינור 15 מ"ל.
  5. ספור את התאים עם 0.4% טריפאן כחול (80 μL של צבע + 20 μL של תרחיף התא) בתא Bürker ולהתאים את מספר התא ל 133, 000 תאים / מ"ל.
  6. שאפו את מצע הציפוי מצלחת הבאר 96 (שלב 1.2).
  7. פיפטה 75 μL של תרחיף התא לכל באר של לוחות HCS (ראה טבלת חומרים).
  8. אפשר לתאים להיצמד במהלך דגירה של לילה ב 37 ° C באינקובטור CO2 .

3. טיפול מקדים בתאי JIMT-1 EGFP עם ספריית התרכובות

  1. שאפו את התווך מתאי JIMT-1 והוסיפו 50 μL/באר תווך JIMT-1 טרי לבארות. מעבירים את הצלחת למעבדת סינון בתפוקה גבוהה.
    הערה: שימוש ברובוט לטיפול בנוזלים הופך את התוספת של ספריות מורכבות ליעילה יותר וניתנת לשחזור.
  2. העבר את תרכובות הבדיקה מלוח ספריית התרכובות ללוח הבדיקה באמצעות כלי סיכה המכויל לנפח של 25 nL. בצע זאת ארבע פעמים. ארבעה סבבי העברה נותנים נפח סופי של 100 nL (וריכוז סופי של 20 מיקרומטר).
  3. בין כל שלב, שטפו את כלי הסיכה, תחילה עם 50% DMSO ולאחר מכן עם 70% אתנול.
  4. לדגור את הצלחות במשך 1 שעה באינקובטור CO2 ב 37 ° C.

4. התחלת בדיקת ADCC על ידי הוספת תאי האפקט

הערה: תאי CD16.176V.NK92 (להלן תאי NK92) גודלו בתרבית ב-α-MEM בתוספת 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-פירובט, 1% גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-100 IU/mL IL-2.

  1. ספירת תאי NK92 עם כחול טריפאן (80 μL של הצבע + 20 μL של השעיית התא). התאם את מספר התא ל- 400,000 תאים/מ"ל.
  2. צנטריפוגה 4 מ"ל של תרחיף התא ב 150 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הכינו את מדיום ADCC על ידי הוספת נוגדן אנטי-HER2 (trastuzumab) של 20 מיקרוגרם/מ"ל למדיום JIMT-1.
  4. להשעות מחדש את גלולת תא NK בתווך ADCC 5 מ"ל.
  5. פיפטה 20,000 תאי NK ב-50 מיקרוליטר של תווך ADCC לתאי היעד JIMT-1. הנפח הסופי הוא 100 μL, וריכוז trastuzumab הסופי הוא 10 מיקרוגרם / מ"ל.
  6. מקם את צלחת הבדיקה לתוך ציוד ניתוח תוכן גבוה עם אינקובטור מובנה להגדיר ב 37 ° C.

5. הדמיה

הערה: יש לצלם את הלוחות בשתי נקודות זמן, הראשונה, מיד לאחר הוספת תאי האפקט לתאי היעד והשנייה, 3 שעות לאחר הוספת תאי NK. להדמיה, ניתן להשתמש במנתח התוכן הגבוה ובתוכנה שלו או בחלופות מתאימות (ראה טבלת חומרים).

  1. בחר סוג צלחת (96-well cell carrier ultra) מרשימת הלוחות.
  2. בחר את שני המיקוד האוטומטי של שני שיאים אם הבדיקה מתבצעת בלוחות.
  3. השתמש במטרה 10x במצב לא קונפוקלי.
  4. בחר Binning 2 כדי להכפיל את יחס האות לרעש.
  5. צלם תמונות שדה בהיר ב- 650-760 ננומטר ותמונות פלואורסצנטיות של תאי JIMT-1 המומרים על ידי EGFP באורכי גל של 488 ננומטר (עירור) ו- 500-550 ננומטר (פליטה).
  6. בחר את מספר השדות ואת מספר נקודות הזמן עבור ההדמיה.

6. ניתוח תמונות

הערה: כדי לנתח את יעילות ADCC, תאי JIMT-1 בני קיימא נספרים. תאי מטרה שנהרגים על ידי ADCC מתנתקים מפני השטח ומתרחקים ממישור המוקד של המיקרוסקופ. לכן, ההבדל בין מספר התאים בני קיימא בתחילת ובסוף תגובת ADCC מתאים לתאי מטרה שסולקו על ידי ADCC. כדי להראות כיצד לבנות את רצף ההערכה, באר ADCC בקרה מוצגת בסרטון.

