Method Article

אוטומציה של בדיקת מיקרוגרעין באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה ובינה מלאכותית

DOI:

10.3791/64549

⸱

January 27th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בדיקה מבוססת היטב לכימות נזק לדנ"א. עם זאת, ניקוד הבדיקה באמצעות טכניקות קונבנציונליות כגון מיקרוסקופיה ידנית או ניתוח תמונה מבוסס תכונות הוא מייגע ומאתגר. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לפיתוח מודל בינה מלאכותית כדי להבקיע את מבחן MN באמצעות נתוני ציטומטריה של זרימת הדמיה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת המיקרוגרעין (MN) משמשת ברחבי העולם גופים רגולטוריים להערכת רעילות גנטית של כימיקלים. הבדיקה יכולה להתבצע בשתי דרכים: על ידי ניקוד MN בתאים בינוקליים חד-פעמיים מחולקים, חסומים ציטוקינזיס או תאים חד-גרעיניים מחולקים במלואם. מבחינה היסטורית, מיקרוסקופ אור היה שיטת תקן הזהב כדי להבקיע את המבחן, אבל זה מייגע וסובייקטיבי. ציטומטריית זרימה שימשה בשנים האחרונות כדי לדרג את הבדיקה, אך היא מוגבלת על ידי חוסר היכולת לאשר חזותית היבטים מרכזיים של תמונות תאיות. ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) משלבת לכידת תמונה בתפוקה גבוהה וניתוח תמונה אוטומטי, ויושמה בהצלחה כדי לרכוש במהירות תמונות של כל אירועי המפתח במבחן MN ולניקוד שלהם. לאחרונה, הוכח כי שיטות בינה מלאכותית (AI) המבוססות על רשתות עצביות קונבולוציוניות יכולות לשמש כדי לדרג נתוני בדיקת MN שנרכשו על ידי IFC. מאמר זה מתאר את כל השלבים לשימוש בתוכנת AI כדי ליצור מודל למידה עמוקה כדי לדרג את כל אירועי המפתח וליישם מודל זה כדי להבקיע נתונים נוספים באופן אוטומטי. תוצאות מודל הלמידה העמוקה של AI משתוות היטב למיקרוסקופיה ידנית, ולכן מאפשרות ניקוד אוטומטי לחלוטין של בדיקת MN על ידי שילוב IFC ו- AI.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקת מיקרוגרעין (MN) היא בסיסית בטוקסיקולוגיה גנטית כדי להעריך נזק לדנ"א בפיתוח קוסמטיקה, תרופות וכימיקלים לשימוש אנושי 1,2,3,4. מיקרו-גרעינים נוצרים מכרומוזומים שלמים או מקטעי כרומוזומים שאינם משתלבים בגרעין לאחר החלוקה ומתעבים לגופים קטנים ועגולים נפרדים מהגרעין. לפיכך, MN יכול לשמש כנקודת קצה לכימות נזק לדנ"א בבדיקת גנוטוקסיות1.

השיטה המועדפת לכימות MN היא בתוך תאים בינוקלים שחולקו פעם אחת (BNCs) על ידי חסימת חלוקה באמצעות Cytochalasin-B (Cyt-B). בגרסה זו של הבדיקה, ציטוטוקסיות מוערכת גם על ידי ניקוד תאים מונונוקלציה (MONO) ו polynucleated (POLY). הבדיקה יכולה להתבצע גם על ידי ניקוד MN בתאי MONO לא חסומים, שהוא מהיר וקל יותר להבקיע, כאשר ציטוטוקסיות מוערכת באמצעות ספירת תאים לפני ואחרי חשיפה כדי להעריך התפשטות 5,6.

ניקוד פיזי של הבדיקה בוצע באופן היסטורי באמצעות מיקרוסקופיה ידנית, שכן זה מאפשר אישור חזותי של כל אירועי המפתח. עם זאת, מיקרוסקופ ידני הוא מאתגר וסובייקטיבי1. כך פותחו טכניקות אוטומטיות, כולל סריקת שקופיות במיקרוסקופ וציטומטריית זרימה, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה. בעוד ששיטות סריקת שקופיות מאפשרות להציג באופן חזותי אירועי מפתח, יש ליצור שקופיות בצפיפות תאים אופטימלית, דבר שעשוי להיות קשה להשגה. בנוסף, טכניקה זו לעתים קרובות חסר ויזואליזציה ציטופלזמית, אשר יכול לסכן את הניקוד של MONO ו POLY תאים 7,8. בעוד ציטומטריית זרימה מציעה לכידת נתונים בתפוקה גבוהה, התאים חייבים להיות lysed, ובכך לא לאפשר את השימוש בצורת Cyt-B של הבדיקה. בנוסף, כטכניקה שאינה הדמיה, ציטומטריית זרימה קונבנציונלית אינה מספקת אימות חזותי של אירועי מפתח 9,10.

