הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

5.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64526

⸱

16 בדצמבר 2022

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado-Anschutz School of Medicine

במאמר זה

סיכום

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

תקציר

זרימת סידן בתגובה לגירוי קולטן תאי T היא מדד נפוץ של איתות תאי T. מספר צבעי מחוון סידן פותחו כדי להעריך איתות סידן על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פסים. פרוטוקול זה נועד למדוד תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. סך כל הטחול מסומן בצבע אינדיקטור הסידן היחסי Indo-1, יחד עם פאנל של נוגדנים מצומדים פלואורוכרום למולקולות פני התא. מינוף היכולות של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מספק פלטפורמה לשימוש במגוון רחב של כתמים על פני התא בשילוב עם Indo-1. לאחר מכן תאים מנותחים בזמן אמת ב 37 ° C לפני ואחרי תוספת של נוגדן אנטי CD3 כדי לעורר את קולטן תא T. לאחר פירוק האותות הספקטרליים, מחושב היחס בין Indo-1 הקשור לסידן ללא סידן וניתן לדמיין אותו לאורך זמן עבור כל אוכלוסייה מגודרת של טחול. טכניקה זו יכולה לאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן באוכלוסיות תאים מרובות.

מבוא

זרם סידן המושרה על ידי קולטן תאי T (TCR) הוא מדד שימושי להפעלת תאי T ומשמש לעתים קרובות כדי לקבוע אם לאוכלוסייה של תאי T יש תגובות לקויות בשלבים הפרוקסימליים של מסלול איתות TCR1. מדידות של זרימת סידן מבוצעות בדרך כלל על ידי תיוג מראש של תאי T עם אחד או זוג צבעי מחוון סידן פלואורסצנטיים, ולאחר מכן בחינת האותות הפלואורסצנטיים באמצעות ציטומטריית זרימה בזמן אמת לאחר TCR cross-linking 2,3,4. Indo-1, צבע סידן מטרי, מעורר על ידי לייזר UV עם פליטת שיא בשני אורכי גל שונים התלויים בקשירת סידן5, והוא צבע אינדיקטור נפוץ לניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן בלימפוציטים חיים. מכיוון שפרופיל הפליטה של Indo-1 הוא רחב למדי, זה יכול להיות מאתגר לשלב הערכת Indo-1 עם ניתוח סימולטני של סמני פני תא מרובים על ידי ציטומטריית זרימה של מעבר פס. מגבלה זו מגבילה את השימוש בניתוח ציטומטריית זרימה של תגובות סידן לאוכלוסיות מטוהרות מראש של תאי T או לאוכלוסיות המזוהות על ידי קבוצה מוגבלת של מולקולות פני התא.

כדי להתמודד עם המגבלות של מדידת תגובות סידן על אוכלוסיות הטרוגניות של לימפוציטים ראשוניים באמצעות ציטומטריית זרימה של מעבר פסים, פותח פרוטוקול למדידת פלואורסצנטיות Indo-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. שיטה זו מאפשרת ריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא, תוך ניצול היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא. היתרון בשימוש בציטומטריית זרימה בספקטרום מלא על פני ציטומטריית זרימה קונבנציונלית הוא היכולת להבחין בין אותות פלואורסצנטיים לצבעים חופפים מאוד, ובכך להגדיל את מספר סמני פני השטח שניתן להעריך בו זמנית בכל דגימה. ציטומטריית זרימה קונבנציונלית משתמשת במסנני פסים ומוגבלת לפלואורוכרום אחד לכל מערכת גלאים6. ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא אוספת אותות על פני כל הספקטרום של הפלואורוכרום באמצעות 64 גלאים במערכת ציטומטריית זרימה ספקטרליתשל חמישה לייזרים 7,8. בנוסף, ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא מנצלת את גלאי APD (Avalanche Photo Diode) בעלי רגישות מוגברת ביחס לגלאי צינור מכפיל אורהקיימים בציטומדי זרימה קונבנציונליים 8. כתוצאה מכך, גישה זו אידיאלית עבור אוכלוסיות תאים הטרוגניות, כגון תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם או תרחיפים של תאי איברי לימפה משניים מורין, מכיוון שהיא מבטלת את הצורך בבידוד של אוכלוסיות תאי T ספציפיות לפני סימון צבע הסידן. במקום זאת, ניתן להשתמש בפרופילי ביטוי של סמני פני השטח של התא ובציטומטריית זרימה לאחר איסוף נתונים כדי להעריך את תגובות הסידן בכל אוכלוסייה מעוניינת בהן. כפי שניתן לראות בדו"ח זה, ניתן לשלב את Indo-1 בקלות עם שמונה נוגדנים מצומדים פלואורוכרום, וכתוצאה מכך בסך הכל 10 חתימות ספקטרליות ייחודיות. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על תערובות של תאים מקווי עכבר מובחנים באופן קונגני, מה שמאפשר ניתוח סימולטני של תגובות סידן בתאי T מסוג בר בהשוואה לאלה מקו עכברים ממוקד גנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברים הוחזקו בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו אנשוץ בהתאם לפרוטוקולים של IACUC. כל העכברים הומתו על פי תקני AAALAC.

