Method Article

זיהוי של חלבון פריון חריג על ידי אימונוהיסטוכימיה

DOI:

10.3791/64560

⸱

May 5th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal and Veterinary Research Centre (CECAV), Associate Laboratory for Animal and Veterinary Science-AL4AnimalS, University of Trás-os-Montes and Alto Douro (UTAD), 2Pathology Laboratory, UEISPSA, National Institute for Agricultural and Veterinary Research (INIAV), Oeiras, 3Pathology Laboratory, UEISPSA, National Institute for Agricultural and Veterinary Research (INIAV), Vairão

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיוג חיסוני של חלבון פריון חריג באמצעות פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיים דורש דגימה ספציפית ומתודולוגיות להכנת נוגדנים נגד PrP. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים העיקריים בהסרת אפיטופים כדי להבטיח תיוג חיסוני תקין של PrP ולמזער כתמי רקע לא ספציפיים. כמו כן, גישה זו לוקחת בחשבון אמצעי בטיחות ביולוגית בעת ביצוע מחקרים אימונוהיסטוכימיים עם רקמות נגועות פריון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני פריון חריגים (PrPSc) הם איזופורם הקשור למחלה של חלבון פריון תאי וסמנים אבחנתיים של אנצפלופתיות ספוגיפורמיות מועברות (TSEs). מחלות נוירודגנרטיביות אלה פוגעות בבני אדם ובמספר מינים של בעלי חיים וכוללות סקראפי, אנצפלופתיה ספוגית זואונוטית של בקר (BSE), מחלת בזבוז כרונית של צוואר הרחם (CWD) ומחלת פריון הגמלים שזוהתה לאחרונה (CPD). אבחון TSEs מסתמך על זיהוי חיסוני של PrPSc על ידי יישום של שיטות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ושיטות אימונובלוט מערביות (WB) על רקמות אנצפלון, כלומר, גזע המוח (רמת obex). IHC היא שיטה נפוצה המשתמשת בנוגדנים ראשוניים (חד שבטיים או רב-שבטיים) כנגד אנטיגנים בעלי עניין בתאים של חתך רקמה. ניתן לדמיין את קשירת הנוגדן-אנטיגן על ידי תגובת צבע שנשארת מקומית באזור הרקמה או התא שבו הנוגדן היה ממוקד. לכן, במחלות פריונים, כמו בתחומי מחקר אחרים, טכניקות האימונוהיסטוכימיה אינן משמשות אך ורק למטרות אבחון אלא גם במחקרי פתוגנזה. מחקרים כאלה כוללים זיהוי דפוסי PrPSc וסוגים מאלה שתוארו קודם לכן כדי לזהות את זני הפריונים החדשים. מכיוון ש- BSE יכול להדביק בני אדם, מומלץ להשתמש במתקנים ו / או שיטות מעבדה לבטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3) לטיפול בבקר, מעלי גירה קטנים ודגימות צוואר הרחם הכלולות במעקב TSE. בנוסף, מומלץ להכלה ולציוד ייעודי לפריון, במידת האפשר, כדי להגביל את הזיהום. הליך PrPSc IHC מורכב משלב פירוק אפיטופ חומצה פורמית הפועל גם כאמצעי לנטרול פריונים, מכיוון שרקמות קבועות פורמלין ומשובצות פרפין המשמשות בטכניקה זו נשארות זיהומיות. כאשר מפרשים את התוצאות, יש להקפיד להבחין בין תיוג חיסוני לא ספציפי לבין תיוג מטרה. למטרה זו, חשוב להכיר ממצאים של תיוג חיסוני המתקבלים בחיות בקרה ידועות של TSE שלילי כדי להבדיל בין אלה לבין סוגים ספציפיים של תיוג חיסוני PrPSc , אשר יכולים להשתנות בין זני TSE, מינים מארחים וגנוטיפ prnp , המתוארים בהמשך.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על פי השערת הפריון, האיזופורם החריג (PrPSc) הוא המרכיב העיקרי, או היחיד, של הגורם הזיהומי באנצפלופתיות ספוגיפורמיות מועברות (TSEs). אישור לאבחון TSE מסתמך על זיהוי חיסוני של PrPSc על ידי יישום פרוטוקולים של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו / או שיטות אימונובלוט מערביות (WB) של רקמות אנצפלון1.