לכן, ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) נחקרה לביצוע בדיקת MN. ImageStreamX Mk II משלב את המהירות והחוסן הסטטיסטי של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית עם יכולות הדמיה ברזולוציה גבוהה של מיקרוסקופיה במערכת אחת11. הוכח כי באמצעות IFC, ניתן לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה של כל אירועי המפתח ולהבקיע באופן אוטומטי באמצעות טכניקות מבוססות תכונות 12,13 או בינה מלאכותית (AI) 14,15. על ידי שימוש ב- IFC לביצוע בדיקת MN, הניקוד האוטומטי של תאים רבים יותר בהשוואה למיקרוסקופ בפרק זמן קצר יותר הוא בר השגה.

עבודה זו חורגת מתהליך עבודה של ניתוח תמונה16 שתואר קודם לכן ודנה בכל השלבים הנדרשים לפיתוח ואימון מודל של Random Forest (RF) ו/או רשת עצבית קונבולוציונית (CNN) באמצעות תוכנת Amnis AI (להלן "תוכנת AI"). כל השלבים הדרושים מתוארים, כולל אכלוס נתוני אמת קרקעית באמצעות כלי תיוג בסיוע AI, פרשנות של תוצאות אימון המודל, ויישום המודל לסיווג נתונים נוספים, המאפשר חישוב של גנוטוקסיות וציטוטוקסיות15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף נתונים באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה

הערה: עיין ב- Rodrigues et al.16 עם השינויים הבאים, וציין כי ייתכן שיהיה צורך לשנות את אזורי הרכישה המשתמשים ב- IFC ללכידת תמונה מיטבית:

  1. בשיטה שאינה Cyt-B, בצע ספירת תאים באמצעות מונה תאים זמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) על כל תרבית מיד לפני התרבית ומיד לאחר תקופת ההחלמה.
  2. אם אתה מפעיל דגימות בציטומטר זרימת הדמיה יחיד של מצלמה, מקם את Brightfield (BF) בערוץ 4. החלף את M01 ב-M04 ואת M07 ב-M01.
    הערה: "M" מתייחס לערוץ המצלמה ב- IFC.
  3. השתמש בהגדלה של 40x במהלך הרכישה.
  4. בתרשים יחס גובה-רוחב של אזור BF לעומת BF במהלך הרכישה, השתמש בקואורדינטות האזור הבאות:
    קואורדינטות X: 100 ו-900; קואורדינטות Y: 0.7 ו-1 (שיטת Cyt-B)
    קואורדינטות X: 100 ו-600; קואורדינטות Y: 0.7 ו-1
  5. בתרשים עוצמת Hoechst, השתמש בקואורדינטות האזור הבאות:
    קואורדינטות X: 55 ו-75; קואורדינטות Y: 9.5 ו-15 (שיטת Cyt-B)
    קואורדינטות X: 55 ו-75; קואורדינטות Y: 13 ו-21 (שיטה שאינה Cyt-B)
  6. כדי להסיר תמונות של אובייקטים אפופטוטיים ונמקיים מהנתונים, הפעל את חבילת התוכנה IDEAS 6.3 (שתיקרא מעתה "תוכנת ניתוח תמונות"; ראה טבלת חומרים).
    הערה: תוכנת הבינה המלאכותית תוכננה לפעול עם קבצי .daf שעובדו באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של תוכנת ניתוח התמונות. ודא שתוכנת ניתוח התמונות מעודכנת.
  7. שמור עבודה זו כקובץ תבנית ( .ast).