1. הכנת תאים חיסוניים מטחול העכבר

הערה: הרדימו עכברים תמימים באמצעות המתת חסד CO2 . עכברי C57BL/6 שנרכשו ממעבדות ג'קסון וגודלו בבית משמשים לניסויים בגיל 6-12 שבועות. עכברים זכרים ונקבות כאחד משמשים לניסויים.

  1. יש לחטא את עור העכבר באתנול 70% על מנת לצמצם את האפשרות של מזהמים חיצוניים להיכנס לדגימה.
  2. נתחו את טחול העכבר באמצעות כלי דיסקציה, מספריים כירורגיים ומלקחיים. קצרו את הטחול והכניסו את הטחול המנותק לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל עם ~5 מ"ל של מדיית RPMI מלאה (cRPMI) על קרח.
    הערה: RPMI מלא מורכב מ-10% FBS, 2 mM L-גלוטמין ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    1. כדי לקצור את טחול העכבר, בצע חתך של 5 ס"מ לתוך הפרווה והעור לאורך הצד השמאלי של העכבר באמצע הדרך בין הרגליים הקדמיות והאחוריות עם מספריים. פתח את חלל הגוף ~ 5 ס"מ והסר את הטחול באמצעות מלקחיים. הטחול הוא בצבע של שעועית כליה והוא ארוך ושטוח יותר מהכליה השכנה.
  3. שפכו את התוכן של שלב 1.2 על מסנן סטרילי של 70 מיקרומטר המחובר לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל. מפרידים מכנית את הטחול לתרחיף תא בודד על ידי דחיפת הטחול דרך הפילטר עם בוכנה מזרק 5 מ"ל עד שלא נשאר עיסת טחול על פני המסנן.
  4. גלול את הטחול באמצעות צנטריפוגת רוטור מתנדנדת החוצה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. בזהירות decant supernatant. הטחול הכדורי נשאר בתחתית הצינור החרוטי 50 מ"ל.
  6. כדי להסיר תאי דם אדומים, להשעות מחדש את splenocytes pelleted ב 1 מ"ל של חיץ ליזה ACK למשך 3 דקות על פי הוראות היצרן. מערבבים היטב.
  7. להרוות את מאגר הליזיס ACK עם 15 מ"ל של cRPMI.
  8. גלולה הלימפוציטים לפי ההוראות בשלב 1.4.
  9. להשעות מחדש את השעיית התא ב 5 מ"ל של cRPMI בצינור חרוטי 50 מ"ל. מניחים את הדגימות על קרח.
    1. כדי לספור את התאים, העבירו 10 μL של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.6 מ"ל ודללו ביחס של 1:1 עם תמיסה כחולה טריפאן. לאחר מכן, העבר להמוציטומטר או למערכת ספירת תאים אוטומטית.
  10. לאחר הספירה, בהתאם לריכוז התא בתרחיף התא כמו בשלב 1.9, יש להכניס את התאים לצנטריפוגה שולחנית בטמפרטורה של 500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתכונן לתוספת של מדיית cRMPI המכילה צבע אסטר Indo-1 AM.
  11. חשב את נפח ההשעיה מחדש של התאים כדי להשיג 10-12 x 106 תאים / מ"ל. זהו ריכוז של פי 2 מספירת התאים הכוללת הנדרשת.
  12. השעה מחדש את התאים בנפח cRPMI המחושב בשלב 1.11. מקם את התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 בצינור חרוטי 50 מ"ל עם מכסה מאוורר או צלחת תרבית רקמה.