  1. השתמש במודול חיפוש תאים כדי לזהות אזורים בתמונה המתאימים לתאים.
    הערה: כל תא מזוהה כאזור בתמונה בעל עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר מסביבתו.
  2. בחר תאים באמצעות אלגוריתם M המובנה בקוטר מינימלי של 80 מיקרומטר.
  3. הגדר רגישות פיצול, המחלקת אובייקט גדול לאובייקטים קטנים יותר, ל- 0.5.
  4. קבעו את הסף 'משותף ' (הרמה הנמוכה ביותר של עוצמת פיקסלים) על 0.
  5. אל תכלול זיהוי של אזור רקע עם עוצמה פלואורסצנטית גבוהה של EGFP בשני שלבים.
    1. תחילה, השתמש בפונקציה Calculate Intensity Properties כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות של EGFP באזור התאים שנבחר קודם לכן.
    2. הגדר את סף העוצמה המינימלי והמרבי באמצעות האפשרות בחר אוכלוסייה .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להדגים כיצד הבדיקה פועלת בחיים האמיתיים, יצרנו ספריית בדיקות של 16 תרכובות שנבחרו באופן אקראי ממדפי המעבדה (איור 3). בנוסף, DMSO נכלל גם כבקרה שלילית, ושלוש תרכובות מעכבות פילמור מיקרוטובול (קולכיצין, וינכריסטין ופודופילוטוקסין) כבקרות חיוביות. אלה האחרונים היו צפויים לעכב ADCC על ידי הפרעה לנדידת תאי NK לתאים הסרטניים ופירוק תאי NK. כל תרכובות הבדיקה וה-DMSO הונחו על לוח ספריית הבדיקה ברביעיות, ו-DMSO נוסף גם לעמודה הראשונה והאחרונה של הלוח (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תגובת ADCC תוארה לפני זמן רב יחסית. אירועים מולקולריים מרכזיים של התהליך תוארו גם הם19. השיטות למדידת ADCC נעות בין בדיקת שחרור כרום רדיואקטיבי בתקן הזהב, מבחני שחרור אנזימים ציטופלזמיים למספר ציטומטריית זרימה מבוססת פלואורסצנטיות או מבחני מיקרו-לוחות20. עם זאת, מגבלה נפוצה של בדיקות אלה היא שהן אינן ניתנות להתאמה ליישומים בעלי תפוקה גבוהה. בעבר, פיתחנו בדיקת HCS מבוססת תמונה המתאימה לסינון ספריות מורכבות עבור תרופות משנות ADCC18. עם זאת, לבדיקה שפות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LV קיבלה מימון ממענקי משרד המחקר, הפיתוח והחדשנות הלאומי GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE ו-OTKA K132193, K147482. תאי CD16.176V.NK-92 התקבלו מד"ר קרי ס. קמפבל (מרכז פוקס צ'ייס, Philapedlphia, PA, מטעם Brink Biologics, lnc. סן דייגו, קליפורניה), מוגנים על ידי פטנטים ברחבי העולם, וקיבלו רישיון על ידי Nantkwest, lnc. המחברים מודים לגיורגי ורב ולארפד שור על עזרתם בשימוש בקו התאים NK-92 ועל הייעוץ הטכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-fluorouracilApplichemA7686בספרייה מורכבת
96 בארות Cell Carrier Ultra platePerkinElmerLLC 6055302
BetulinSigmaB9757בספריית תרכובות
CD16.176V.NK92 תאיםNankwest Inc. 
CeruleninChemCruzsc-396822בספרייה מורכבת
CisplatinSanta Cruz Biotechnologysc-200896בספרייה מורכבת
ColchicineSigmaC9754בספרייה מורכבת
Concanavalin-ACalbiochem234567בספרייה מורכבת
DexamethasoneSigmaD4902ב ספריית תרכובות
DMEM/F-12 בינוניSigmaD8437ב-JIMT-1 EGFP בינוני
DMSOSigmaD2650בספרייה מורכבת
EtoposideSigmaE1383E1383
סרום בקר עוברי (FBS)BioseraFB-1090/500JIMT-1 EGFP ו-NK medium
FisetinSigmaF4043בספרייה
מורכבתרובוט טיפול בנוזלים Freedom EVOTECAN
GallotanninFluka Chemical Corp.16201בספרייה מורכבת
גלוטמיןגיבקו35,050– 061בתוכנת הרמוניה בינונית NK
 PerkinElmer
נוגדן חד שבטי אנטי-HER2 אנושי (Herzuma)EGIS Pharmaceuticals, בודפשט הונגריהN/A
Humulin R (אינסולין)Eli LillyHI0219JIMT-1 EGFP בינוני
IL-2Novartis Hungá ria Kft.PHC0026במדיום NK
IsatinSigma114618בספריית התרכובות
חומצות אמינו לא חיוניות MEM (MEM-NEAA)Gibco11,140– 050במדיום NK
Na-pyruvateLonzaBE13-115Eבמדיום NK
NaringeninSigmaN5893בספרייה מורכבת
NQDI-1SigmaSML0185בספרייה מורכבת
Opera Phenix ציוד ניתוח תוכן גבוהPerkinElmer
Penicillin– סטרפטומיציןBioseraLM-A4118JIMT-1 EGFP ו-NK בינוני
PentoxyfillineSigmaP1784בספריית תרכובות
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)LonzaBE17-517Qלשטיפת התאים
PodophyllotoxinSigmaP4405בספריית התרכובות
קוורצטיןSigmaQ4951בספריית
תרכובותחומצה טאניתSigmaT8406בספריית תרכובות
TemozolomideSigmaT2577בספריית תרכובות
טריפן כחול 0.4% תמיסהSigmaT8154לספירת תאים
Vincristine sulfateSigmaV0400000בספריית תרכובות
α-MEMSigmaM8042במדיום NK