2. יצירת קבצי .daf עבור כל קבצי .rif

  1. תוכנת הבינה המלאכותית מאפשרת לייבא קבצי .daf בלבד. צור קובצי .daf לכל קובצי ה- .rif בניסוי באמצעות עיבוד אצווה.
  2. תחת תפריט כלים , לחץ על קבצי נתוני אצווה ולאחר מכן לחץ על הוסף אצווה.
  3. בחלון החדש, בחר הוסף קבצים ובחר את קבצי ה- .rif שיתווספו לאצווה. תחת האפשרות בחר תבנית או קובץ ניתוח נתונים ( .ast, .daf), בחר את קובץ ה- .ast שנוצר בעבר.
  4. הקצה שם אצווה במידת הצורך ולחץ על אישור כדי ליצור קבצי .daf לכל קבצי ה- .rif שנטענו.

3. יצירת ניסוי בתוכנת AI

  1. עיין בתרשים הזרימה באיור 1 המתאר את התהליך של יצירת מודל למידה עמוקה באמצעות תוכנת AI.
  2. הפעל את תוכנת ה- AI וודא שהגרסה העדכנית ביותר מותקנת על ידי לחיצה על אודות בפינה השמאלית התחתונה של החלון. אם הגירסה העדכנית ביותר אינה מותקנת, פנה support@luminexcorp.com כדי להשיג אותה.
  3. מסך ברירת המחדל בתוכנה הוא מסך הניסוי החדש . השתמש בסמל Folder כדי לבחור היכן לשמור את הניסוי, והקלד שם לניסוי (לדוגמה, "MN model").
  4. תחת סוג ניסוי, לחץ על לחצן האפשרויות לצד רכבת כדי להתחיל ניסוי אימון כדי להתחיל לבנות את מודל CNN. לחץ על הבא.
    1. אופציונלי: אם מודל אומן בעבר, ניתן להשתמש בו כתבנית עבור מודל AI חדש, וניתן לבחור אותו כתבנית ליצירת מודל חדש מהמסך בחירת מודל תבנית . אם לא קיים מודל תבנית, פשוט דלג על שלב זה על-ידי לחיצה על הבא.
  5. המסך הבא הוא המסך ' הגדר דגם חדש' . תחת מודל, השם שניתן למודל בשלב 3.3 יאוכלס באופן אוטומטי.
    1. תחת תיאור, הקלד תיאור עבור הדגם (אופציונלי) והשאר את גודל התמונה המרבי על 150 פיקסלים.
    2. תחת ערוצים, לחץ על הוסף BF כדי להוסיף ערוץ brightfield לרשימה. תחת שם, לחץ פעמיים על Brightfield ושנה את שם ערוץ זה ל- BF. לחץ על הוסף FL כדי להוסיף ערוץ ניאון לרשימה. תחת שם, לחץ פעמיים על פלורסנט ושנה את שם הערוץ הזה ל- DNA.
    3. תחת שמות כיתות, לחץ על הוסף. בחלון הקופץ, הקלד Mononucleated ולחץ על אישור. פעולה זו מוסיפה את המחלקה החד-גרעינית לרשימת שמות המחלקות. חזור על תהליך זה כדי להבטיח ששש המחלקות הבאות מוגדרות ברשימה:
      מונו-גרעינים
      מונונוקל עם MN
      בינוקלציה
      Binucleated עם MN
      פולינוקלציה
      מורפולוגיה לא סדירה
      לחץ על הבא.
      הערה: שש מחלקות אלה של מודל אמת קרקעית ייצגו את אירועי המפתח שיש להבקיע, כמו גם תמונות עם מורפולוגיה שונה מקריטריוני הניקוד המקובלים5.
      1. אופציונלי: אם תרצה, ניתן לכלול את תבנית הניתוח מ- 1.7 כדי להשתמש בתכונות מתוכנת ניתוח התמונות. אם ברצונך לכלול תכונות אלה במודל הבינה המלאכותית, אתר את קובץ ה- .ast ולאחר מכן מתוך התפריט הנפתח הספציפי לערוץ, בחר את ערכות המשנה של התכונות שברצונך לכלול.
    4. תחת Select Files, לחץ על Add Files ואתר את הקבצים הרצויים שיתווספו לתוכנת AI כדי לבנות את נתוני האמת הבסיסיים. לחץ על הבא.
      הערה: חשוב להוסיף קבצי נתונים מרובים (לדוגמה, נתוני בקרה חיוביים ושליליים) המכילים מספר מספיק של כל אירועי המפתח.
  6. לאחר מכן, במסך בחירת אוכלוסיות בסיס , אתר את האוכלוסייה הלא-אפופטוטית מהיררכיית האוכלוסין. לחץ לחיצה ימנית על האוכלוסייה הלא אפופטוטית ובחר בחר את כל האוכלוסיות התואמות. לחץ על הבא.
    הערה: חשוב להחריג אוכלוסיות שאין לסווגן (למשל, חרוזים, פסולת, כפילים וכו')
  7. מסך זה הוא המסך ' בחר אוכלוסיות אמת' .
    1. אם אוכלוסיות אמת מתויגות של אירועי המפתח לא נוצרו בתוכנת ניתוח התמונות, לחץ על הבא.
    2. אם נוצרו אוכלוסיות אמת מתויגות בתוכנת ניתוח התמונות, הקצה אותן למחלקת המודל המתאימה.
    3. כדי להקצות אוכלוסיית אמת מתויגת של תאי MONO עם MN, לחץ על המחלקה Mononucleated with MN תחת Model Classes משמאל. לאחר מכן לחץ על אוכלוסיית האמת המתויגת המתאימה בצד ימין המכילה אירועים אלה.
    4. אם אוכלוסיות האמת המתויגות נוצרו ביותר מקובץ נתונים אחד, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אחת מאוכלוסיות האמת ובחר בחר באפשרות בחר את כל האוכלוסיות התואמות כדי להוסיף אוכלוסיות מתויגות מקבצים מרובים למחלקה המתאימה.
    5. לאחר שהוקצו כל אוכלוסיות האמת המתאימות, לחץ על הבא.
  8. במסך Select Channels , בחר את הערוצים המתאימים לניסוי. כאן, הגדר את BF לערוץ 1 ואת Hoechst לערוץ 7. לחץ לחיצה ימנית על ערוץ ובחר החל על הכל. לחץ על הבא.
  9. לבסוף, במסך האישור , לחץ על צור ניסוי.
  10. תוכנת הבינה המלאכותית טוענת תמונות מקבצי הנתונים ויוצרת את מחלקות המודל שהוגדרו בשלב 3.5.3 עם תמונות האמת הקרקעית שהוקצו בשלב 3.7. לחץ על סיום.
  11. לאחר יצירת הניסוי מוצגות חמש אפשרויות:
    ניסוי: מספק פרטים על הניסוי, כולל קבצי נתונים שנטענו, ערוצים שנבחרו ומחלקות מוגדרות של מודלים של אמת קרקעית.
    תיוג: מפעיל את כלי התיוג שבאמצעותו משתמשים יכולים לאכלס נתוני אמת קרקעית.
    הדרכה: אימון מודל המבוסס על נתוני האמת בשטח.
    סיווג: משתמש במודלים מאומנים כדי לסווג נתונים.
    תוצאות: מספק תוצאות הן מניסוי אימון והן מניסוי סיווג.