2. צבע יחסי הודו-1 ותיוג נוגדנים פלואורסצנטיים

  1. בהתאם להוראות היצרן, הוסף 50 μL של DMSO לבקבוקון המכיל 50 מיקרוגרם של Indo-1 AM. ריכוז תמיסת המלאי הוא 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
    הערה: DMSO מסופק במיקרו-בקבוקונים עם הערכה למניעת חמצון של DMSO.
  2. לדלל את aliquot מלאי (1 מיקרוגרם / μL) לתוך נפח הניסוי המתאים (נקבע ב 1.11) של cRPMI בריכוז של 6 מיקרוגרם / מ"ל, ריכוז 2x. אין לאחסן את Indo-1 בתמיסה מימית.
    הערה: ניתן להשתמש במאגרים אחרים עם תוספת סידן בהתאם לצרכי התא.
  3. הניחו את המדיה המלאה עם Indo-1 בצד באמבט מים בטמפרטורה של 37°C.
    הערה: השתמש בריכוז המינימלי של אסטר Indo-1 AM הדרוש כדי לקבל אות מתאים. זה צריך להיות titrated עבור סוגי תאים שונים. בדרך כלל, ריכוז בין 3-5 מיקרומטר מספיק. עבור תאי T ראשוניים, טעינת תאים עם Indo-1 בריכוז >5 מיקרוגרם/מ"ל מגדילה את העוצמה הפלואורסצנטית הממוצעת (MFI) מעל לוג של 6 על ציטומטרים של זרימה ספקטרלית. אם זה קורה, להפחית את עוצמת לייזר UV ו titrate את Indo-1 לריכוז נמוך יותר.
  4. דילל את מתלי התאים שהוכנו בעבר (בשלב 1.12), 1:1 ב-cRPMI, כולל מדיית 2x Indo-1 שיוצרה בשלב 2.2. ודא כי התאים נמצאים בריכוז בין 5-6 x 106/mL.
    הערה: אין לצבוע פקדי כתם יחיד לא מוכתמים או סמן פני שטח של תא כתם יחיד עם Indo-1. הוספת Indo-1 לבקרות נוגדנים עם כתם יחיד תיצור דגימה מרובת צבעים עקב הוספת Indo-1 לתאים מוכתמים בודדים. כלול בקרת INDO-1 (ללא סידן) EGTA נוספה ללוח הדגימה שנוצר בשלב 2.6.
  5. הוסף 1 מ"ל של תאים/באר/מצב ניסיוני לצלחת תרבית רקמה של 12 בארות.
  6. צור בקרה מוכתמת יחידה עבור דגימת Indo-1 (ללא סידן) באמצעות תאים שהוטענו בעבר בצבע Indo-1 והוסף EGTA לריכוז סופי של 2 mM. EGTA תצבית סידן בתרחיף התא, ותעניק דגימת בקרה נקייה יותר.
    1. צור בקרה חיובית של Indo-1 (קשור לסידן Indo-1) על ידי הוספת 50 מיקרומטר של יונומיצין לתרחיף התאים הטעון בצבע בציטומטר הזרימה. יונומיצין הוא יונופור סידן חדיר לממברנה הקושר יוני סידן ומקל על העברת יוני סידן לתאים.
  7. צור באר להדברה שלילית ביולוגית ללא פלואורופורים או צבע הודו-1.
  8. צור באר לבקרות כתמים בודדות עבור כל אוכלוסיות תאים נוספות המעניינות (נוגדנים מוגדרים על-ידי המשתמש) באמצעות פלואורופורים מצומדים של נוגדנים בעיצוב לוח ציטומטריה של זרימה. אלה לא יכללו את הצבע ביחס הודו-1.
  9. הוסף את הנוגדן חוסם קולטן Fc (~ 2 מיקרוגרם / 1 x 106 תאים), בהתאם להוראות היצרן, לפני הוספת נוגדנים מצומדים פלואורוכרום נוספים לצביעת פני השטח.
  10. לדגור על הצלחת במשך 45 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.
  11. השהה מחדש את התאים בצלחת של 12 בארות על ידי הקשה עדינה על הצלחת כל 15 דקות.
  12. מערבבים ומסירים את כל נפח התאים התלויים במדיה מהצלחת בת 12 הקידוחים. לאחר מכן הוסף את השעיית התא לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל.
