בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) מייצגים את משפחת-העל הגדולה ביותר של קולטנים והם המטרות של תרופות אנושיות רבות. סינון בתפוקה גבוהה (HTS) של ספריות מולקולות קטנות אקראיות מול GPCRs משמש את תעשיית התרופות לגילוי תרופות ספציפיות למטרה. במחקר זה, נעשה שימוש ב-HTS כדי לזהות ליגנדות חדשניות של מולקולות קטנות של GPCRs נוירופפטידים ספציפיים לחסרי חוליות כבדיקות למחקרים פיזיולוגיים של וקטורים של פתוגנים קטלניים אנושיים ווטרינריים.
קולטן קינין הספציפי לחסרי חוליות נבחר כיעד משום שהוא מווסת תהליכים פיזיולוגיים חשובים רבים אצל חסרי חוליות, כולל דיאורזה, האכלה ועיכול. יתר על כן, הפרמקולוגיה של GPCRs חסרי חוליות רבים מאופיינת בצורה גרועה או אינה מאופיינת כלל; לכן, הפרמקולוגיה הדיפרנציאלית של קבוצות קולטנים אלה ביחס ל- GPCRs הקשורים במטזואנים אחרים, במיוחד בני אדם, מוסיפה ידע ליחסי המבנה-פעילות של GPCRs כמשפחת-על. בדיקת HTS פותחה עבור תאים בלוחות של 384 בארות לגילוי ליגנדות של קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, או קרציית בקר דרומית, Rhipicephalus microplus. קולטן הקרצייה קינין התבטא ביציבות בתאי CHO-K1.
קולטן קינין, כאשר הוא מופעל על ידי נוירופפטידים אנדוגניים של קינין או אגוניסטים אחרים של מולקולות קטנות, גורם לשחרור Ca2+ ממאגרי סידן לתוך הציטופלסמה. בדיקת סידן פלואורסצנטית זו בשילוב עם גישת "תוספת כפולה" יכולה לזהות מולקולות "פוגעות" פונקציונליות של אגוניסט ואנטגוניסט באותה צלחת בדיקה. כל בדיקה נערכה באמצעות לוחות תרופות שנשאו מערך של 320 מולקולות קטנות אקראיות. התקבל גורם Z אמין של 0.7, וזוהו שלוש מולקולות אגוניסט ושני אנטגוניסטים כאשר ה-HTS היה בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. ניתן להתאים את בדיקת הסידן הפלואורסצנטית המדווחת כאן לסינון GPCRs אחרים המפעילים את מפל האיתות Ca2+ .
מבוא
קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs), הנמצאים משמרים ועד בני אדם, מייצגים את משפחת-העל הגדולה ביותר של קולטנים באורגניזמים רבים1. הם ממלאים תפקידים קריטיים בוויסות כמעט כל התהליכים הביולוגיים בבעלי חיים. ישנם 50-200 GPCRs בגנום של פרוקי רגליים, כלומר הם מייצגים את משפחת קולטני הממברנההגדולה ביותר 2. הם מסווגים לשש מחלקות עיקריות, A-F, בהתבסס על דמיון הרצף והפונקציות שלהם3. GPCRs מתמרים אותות חוץ-תאיים שונים, כגון אלה של הורמונים, נוירופפטידים, אמינים ביוגניים, גלוטמט, פרוטון, ליפוגליקופרוטאינים ופוטונים4. GPCRs מצמידים לחלבוני G הטרוטרימרים (Gα, Gβ ו-Gγ) כדי להעביר אותות במורד ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תחזוקת תאים
הערה: קו תאי CHO-K1 המבטא ביציבות את קולטן קינין מ - R. microplus, בשם BMLK3, פותח על ידי Holmes et al.16. פרטי התפתחות קו התא מוצגים במקום אחר14. כל השלבים הבאים מבוצעים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית מדרגה II.
- הגדל את קו התא הרקומביננטי במדיה סלקטיבית (מדיום F-12K המכיל 10% סרום בקר עוברי [FBS] ו-800 מיקרוגרם/מ"ל G418 סולפט) כדי להבטיח את הביטוי של קולטן המטרה. אחסן את התאים המבטאים ביציבות את הקולטן ב-1 מ"ל של מדיום מקפיא (90% FBS ו-10% דימתיל סולפוקסיד [DMSO]) בקריביאלי של 2 מ"ל במקפיא של −80 מעלות צלזיוס.