4. אכלוס נתוני האמת בשטח באמצעות כלי תיוג בסיוע בינה מלאכותית

  1. לחץ על תיוג כדי להפעיל את ממשק כלי התיוג.
    1. לחץ על כלי הזום (סמלי זכוכית מגדלת) כדי לחתוך את התמונות לצפייה קלה יותר.
    2. לחץ על פס המחוון כדי להתאים את גודל התמונה כדי לשנות את מספר התמונות המוצגות בגלריה.
    3. לחץ על הגדרת התצוגה אפשרות ובחר Min-Max, המספקת את תמונת הניגודיות הטובה ביותר לזיהוי כל אירועי המפתח.
    4. לחץ על תצוגת גלריית הגדרות כדי לשנות את צבע תמונת ה- DNA לצהוב או לבן, מה שישפר את ההדמיה של אובייקטים קטנים (למשל, MN).
  2. לחץ על אשכול כדי להפעיל את האלגוריתם כדי לקבץ אובייקטים עם מורפולוגיה דומה יחד. לאחר השלמת קיבוץ האשכולות, האשכולות הבודדים עם מספר האובייקטים בכל אשכול מוצגים ברשימה תחת אוכלוסיות לא ידועות. בחר באשכולות בודדים כדי להציג את האובייקטים בתוך האשכול ולהקצות אובייקטים אלה למחלקות המודל המתאימות שלהם.
  3. לאחר שהוקצו לפחות 25 אובייקטים לכל מחלקת מודל, האלגוריתם Predict הופך לזמין. לחץ על Predict.
    הערה: אובייקטים שאינם מתאימים היטב לאוכלוסייה כלשהי מסווגים כלא ידועים. ככל שמתווספים יותר עצמים לאוכלוסיות האמת, דיוק החיזוי משתפר.
  4. המשיכו לאכלס את כיתות מודל האמת הקרקעית בדימויים מתאימים עד שיגיעו למספר מספיק של אובייקטים בכל כיתה.
  5. לאחר שהוקצו לפחות 100 אובייקטים לכל מחלקת דגם, לחץ על הכרטיסייה אימון בחלק העליון של המסך. לחץ על כפתור הרכבת כדי ליצור מודל באמצעות האלגוריתמים Random Forest ו- CNN.
    הערה: תוכנת הבינה המלאכותית יוצרת מודלים באמצעות האלגוריתמים Random Forest ו-CNN, תיבות הסימון מאפשרות יצירת מודלים באמצעות Random Forest של אלגוריתמי CNN בלבד.