  13. מכניסים את התאים למיקרוצנטריפוגה במהירות של 500XG למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. דקרו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של cRPMI שחומם מראש. גלולה שוב ודקנט את הסופרנטנט.
    הערה: שטיפת התאים מסירה את כל הנוגדנים החוסמים FC שנותרו.
  14. להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של cRPMI בצינורות מיקרוצנטריפוגות 1.7 מ"ל ולדגור על כל צינור ב 37 ° C למשך 30 דקות נוספות ב 5% CO2, משאיר את החלק העליון של הצינור פתוח מעט כדי לאפשר חילופי גז. זה מאפשר דה-אסטריפיקציה מלאה של אסטרי AM תוך תאיים.
  15. מעבירים את התאים חזרה לצלחת תרבית רקמה בת 12 בארות, במידת הצורך. ניתן להוסיף נוגדנים מצומדים נוספים המוגדרים על ידי המשתמש בשלב מנוחה.
    הערה: סמנים המשמשים בחלונית השיטות כוללים: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 ו- CD1d/α-galcer tetramer. סמנים נבחרים לניתוח תת-קבוצות של תאי T.
    1. צור תערובת אב של כל הנוגדנים המצומדים פלואורוכרום המוגדרים על-ידי המשתמש בהתאם לסוגי התאים המעניינים בנפח טיטרטיבי קודם לכן לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מ"ל.
    2. הוסף תערובת אב מחושבת עבור 1 מ"ל מנפח התא, תלוי בנוגדנים טיטרטים לתאים נחים.
      הערה: היתרון של צביעה בשלב 2.15 במקום בשלב 2.18 מאוחר יותר הוא שהכתמה בשלב 2.15 תקצר את זמן הדגירה הכולל של הניסוי. עם זאת, צביעה בנפח כולל של 1 מ"ל בשלב 2.15 מגבירה את השימוש בנוגדנים.
  16. לאחר מנוחה, גלולה את התאים ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: תאים בצלחת תרבית רקמה של 12 בארות יכולים להיות כדוריים בצלחת עם אביזר צנטריפוגות צלחת. אחרת, גלולה את התאים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל.
  17. לשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1 מ"ל של 4 ° C cRPMI קר גלולה את התאים שוב כמו בשלב 2.16. מניחים את התאים על קרח.
    הערה: אם צובעים תאים על פני השטח בנפרד, לאחר דה-אסטריפיקציה בשלב 2.18, יש צורך בפחות נפח נוגדנים. צביעת פני השטח בשלב זה יכולה להתבצע לאחר שלב המנוחה במאגר זרימה קרה (1x DPBS עם תוספת של 1% FBS), באמצעות נוגדנים המוגדרים על ידי המשתמש, על קרח למשך 30 דקות. שטפו את התאים לאחר הכתם ב-cRPMI כמו בשלב 2.17.
    1. הוסף כתם כדאיות Ghost540 מדולל 1:7,500 ב- DPBS לדגימות בהתאם להוראות היצרן. חום להרוג את התאים ב 55 ° C על בלוק התחממות עבור שליטה חיה / מת מוכתם יחיד.
      הערה: צביעת צבע פונקציונלית כדאיות לסילוק תאים מתים בניתוח ציטומטרי זרימה מבוצעת ללא FBS. FBS יכול לקיים אינטראקציה עם צבעי אמין בהתאם להוראות היצרן.
  18. יש להשהות מחדש דגימות בודדות ב-500 מיקרוליטר של cRPMI (נטול פנול אדום) באמצעות צינור זרימת פוליסטירן 5 מ"ל עם מכסה.
    הערה: ניתן להשאיר תאים בטמפרטורה של 4°C למשך עד שעה.
  19. יש לחמם כל צינור של 5 מ"ל המכיל תאים, בנפרד, לטמפרטורה של 37°C באמצעות אמבט חרוזים למשך 7 דקות לפני הניתוח של ציטומטר הזרימה תוך שמירה על זמן עקבי בין הדגימות. השתמש בטיימר.