IHC היא שיטה המשתמשת בנוגדנים חד-שבטיים או, במקרים מסוימים, רב-שבטיים (כנוגדנים ראשוניים) כצעד ראשון בצביעת מערכת החיסון של אנטיגנים ממוקדים במיוחד הממוקמים בתאים של חתך רקמה. כל קשירת נוגדנים-אנטיגן ראשונית יעילה מומחשת לאחר מכן באמצעות נוגדנים משניים ספציפיים לנוגדנים הראשוניים. נוגדנים משניים אלה מצומדים לאנזימי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוהל IHC המתואר כאן הוא מרכיב בפרויקט המחקר FAIRJ-CT98-7021, "הקמת רשת אירופית למעקב אחר TSE מעלי גירה וסטנדרטיזציה והרמוניה של התהליך והקריטריונים לזיהוי מקרים חשודים". הוא עוקב אחר קריטריוני האבחון שהוגדרו על ידי הארגון העולמי לבריאות בעלי חיים, WOAH (שנקרא בעבר Office International des Épizooties, OIE)1 ומעבדת הייחוס האירופית לבעלי חיים TSEs 8,11. הליך IHC המתואר מוכר גם על פי NPISOIEC17025 (דרישות כלליות לכשירות מעבדות בדיקה וכיול) מאז 2008. הסמכה כזו מרמזת על מערכת ניהול איכותית המשלבת נהלים אופרטיביים סטנדרטיים, כוח אדם מוסמך, ציוד מכויל במדויק, בקרה קפדנית של נתונים וריאגנטים, הש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתחשב בכך שתיוג חיסוני מטרה לא ספציפי אפשרי, חשוב לוודא את רמת התיוג החיסוני הלא ספציפי בחיות ביקורת ידועות עם TSE שלילי. זהו צעד חשוב כדי לפרש כראוי תיוג חיסוני ספציפי של PrPSc 7 (איור 2). תיוג לא ממוקד על ידי נוגדנים נגד PrP נצפה כצביעה תוך-עצבית בדידה של חלקיקים עדינים (הניכרת יותר בגרעין ההיפוגלוסלי ובגרעין cuneate האביזר), חוטים דקים-ליניאריים לא סדירים של כתמים בנוירופיל (STN, V, גרעין אוליברי, גרעין cuneate אביזר, גרעין fascicular לטרלי, ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TSEs הן מחלות זואונוטיות פוטנציאליות. לאחר הופעתה של BSE בשנת 1986 בבריטניה, פורטוגל הפכה לאחת המדינות החברות באיחוד האירופי עם שכיחות גבוהה יותר של מחלה זו14,15. על מנת לשלוט במחלה זו, TSEs אחרים שהתפתחו (scrapie קלאסי ולא טיפוסי, גרסאות BSE, וכיום מעקב אחר מחלת בזבוז כרונית בצוואר הרחם), מנגנוני מעקב פותחו על ידי המנהל הכללי של מזון ווטרינרי (DGAV) והמכון הלאומי למחקר חקלאי ווטרינרי, IP (INIAV) המבצע את אבחון TSE כמעבדה הווטרינרית הלאומית TSE. מעבדה זו עוקבת אח.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מומן על ידי פרויקט POCI-01-0145-FEDER-029947 "הערכת סיכון למחלות בזבוז כרוני בפורטוגל" הנתמך על ידי FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. כמו כן, מחברי יחידת המחקר CECAV קיבלו מימון מה- FCT, במסגרת הפרויקט UIDB/CVT/0772/2020.אנו מודים לברוס קמפבל, מנהל מחקר (בדימוס), מרכז המחקר האזורי המערבי, USDA, על עזרתו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אתנול מוחלט LabchemLB0507-9010ללא אישור
         מדולל 90%, 70% ו-50% במים מזוקקים
קומפלקס אבידין-ביוטין ופרוקסידאז
ערכת Vectastain Elite ABC Peroxidase		Vector LaboratoriesPK-6100יש להכין ולערבב בעדינות 30 דקות לפני השימוש בהתאם להוראות הערכה. אין לערבב לאחר העמידה.
נוגדן משני ביוטיניל (Horse anti-mouse IgG H+L) מעבדות וקטורBA-2000-1.5מדלל ב-1/200 ב-TBS עם סרום רגיל של 10% סוס. הכן את הנפח הנדרש בהתאם למספר החלקים.
כרוגן דיאמינובנזידין- DAB, ערכת מצע, פרוקסידאז מעבדות וקטורSK-4100הכן לפני השימוש בהתאם להוראות הערכה.
השתמש ב-400 ומיקרו; L של פתרון לכל סעיף.
תא לחץ DakoCytomation PascalDAKOS2800