5. הערכת דיוק המודל

  1. לאחר השלמת אימון המודל, לחץ על הצג תוצאות.
  2. השתמש במסך התוצאות כדי להעריך את דיוק הדגם. השתמש בתפריט הנפתח כדי לעבור בין Random Forest ו- CNN.
    הערה: ניתן לעדכן את אוכלוסיות האמת, וניתן לאמן מחדש את המודל או להשתמש בו כפי שהוא כדי לסווג נתונים נוספים.
    1. כדי לעדכן את אוכלוסיות האמת, לחץ על תיוג בחלק העליון ופעל לפי סעיף 4.

6. סיווג נתונים באמצעות המודל

  1. הפעל את תוכנת ה- AI. מסך ברירת המחדל הוא מסך ניסוי חדש . השתמש בסמל תיקיה כדי לבחור היכן לשמור את הניסוי ולהקליד שם לניסוי.
  2. תחת סוג ניסוי, לחץ על לחצן האפשרויות לצד סיווג כדי להתחיל ניסוי סיווג. לחץ על הבא.
  3. לחץ על המודל שישמש לסיווג, ולאחר מכן לחץ על הבא.
  4. במסך Select Files, לחץ על Add Files ואתר את הקבצים שיש לסווג לפי מודל CNN. לחץ על הבא.
  5. לאחר מכן, במסך בחירת אוכלוסיות בסיס , לחץ על תיבת הסימון לצד האוכלוסייה הלא-אפופטוטית באחד הקבצים שנטענו. לחץ לחיצה ימנית על האוכלוסייה הלא אפופטוטית ולחץ על בחר את כל האוכלוסיות התואמות כדי לבחור אוכלוסייה זו מכל הקבצים שנטענו. לחץ על הבא.
  6. אופציונלי: אם הנתונים שיש לסווג מכילים אוכלוסיות אמת, ניתן להקצות אותם למחלקות המודל המתאימות במסך בחירת אוכלוסיות אמת. אחרת, לחץ על הבא כדי לדלג על שלב זה.
  7. במסך Select Channels , בחר Channel 1 עבור brightfield ו - Channel 7 עבור כתם DNA. לחץ לחיצה ימנית על ערוץ ולחץ על החל על הכל. לאחר מכן לחץ על הבא.
  8. לבסוף, במסך האישור , לחץ על צור ניסוי. תוכנת הבינה המלאכותית טוענת את המודל שנבחר ואת כל התמונות מקבצי הנתונים שנבחרו. לחץ על סיום.
  9. לחץ על סיווג כדי להפעיל את מסך הסיווג. לחץ על כפתור סיווג . פעולה זו מתחילה את תהליך השימוש במודל RF ו- CNN כדי לסווג נתונים נוספים ולזהות את כל האובייקטים השייכים למחלקות המודל שצוינו.
    הערה: ניתן להשתמש בתיבות הסימון כדי לבחור את דגם RF ו/או את דגם CNN.
  10. לאחר השלמת הסיווג, לחץ על הצג תוצאות.
  11. לחץ על לחצן עדכן DAFs כדי להציג את החלון עדכן DAFs עם תוצאות סיווג . לחץ על אישור כדי לעדכן את קבצי ה- .daf.