3. צינור אמבט חרוזים: שמירה על טמפרטורה במהלך ניתוח שטף סידן

  1. להוסיף חרוזי אמבטיה לאמבט מים קטן, ללא תוספת מים; התחממו עד 37 °C.
  2. בזהירות לחתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לשניים, בסימן 25 מ"ל, עם סכין גילוח; יש להשליך את החלק העליון של הצינור.
  3. ממלאים את הצינור החצוי 3/4 מהדרך בחרוזי אמבטיה.
  4. הכניסו את הצינור שנוצר בשלב 3.2 לאמבט החרוזים שנוצר בשלב 3.1. מביאים את הצינור והחרוזים ל 37 מעלות צלזיוס.
  5. חברו את אמבט החרוזים לשקע חשמל ליד ציטומטר הזרימה על מנת לשמור על הטמפרטורה לקראת ניתוח הדגימה.
  6. הוסף מתלה קלקר חרוטי בנפח 50 מ"ל חתוך כדי אחיזת צינור אחד כדי למקם את הצינור במקומו בזמן שהוא פועל על ציטומטר הזרימה. זה יבטל את הצורך להחזיק ידנית את הצינור למשך ניתוח העקומה.

4. רכישת זרם סידן באמצעות אנליזה ציטומטרית של זרימה

  1. היכנס לתוכנת ציטומטר הזרימה במנתח זרימה.
  2. לחץ על הכרטיסייה Library כדי להוסיף תגים פלואורסצנטיים Indo-1 (הקשורים לסידן) ו-Indo-1 (ללא סידן). בחר תגי ניאון בתפריט התוכנה משמאל. בחר לייזר UV תחת קבוצות תגים פלואורסצנטיות ולחץ על +הוסף כדי להוסיף שם תג פלואורסצנטי (Indo-1 (קשור לסידן)/Indo-1 (ללא סידן)) לספרייה. בחר את אורך גל עירור הלייזר ואת אורך גל הפליטה ולאחר מכן לחץ על שמור. המשך למערך הניסוי.
    הערה: Indo-1 מעורר על ידי לייזר UV באורך גל של 355 ננומטר. אורך גל הפליטה של Indo-1 (הקשור לסידן) הוא 372 ננומטר. אורך גל הפליטה של Indo-1 (ללא סידן) הוא 514 ננומטר.
  3. לחץ על הכרטיסייה רכישה. פתח/צור ניסוי חדש והוסף את התגים הפלואורסצנטיים הרצויים לניסוי.
  4. צור קבוצת התייחסות וקבוצה/ים לדוגמה חדשה עבור הניסוי. תייג הן את הדגימות והן את קבוצות ההתייחסות לפי הצורך.
  5. תחת הכרטיסיה רכישות , הגדר את האירועים לתיעוד למקסימום: 10,000,000.
  6. הגדר את עוצמת העצירה לנפח המרבי: 3,000 μL.
  7. הגדר את זמן העצירה לזמן המרבי: 36,000 שניות.
  8. רכוש פקדים מוכתמים בודדים עבור נוגדנים מצומדים מוגדרים הכלולים בחלונית הרב-גונית.
  9. רכוש פקדים מוכתמים בודדים עבור צבע פונקציונלי Indo-1.
    1. הוסף 50 מיקרומטר של יונומיצין לבקרה החיובית Indo-1 הקשורה לסידן. מערבולת לערבב. הוסף את צינור הזרימה ליציאת הזרקת הדגימה ולחץ על הקלט.
    2. הוסף בקרת Indo-1 שלילית ללא סידן לציטומטר הזרימה ולחץ על הקלט. EGTA נוסף בשלב 2.6.
    3. בטל את ערבוב הפקדים המוכתמים הבודדים על ידי לחיצה על כפתור בטל ערבוב .
      הערה: יש לרשום את כל הבקרות המוכתמות הבודדות מכל הנוגדנים המצומדים והצבעים הפונקציונליים לפני ביטול ערבוב הדגימות. כדי שלחצן בטל ערבוב יפעל, יש להקליט תחילה את כל פקדי ההפניה. Unmixing יכול להיעשות לפני או אחרי איסוף דגימה.
  10. לאחר השלמת ביטול הערבוב, צור עלילות רציפות באמצעות גליון העבודה הלא מעורב. SSC-A לעומת FSC-A להסרת פסולת מהדגימה, SSC-A לעומת SSC-H להסרת כפילויות. לאחר מכן מגיע שער ניקוי כדאיות יחד עם פגיעה נוספת באוכלוסיות המעניינות. כדי ליצור שערים, לחץ על Plot. הוסף תרשים לגליון העבודה ולחץ פעמיים בתוך השער כדי ליצור אוכלוסייה מגודרת במורד הזרם. המשיכו עד לטיפול בכל האוכלוסיות המעניינות.