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gupta, S. L., Basu, S., Soni, V., Jaiswal, R. K. Immunotherapy: an alternative promising therapeutic approach against cancers. Molecular Biology Reports. 49 (10), 9903-9913 (2022).
  2. Moretti, A., et al. The past, present, and future of non-viral CAR T cells. Frontiers in Immunology. 13, 867013(2022).
  3. June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
  4. Ross, J. S., et al. The HER-2 receptor and breast cancer: ten years of targeted anti-HER-2 therapy and personalized medicine. Oncologist. 14 (4), 320-368 (2009).
  5. Shitara, K., et al. Discovery and development of trastuzumab deruxtecan and safety management for patients with HER2-positive gastric cancer. Gastric Cancer. 24 (4), 780-789 (2021).
  6. Gianni, L., et al. Efficacy and safety of neoadjuvant pertuzumab and trastuzumab in women with locally advanced, inflammatory, or early HER2-positive breast cancer (NeoSphere): a randomised multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncology. 13 (1), 25-32 (2012).
  7. Barok, M., et al. Trastuzumab causes antibody-dependent cellular cytotoxicity-mediated growth inhibition of submacroscopic JIMT-1 breast cancer xenografts despite intrinsic drug resistance. Molecular and Cancer Therapy. 6 (7), 2065-2072 (2007).
  8. Gauthier, M., Laroye, C., Bensoussan, D., Boura, C., Decot, V. Natural Killer cells and monoclonal antibodies: Two partners for successful antibody dependent cytotoxicity against tumor cells. Crit Rev Oncol Hematol. 160, 103261(2021).
  9. Gruijs, M., Sewnath, C. A. N., van Egmond, M. Therapeutic exploitation of neutrophils to fight cancer. Semin Immunol. 57, 101581(2021).
  10. Mando, P., Rivero, S. G., Rizzo, M. M., Pinkasz, M., Levy, E. M. Targeting ADCC: A different approach to HER2 breast cancer in the immunotherapy era. Breast. 60, 15-25 (2021).
  11. van der Haar Avila, I., Marmol, P., Kiessling, R., Pico de Coana, Y. Evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by chromium release assay. Methods in Molecular Biology. 1913, 167-179 (2019).
  12. Broussas, M., Broyer, L., Goetsch, L. Evaluation of antibody-dependent cell cytotoxicity using lactate dehydrogenase (LDH) measurement. Methods in Molecular Biology. 988, 305-317 (2013).
  13. Toth, G., Szollosi, J., Vereb, G. Quantitating ADCC against adherent cells: Impedance-based detection is superior to release, membrane permeability, or caspase activation assays in resolving antibody dose response. Cytometry A. 91 (10), 1021-1029 (2017).
  14. Chung, S., Nguyen, V., Lin, Y. L., Kamen, L., Song, A. Thaw-and-use target cells pre-labeled with calcein AM for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 447, 37-46 (2017).
  15. Lee-MacAry, A. E., et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide. Journal of Immunological Methods. 252 (1-2), 83-92 (2001).
  16. Tanito, K., et al. Comparative evaluation of natural killer cell-mediated cell killing assay based on the leakage of an endogenous enzyme or a pre-loaded fluorophore. Analytical Science. 37 (11), 1571-1575 (2021).
  17. Lin, S., Schorpp, K., Rothenaigner, I., Hadian, K. Image-based high-content screening in drug discovery. Drug Discovery Today. 25 (8), 1348-1361 (2020).
  18. Guti, E., et al. The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to trastuzumab-mediated ADCC. Cancer Immunology, Immunotherapy. 71 (9), 2151-2168 (2022).
  19. Li, F., Liu, S. Focusing on NK cells and ADCC: A promising immunotherapy approach in targeted therapy for HER2-positive breast cancer. Frontiers in Immunology. 13, 1083462(2022).
  20. Perussia, B., Loza, M. J. Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 121, 179-192 (2000).
  21. Garcia-Alonso, S., Ocana, A., Pandiella, A. Trastuzumab emtansine: Mechanisms of action and resistance, clinical progress, and beyond. Trends in Cancer. 6 (2), 130-146 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

NKTrastuzumabHER2ADCC

מאמרים קשורים