הערה: לאחסון....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
צלחת תרופות פנימית (SAC2-34-6170) המורכבת מ-320 מולקולות קטנות אקראיות שימשה להדגמת מבחן HTS זה כדוגמה. ל-HTS הייתה איכות בדיקה מצוינת עם מקדם Z' של 0.7 (טבלה 1). גורם Z' זה משקף את איכות הבדיקה ללא תלות בתרכובות שנבדקו34. גורם Z′ של 0.5 ומעלה מציין טווח דינמי של אות בדיקה טוב בין ה- RFUs של הפקדים החיוביים לבין הבקרות השליליות. למבחנים עם גורם Z קטן מ-0.5 יש טווח דינמי של אות לא אופטימלי, הם בדרך כלל לא אינפורמטיביים לבחירת להיטים, ולכן הם מושלכים. התגובה (ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המטרה של HTS היא לזהות מולקולות פגיעות באמצעות סינון מספר עצום של מולקולות קטנות. לכן, התוצאות מדוגמה זו מייצגות רק חלק קטן מניסוי HTS קונבנציונלי. יתר על כן, מולקולות הפגיעה שזוהו צריכות להיות מאומתות במבחנים במורד הזרם, כגון בדיקה תלוית מינון על אותו קו תאים רקומביננטי ועל קו תאים CHO-K1 הנושא רק את הווקטור הריק, אשר ניתן לבצע בו זמנית כדי להציל מולקולות קטנות. מבחני ציטוטוקסיות יסייעו להוכיח כי חוסר תגובה בתוספת השנייה אינו נובע מתמותת תאים. יש לבצע בדיקות ביולוגיות אחרות כדי לאמת את הפעילות ברקמות המבודדות במבחנה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרס USDA-NIFA-AFRI לבריאות ורווחת בעלי חיים (פרס מספר 2022-67015-36336, PVP [מנהל הפרויקט]) ומקרנות תחרותיות מתוכנית המענקים למחלות וקטוריות חרקים של טקסס A&M AgriLife (FY'22-23) ל- P.V.P. קבוצת הסגל A.W.E.S.O.M.E. של המכללה לחקלאות ומדעי החיים, TAMU, מוכרת על עזרה בעריכת כתב היד. טבלה משלימה S2 מכילה נתונים מספריית מולקולות קטנות פנימית, אקראית, שהתקבלו ממעבדתו של ד"ר ג'יימס סאצ'טיני באוניברסיטת A&M בטקסס A&M AgriLife Research.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% טריפסין-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | עם פנול אדום |
| 0.4% טריפן כחול | MilliporeSigma | T8154 | נוזלי, סטרילי |
| 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה | תרמו פישר | AM12400 | צינורות מיקרופוגה ללא RNase |
| 5 מ"ל פיפטה סרולוגית | קורנינג | 29443-045 | קורנינג קוסטאר סטריפט עטוף בנפרד |
| 10 מ"ל פיפטה סרולוגית | קורנינג | 29443-047 | קורנינג קוסטאר סטריפט עטוף בנפרד |
| צינורות חרוטיים 15 מ"ל | Falcon | 352196 | סטרילי |
| 20 ומיקרו; טיפים לסינון L | USA Scientifc Inc. | P1121 | סטרילי, מחסום |
| 25 מ"ל פיפטה סרולוגית | קורנינג | 29443-049 | קורנינג קוסטאר סטריפט עטוף בנפרד |
| צינורות חרוטיים 50 מ"ל | Corning | 430828 | בוגר, סטרילי |
| 150 מ"ל ידידותי אוטומטי | Integra Bioscience | 6317 | סטרילי, עטוף בנפרד לזריעת תאים ביום 1 |
| 150 מ"ל שמורה ידידותית אוטומטית | Integra Bioscience | 6318 | סטרילי, מוערם, להעמסת צבע ביום 2 |
| 384/ 12.5 ומיקרו; L קצות שמירה נמוכים | Integra Bioscience | 6405 | מסנן סטרילי ארוך |
| 384/ 12.5 ומיקרו; טיפים | L Integra Bioscience | 6404 | מסנן ארוך וסטרילי |
| 384 בארות צלחת | גריינר | 781091 | CELLSTAR, פוליסטירן שקוף ומיקרו; אטמי צלחת אלומיניום שקופים, שחורים/ |
| שטוחים | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| עטיפת רדיד אלומיניום | Walmart | ||
| Biosafty cabinet II | NuAire | NU-540-300 | |
| מונה תאים | Nexcelom | AutoT4 | |
| שקופיות ספירת תאים | Nexcelom | SD-100 | 20 µ L תא |
| CO2 חממה לחה | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| מנורת שולחן | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| דימתיל סולפוקסיד | MilliporeSigma | 276855 | אנהידוס, >99.9% |
| צלחת תרופות | קורנינג | 3680 | |
| קורנינג | מבודד פוספט של Dulbecco | 21-031- CV | DPBS, 1x ללא סידן ומגנזיום |
| אתנול | Koptec | 2000 | |
| F-12K תערובת נוטריינטים | קורנינג | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) עם L-גלוטמין |
| סרום בקר עוברי | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| ערכת בדיקת סידן פלואורסצנטי | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | בדיקות 10x96 |
| G418 סולפט | Gibco Invitrogen | 10131-027 | אנטיביוטיקה סלקטיבית גנטיצין 50 מ"ג/מ"ל |
| מאגר האנק | MilliporeSigma | 55037C | HBSS שונה, עם סידן, עם מגנזיום, ללא פנול לקרוא |
| מאגר HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 טוחנת |
| HTS אחסון נתונים פלטפורמת | CDD כספת | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| מערכת טיפול בנוזלים | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 ומיקרו; L |
| צלחת צנטריפוגה | תרמו פישר | Sorvall ST8 | |
| קורא צלחת | BMG טכנולוגיה | Clariostar | |
| פולי-D-ליזין | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 אגוניסט פפטיד | Genscript | הזמנה מותאמת אישית | QFSPWGamide |
| T-75 בקבוק | בז | 353136 |
מקורות
- Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
- Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