  11. דגימות בקרה מוכתמות בודדות חמות (משלבים 2.6-2.9 בסעיף Indo-1 ratiometric dye and fluorescent antibody labeling) עד 37°C לניתוח רציף. הגדר את תוכנת ציטומטריית הזרימה.
  12. הפעל מים DI על הציטומטר במשך 2-3 דקות כדי להבטיח את היציבות הנוזלית של ציטומטר הזרימה.
  13. הגדר תרשימים רציפים בגליון העבודה הלא מעורב על-ידי יצירת שערים באמצעות הלחצנים 'מצולע', 'מלבן' או 'שער אליפסה'. שער לכלול את האוכלוסייה המעניינת (כלומר, לימפוציטים המשתמשים ב- SSC-A לעומת FSC-A [אפליה בגודל / לימפוציטים]). אוכלוסיות שליליות מופיעות מקובצות סביב אפס בעוד אוכלוסיות חיוביות ניתן לדמיין על ידי הגדלת MFI. אוכלוסיות מעניינות יוגדרו על בסיס השאלה הביולוגית.
  14. לחץ פעמיים בתוך השער שנוצר ושנה את הפרמטרים ציר Y וציר X ל- SSC-A לעומת SSC-H (אפליה בודדת). השלם את הגדרת פרמטרי הציר על ידי לחיצה שמאלית על המילים על הציר.
  15. צור תרשים עם SSC-A לעומת אות צבע כדאיות (פרמטרים של שער כדאיות). שער על תאים חיים, אשר שליליים עבור צביעת צבע אמין. תאים חיים, שליליים לכתמים מתים חיים, יתקבצו בסימן 0 בשני צירי Y ו- X.
  16. לחץ פעמיים על העלילה הפנימית כדי ליצור חלקה חדשה המכילה לימפוציטים חיים של תא בודד בלבד. שנה את ציר Y ל- Indo-1 (סידן קשור) (V1) ו/או Indo-1 (סידן חופשי) (V7) לעומת זמן על ציר X להמחשת זרם הסידן.
  17. הניחו את הדגימה הביולוגית המחוממת על מכונת SIT והריצו את הדגימות במהירות של 2,500-3,000 אירועים לשנייה על מדיום כדי לאפשר הדמיה של זרימת הסידן באוכלוסיות מוגבלות של מספר תאים (למשל, iNKT).
    הערה: על ידי השעיה מחדש של התאים בריכוז של 1 x 106/mL, אירועי התא שנאספו בקצב זרימה בינוני צריכים להיות שווים 2,500-3,000 אירועים לשנייה. הנמיכו את קצב הזרימה תחת בקרת רכישה על ידי לחיצה על התפריט הנפתח או דללו את הדגימה אם לתרחיף התא יש ריכוז מוגבר. הרצת הדגימות בקצב זרימה גבוה יכולה להגביר את התפשטות האות מפלואואורופור אחד לפלואורופורים אחרים בלוח.
  18. מוסיפים את הצינור הבא לאמבט החרוזים כדי להתחמם ל 37 מעלות צלזיוס.
  19. בבקרת הרכישה, הקש Record כדי להקליט את הנתונים הראשוניים במשך 30 שניות כדי לקבל רמה בסיסית של איתות סידן בדגימה.
  20. בבקרת הרכישה, לחץ על עצור והסר את הצינור מיציאת הזרקת הדגימה (SIP).
  21. הוסף 30 מיקרוגרם של אנטי CD3 לא מצומד ישירות לתוך צינור הדגימה כדי להתחיל זרימת סידן. הריכוז הסופי לכל צינור הוא 60 מיקרוגרם/מ"ל.
    הערה: אין שלב כביסה לאחר הוספת אנטי CD3.
  22. החזיר את הצינור ל- SIP של המכונה במהירות האפשרית ולחץ על הקלט בתוכנה.
  23. הקלט נתונים במשך 7 דקות, תוך צפייה בזמן שחלף תחת בקרות הרכישה בתוכנה, כדי לצפות במסלול הזמן של זרימת הסידן בתוך אוכלוסיות המדגם.
  24. לאחר 7 דקות, לחץ על עצור בתוכנה והוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל של יונומיצין. הקלט במשך 30 שניות כדי לקבל את אות הסידן המרבי בתאים המעניינים. כדי להגביל את הנשיאה של יונומיצין לדגימה הבאה, השלימו שתי שטיפות SIT במכשיר בין הדגימות.
  25. המשך לדוגמה הבאה וחזור על זרימת העבודה עד שכל הדגימות ייאספו.
  26. שמור את הניסוי ולחץ על קובץ ה- zip לייצוא . קבצים לא מעורבים ( .fsc) מועלים לתוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה חיצונית.