Ehrlich' s המטוקסילין:
המטוקסיליןמרק115938ממיסים 2 גרם המטוקסילין ב-100 מ"ל אתנול מוחלט. הוסף 100 מ"ל מים מזוקקים, 10 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ו -15 גרם אלום אשלגן תוך ערבוב מתמיד. הוסף 100 מ"ל גליצרין. תהליך החמצון הטבעי אורך חודשיים, לפני השימוש.
אתנול מוחלט LabchemLB0507-9010
חומצה אצטית קרחון Merck101830
אשלגן אלוםMerck1.01047.1000
גליצריןMerck1.04091.1000
תמיסת בלוק פרוקסידאז אנדוגני (ריכוז 3% H2O2):40 מ"ל מי חמצן (30% w/w) ב-360 מ"ל מתנול.
הכנה לפני השימוש
מי חמצן (30% w/w)שרלאוHI0136
מתנול Sigma Aldrich322415-2L
חומצה פורמית 98%Merck1.00264.1000מיקרוטום לא מדולל
nbsp;שנדון-AS325מיקרוטום שנדון-AS325
אמצעי הרכבה EntellanMerck107960מוכן לשימוש.
תמיסת בלוק סרום רגילה (20%) ב-TBS:
סרום רגיל לסוס
Gibco
16050-122 		הכן את הכרך הסופי בהתאם למספר הסעיפים בבדיקה
(200 ומיקרו; L של תמיסה לכל סעיף).
נוגדן ראשוני נגד PrP עכבר MAb 2G11 BIORADMCA2460PrP 146-R154R171182
Ovine כולל סקראפי לא טיפוסי, צוואר הרחם, חתול. לא מתאים לבקר.
לפי מספר הסעיפים בבדיקה (200 ומיקרו; L של תמיסה לכל סעיף) ודילול נוגדנים, הכינו נפח סופי ב-TBS בתוספת 10% מהסרום הרגיל מהזן בו גדל הנוגדן המשני (סרום רגיל של סוס)
דילול נוגדנים רגיל: MAb 2G11 1/100 אך יש לקבוע דילול עבודה בכל אצווה חדשה כדי לקבל את הריכוז שייתן את התיוג החזק ביותר עם הרקע הנמוך ביותר. לאחסון, הקפיא נפחי aliquot של מינימום 10 μ L למיקרו-צינורות סטריליים. הפשירו והשתמשו במנה אחת בכל פעם. 
נוגדן ראשוני נגד PrP עכבר MAb 12F10 קיימן  חברת כימיקלים 189710PrP142-160
בקר, לא מתאים לבקר
דילול נוגדנים רגיל: 1/200 אך יש לקבוע גם דילול עבודה. הכן כ-MAb 2G11
Shandon CoverplateTM תאThermo Scientific 
Shandon Sequenza® מרכז חיסון Thermo Scientific73300001
Shandon Sequenza® מתלה שקופיות ImmunstainingThermo Scientific73310017
Solution Citrate Buffer (10 מ"מ pH 6.1):2.55 גרם תלת-נתרן ציטראט דיהידרט  ו-0.255 גרם חומצת לימון בליטר אחד מים מטוהרים.
התאם את ה-pH של תמיסת העבודה ל-6.1 באמצעות תמיסת חומצת לימון של 10 מ"מ (1.05 גרם חומצת לימון ב-500 מ"ל מים מטוהרים)
הכן ביום הבדיקה. 
טרי-סודיום ציטראט דיהידראטסיגמא-אולדריך S4641-500G
חומצת לימוןSigma AldrichC0759
צנצנת וסל מכתיםDeltalab 19360
19361
שקופיות מיקרוסקופ Superfrost PlusVWR631-0108
תמיסת מלח Tris-Buffered (TBS) (50 מ"מ בסיס טריזמה; 0.8% NaCI; pH 7.6):10xTBS (תמיסת מלאי 0.5 מ' בסיס טריזמה; 8% NaCI; pH 7.6):
בסיס TRIZMA 60,57 גרם ו-NaCl 80 גרם במים מטוהרים של 800 מ"ל. התאם את ה-pH של תמיסת המלאי באמצעות חומצה הידרוכלורית 37% ואת הנפח הסופי לליטר אחד עם מים מטוהרים (שמור על 5± 3 ° C עד חודשיים)
לדלל תמיסת מלאי TBS 1/10 ביום הבדיקה. 
TRIZMA BASESigma AldrichT6066-1KG
נתרן כלורי (NaCl)Merck106404
קסילן ריאגנטים ITW של Panreac Applied Chem251769לא מדולל
&72110017

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
  2. Ramos-Vara, J. A. Principles and met....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Prion Protein DetectionImmunohistochemistryPrPSc ImmunolabelingTransmissible Spongiform EncephalopathiesBrainstem TissueAntibody StainingFormic Acid PretreatmentParaffin Embedded TissueBovine Spongiform EncephalopathyChronic Wasting Disease

Related Articles