7. הפקת דו"ח של תוצאות הסיווג

  1. במסך תוצאות , לחץ על צור דוח. בחר בתיבת הסימון לצד צור דוח עבור כל דאף קלט אם נדרש דוח נפרד עבור כל דאף קלט. לחץ על אישור.
  2. לאחר שתסיים, פתח את התיקיה שבה נשמרו קבצי הדוח. בתוך התיקיה, יש דוח .pdf ניסוי ותיקיה משאבים .
  3. פתח את .pdf כדי להציג את הדוח. הדוח מכיל מידע על מודלים וניסויים, רשימת קבצי .daf קלט, ספירות המחלקות ואחוזי המחלקה בתבנית טבלאית והיסטוגרמה, ומטריצת בלבול המסכמת את הסתברות החיזוי החציונית בכל קבצי .daf הקלט.
  4. פתח את התיקיה משאבים ולאחר מכן את התיקיה CNN . בתוך תיקייה זו נמצאים קבצים .png של תרשימי ספירת המחלקות ועמודות האחוזים, כמו גם מטריצת הבלבול. בנוסף, ישנם קבצי .csv המכילים את ספירות המחלקות והאחוזים עבור כל קובץ קלט.

8. קביעת תדירות MN וציטוטוקסיות

  1. חישוב תדירות MN
    1. שיטה שאינה Cyt-B: כדי לקבוע תדירות MN, פתח את קובץ class_count.csv משלב 7.4. עבור כל קובץ קלט, חלק את הספירות באוכלוסיית "מונוגרעין עם MN" בספירות באוכלוסייה "מונוגרעין" והכפל ב- 100:
      figure-protocol-1
    2. שיטת Cyt-B: כדי לקבוע את תדירות MN, פתח את קובץ class_count.csv משלב 7.4. עבור כל קובץ קלט, חלק את הספירות באוכלוסיית "Binucleated with MN" בספירות באוכלוסיית "Binucleated" והכפל ב- 100:
      figure-protocol-2
  2. חישוב ציטוטוקסיות
    1. שיטת Non Cyt-B:
      1. באמצעות ספירת התאים הראשונית וספירת התאים שלאחר הטיפול, חשב תחילה את הכפלת האוכלוסייה (PD) עבור כל מדגם2:
        figure-protocol-3
      2. לאחר מכן, חשב את הכפלת האוכלוסייה היחסית2:
        figure-protocol-4
      3. לבסוף, חשב את ציטוטוקסיות2 עבור כל דגימה:
        figure-protocol-5
    2. שיטת Cyt-B:
      1. כדי לחשב את Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)2, השתמש בספירות במחלקות mononucleated, binucleated, ו polynucleated עבור כל דגימה מקובץ class_count.csv :
        figure-protocol-6
      2. כדי לחשב ציטוטוקסיות2, השתמש ב- CBPI מתרבויות הביקורת (C) והתרבויות החשופות (T):
        figure-protocol-7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג את זרימת העבודה לשימוש בתוכנת AI ליצירת מודל עבור מבחן MN. המשתמש טוען את קבצי ה- .daf הרצויים לתוכנת ה- AI, ולאחר מכן מקצה אובייקטים למחלקות מודל האמת הקרקעית באמצעות אשכול בסיוע AI (איור 2) ואלגוריתמי תיוג חיזוי (איור 3). לאחר שכל מחלקות מודל האמת הקרקעית אוכלסו במספיק אובייקטים, ניתן לאמן את המודל באמצעות אלגוריתמים RF או CNN. לאחר האימון, ניתן להעריך את ביצועי המודל באמצעות כלים הכוללים היסטוגרמות של התפלגות מחלקות, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה המוצגת כאן מתארת את השימוש באלגוריתמים של למידה עמוקה כדי להפוך את הניקוד של מבחן MN לאוטומטי. מספר פרסומים אחרונים הראו כי כלים אינטואיטיביים ואינטראקטיביים מאפשרים יצירת מודלים של למידה עמוקה לניתוח נתוני תמונה ללא צורך בידע חישובי מעמיק18,19. הפרוטוקול המתואר בעבודה זו באמצעות חבילת תוכנה מונחית ממשק משתמש תוכנן לעבוד היטב עם קבצי נתונים גדולים מאוד ולאפשר יצירת מודלים של למידה עמוקה בקלות. כל השלבים הדרושים ליצירה ואימון של מודלי RF ו- CNN בחבילת תוכנת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מועסקים על ידי Luminex Corporation, חברת DiaSorin, יצרנית ציטומטר זרימת הדמיה ImageStream ותוכנת Amnis AI המשמשת בעבודה זו.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינור צנטריפוגה 15 מ"לFalcon352096
Cleanser - קולטר קלנז 8546931 של בקמן קולטרעם 200 מ"ל של תכשיר ניקוי.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
ColchicineMilliporeSigma64-86-8
מסנן ואקום על בקבוק קורנינג MilliporeSigmaCLS4307690.22 ומיקרו; מסנן m, בקבוק 500 מ"ל
ציטוכלסין BMilliporeSigma14930-96-2בקבוק 5 מ"ג