5. ניתוח עקומת סידן

  1. באמצעות תוכנת ניתוח6 עבור ציטומטריית זרימה, להמיר אותות פלואורסצנטיים Indo-1 ליחס עבור מדידות סידן בהילוך מהיר. גזור פרמטרים תחת הכרטיסייה כלים על-ידי הוספת הפניות Indo-1 (קשור לסידן)/Indo-1 (סידן חופשי) באמצעות סולם ליניארי. הגדר את המינימום לאפס ואת המקסימום בהתאם לזרם של יחס סידן, בדרך כלל סביב 10. היחס המרבי משתנה בהתאם לסוג התא ול-MFI של Indo-1.
  2. סמן את הפרמטר שנבחר. תחת כלים, הוסף ניתוח קינטי כדי לבחור את הפרמטר על ידי לחיצה על הכרטיסייה קינטיקה . הגדר את ציר Y לנגזרת.
  3. בחר MFI (עוצמה פלואורסצנטית ממוצעת) בכרטיסיה Kinetics.
  4. מוסיפים החלקה גאוסיאנית, אם רוצים. כדי להוסיף החלקה גאוסיאנית, בחר באפשרות בתפריט הסטטיסטיקה הנפתח בתוכנת ניתוח הזרימה. ניתן להוסיף החלקה גאוסיאנית כדי להחליק את ההדמיה של עקומת זרימת הסידן של הניתוח.
  5. צור טווחים מרובים לסטטיסטיקה לאורך מסלול הזמן של שטף הסידן להשוואות ביולוגיות בתוך הדגימות.
  6. גרור את הדגימות לעורך הפריסה והוסף את הנתונים הסטטיסטיים כרצונך. ניתוח סטטיסטי משתנה בהתאם לשאלה הביולוגית. למטרות פרסום, מספר עותקים משוכפלים מנותחים באמצעות t-test או ANOVA.
  7. לרגע של ניתוח זמן, כוונו את השער על רגע מסוים בזמן לאורך שטף הסידן. לבחון את סמני פני השטח הרצויים ואת השער על האוכלוסייה המעוניינת בו; לאחר מכן, העריכו תרשים נקודות דו-ממדי של הודו-1 (ללא סידן) לעומת הודו-1 (קשור לסידן) עבור תאים מגודרים באותו רגע באזור הזמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תהליך העבודה הניסיוני להערכת תגובות סידן בתאי T מורינים ראשוניים באמצעות צבע יחסי הודו-1 עם כתמים על פני השטח המרובבים מוצג באיור 1. לאחר קצירת ועיבוד הטחול של העכבר לתרחיף תא יחיד, התאים מוכתמים באסתר Indo-1 AM ומשטח מוכתמים בנוגדנים המקושרים לפלואורוכרום. לאחר השלמת טעינת הצבע וצביעת הנוגדנים, דגימות הלימפוציטים מתחממות לטמפרטורה ביולוגית (37 מעלות צלזיוס). הדגימות מנותחות לאחר מכן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא עבור פלואורסצנטיות Indo-1 לאחר התאמה לסוגי התאים הבודדים הרצויים, ללא צ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ממוטבת שנועדה למדוד תגובות סידן בתאי T ראשוניים של מורין העמוסים בצבע אינדיקטור ביחס הודו-1 באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא 7,8. היתרון בביצוע בדיקות שטף סידן באמצעות ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא הוא היכולת להכפיף צביעת סמן תאי שטח בשילוב עם הערכה של פלואורסצנטיות Indo-1. לציטומטריית זרימה בספקטרום מלא יש יתרון בכך שהיא מאפשרת שימוש בצבעים חופפים מאוד, ובכך מגדילה את מספר הסמנים שניתן להשתמש בהם בלוח. זאת בשל העובדה כי ציטומטר זרימה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים מתחרים להצהיר.

תודות

R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry משאב משותף, RRID:SCR_021321, תודה רבה לעמיתינו ב- Cytek על דיונים מתמשכים של ניתוח ציטומטרי ספקטרלי מלא בתוכנות Aurora ו- SpectroFlo. דמויות נוצרו עם BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
12 צלחות מטופלות TC היטבCell Treat229111
50 מ"ל חרוטיגריינר Bio141-12-17-0350 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן עם מכסה
5 מ"ל צינורות זרימת פוליסטרןקורנינג352052
5 מ"ל מזרקBD מזרק BD309646בוכנה בלבד משמש שיית' מושלך
מסנן 70uMגריינר ביו1542070
aCD3 (17A2)Biolegend100202
AKC lysis מאגרGibcoA1049201
Aurora זרימה ספקטרלית ציטומטרhttps://cytekbio.com/pages/aurora
חרוזי אמבטיהקולפרמרפריט # UX-06274-52
CD19 PETonbo50-0193-U100
CD1d טטרמר APCNIH
CD25 PECy7ebioscience15-0251
CD4 APC Cy7Tonbo25-0042-U100
CD8a FITCebioscience11-0081-85
חממת תאיםמדעיים
מלקחייםMcKesson#487593מלקחיים רקמות McKesson Adson באורך 4-3/4 אינץ 'נירוסטה בדרגה משרדית ידית אגודל לא סטרילית שאינה נעילה 1 x 2
כלי חיתוך שיניים מספרייםMcKesson#970135מספריים הפעלה McKesson Argent™ 4-1/2 אינץ' כירורגית כיתה כירורגית ידית טבעת אצבע מנירוסטה קצה חד ישר / קצה חד
DPBS 1xGibco14190-136DPBS 
EGTAFisherNC1280093
FBSHyclondSH30071.03חבילה AE29165301
FlowJo Softwarehttps://www.flowjo.com/
Indo1-AM Ester Dyeebioscience65-085-39צבע לטעינת סידן 
ionomycinMillipore407951-1mg
Live/Dead Ghost 540Tonbo13-0879-T100
צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"לLight LabsA-7001
פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמיןGibco10378-016
PRN694Med Chem ExpressHy-12688
מטוהר נגד עכבר CD16/CD32 (FC Shield) ( 2.4G2)Tonbo70-0161-M001FC בלוק
RPMIGibco1875093 + פנול אדום
RPMI ללאפנול Gibco11835030 -פנול אדום
צנטריפוגה שולחניתבקמן קולטרAllegra612
TCRβ PerCP Cy5.5ebioscience45-5961-82
TCRγ/δ Pe Cy5ebioscience15-5961-82
Vi-Cell Blu Reagent Packמספר מוצר: C06019כולל Tripan
Vi-Cell BluBeckman Coulter
WaterbathFisher Brand Dry Bath
כלי ניתוח פורמליים

מקורות

  1. Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
  2. Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).
  3. June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
  4. Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
  5. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  6. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
  7. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).
  8. Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).
  9. Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
  10. Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).
  11. Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).
  12. Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).
  13. Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
  14. SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
  15. FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
  16. Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
  17. Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הזרמת סידן בתאי Tצבע אינדיקטור לסידןצביעת Indo-1גירוי Anti-CD3ניתוח שטף סידןסממנים על פני השטח של התאציטומטריית זרימה רב-צבעיתתתי-אוכלוסיות של תאי T
ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.