Debubbler - 70% איזופרופנולMilliporeSigma1.3704מיכל מילוי עם 200 מ"ל של Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)MilliporeSigma67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Sa Salt 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS Ca++MG++ Free 
סרום בקר עובריHyCloneSH30071.03
פורמלדהיד, 10%, ללא מתנול, Ultra PurePolysciences, Inc.04018זה מה שמשמש לפורמלין 4% ו-1%. אזהרה: פורמלין/פורמלדהיד רעיל בשאיפה ובמקרה של בליעה.  מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור.  עלול לגרום לרגישות בשאיפה או במגע עם העור. סכנת נזק חמור לעיניים.  סכנת סרטן פוטנציאלית.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
מנתח תאי גויאבה מוזהLuminex0500-3115נעשה שימוש במנתח תאי גויאבה מוזה בתצורה סטנדרטית.
Hoechst 33342Thermo FisherH3570תמיסת 10 מ"ג/מ"ל
מניטולMilliporeSigma69-65-8
MEM חומצות אמינו לא חיוניות 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex, חברת DiaSorin100220נעשה שימוש ב-2 מצלמות ImageStreamX Mark II המצוידות בלייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-642 ננומטר.
תוכנת ניתוח MIFC - IDEASLuminex, a DiaSorin company100220"Image analysis sofware"
התוכנה הנלווית לתוכנת MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC - INSPIRELuminex, a DiaSorincompany 100220"Image acquisition software"
זוהי התוכנה שמפעילה את תוכנת MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AILuminex, חברתDiaSorin100221"תוכנת AI"
זוהי התוכנה המאפשרת יצירת מודלים של בינה מלאכותית לניתוח נתונים
Mitomycin CMilliporeSigma50-07-7
NEAA Blend 100xLonza BioWhittaker13-114E
תמיסת פניקלין/סטרפטומיצין/גלוטמין 100XGibco15070063
אשלגן כלורי (KCl)MilliporeSigmaP9541
שטיפה - מים טהורים במיוחד או מים נטולי יוניםNANAהשתמש בכל מים טהורים במיוחד או מים נטולי יונים.  מלאו את המיכל ב-900 מ"ל שטיפה.
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 בינוני 1xHyCloneSH30027.01
נדן - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-Bזה זהה לתמיסת מלח פוספט 1x  של Dulbecco; Ca++MG++ free.  מלאו את המיכל ב-900 מ"ל נדן.
מים סטרילייםHyCloneSH30529.01
סטריליזטור - 0.4%– 0.7% היפוכלוריטVWRJT9416-1זוהי למעשה 10% אקונומיקה קלורוקס שניתן להכין על ידי דליית אקונומיקה קלורוקס במים. מלאו מיכל עם 200 מ"ל סטרילזר.
בקבוק T25Falcon353109
T75 בקבוקפלקון353136
תאי TK6MilliporeSigma95111735
מיכל מילוי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  2. OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , OECD Publishing. Paris. (2016).
  3. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
  4. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  5. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  6. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
  7. Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
  8. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  9. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
  10. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  11. Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  12. Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
  13. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
  14. Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
  15. Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20(2021).
  16. Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324(2019).
  17. Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
  18. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  19. Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Micronucleus AssayImaging Flow CytometryArtificial IntelligenceConvolutional Neural NetworkGenetic ToxicityAutomated Image AnalysisDeep Learning ModelCell Morphology ClassificationGenotoxicity ScreeningMononucleated Cells

Related Articles