מאמר שיטה

בידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מבוססי ציפה מדגימות תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים באמצעות מיקרו-בועות

DOI:

10.3791/64573

⸱

23 בדצמבר 2022

 ,  ,  , 
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת מחקר זה היא להדגים את ההיתכנות של הפרדה מבוססת ציפה כדי לבודד, להפעיל ולהרחיב תאי T אנושיים ראשוניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התהליך של בידוד תאי T מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) כדי להקים תרביות ex vivo הוא חיוני למחקר, בדיקות קליניות וטיפולים מבוססי תאים. במחקר זה מוצג פרוטוקול פשוט וחדשני לבידוד, הפעלה והרחבה של תאי T מ-PBMCs ex vivo. מחקר זה משתמש בטכנולוגיית מיון תאים המופעלת על ידי ציפה פונקציונלית (BACS) כדי לבודד ולהפעיל תאי T. בקצרה, הפרוטוקול כולל בחירה חיובית של תאי CD3+ מ-PBMCs שמקורם בלוקופאק, ולאחר מכן גירוי משותף של 48 שעות עם מיקרו-שבבים של סטרפטווידין (SAMBs) הקשורים מראש נגד CD28 לפני ההתמרה בלוחות של 24 בארות. מיקרו-שבבים פונקציונליים מציעים הזדמנות ייחודית להפעיל תאים באופן צף, מה שמוביל לפנוטיפים מתרבים המאפשרים התרחבות עם תשישות מינימלית. טכניקה זו מציעה תשישות מופחתת מכיוון שהמיקרו-בועות הממריצות נשארות צפות וחוזרות לחלק העליון של מדיום התרבית, ובכך מפחיתות את משך הזמן שהתאים המתרחבים נמצאים במגע עם גורמי הגירוי המשותף. התוצאות מצביעות על כך שתאי ה-T המבודדים והתרבית מקבלים מספיק גירוי כדי להפעיל ולהתרבות, אך לא במידה שמובילה להפעלת יתר, מה שמוביל לאחר מכן לתשישות, כפי שמודגם על ידי נוכחות של PD-1 מוגזם.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יותר מ-500 ניסויים קליניים בקולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T נערכים כיום ברחבי העולם, וארבעה מוצרים לטיפול בתאי CAR-T זמינים בשוק1. עם זאת, עדיין קיימים צרכי מחקר וייצור רבים של תאי CAR-T שיש לטפל בהם כדי לשפר את היעילות, המדרגיות וההצלחה ארוכת הטווח של טיפולים אלהשעשויים לרפא 2,3,4,5. המחקר והייצור הקליניים המאמצים של תאי CAR-T מתחילים בבידוד תאי T מדגימת דם היקפית ובגירוי, התמרה והרחבה של התאים המבודדים לאחר מכן. פרמטרים כגון התאוששות תאי T, טוהר ואותות הפעלה/תשישות דורשים שיקול דעת זהיר בעת בחירת טכניקות הבידוד והגירוי של התאים למחקר וייצור תאי CAR-T 3,4,6. חשוב לציין כי יש צורך בשיפור ההתמדה הטיפולית של טיפולים בתאי CAR-T על ידי מזעור המכשולים הביולוגיים הנובעים מתהליכי הייצור הנוכחיים, כגון תשישות תאי T, כדי לשפר את היעילות הטיפולית 6,7.

כחלופה לשיטות בידוד תאים מסורתיות כגון מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS) ומיון תאים המופעלים על ידי מגנט (MACS), כאן, מודגם מיון תאים המופעל על ידי ציפה (BACS) עם מיקרו-בועות לבידוד תאי T. הפרדת מיקרו-בועות משתמשת במיקרו-כדורים צפים וחלולים (microbubbles) כדי לקשור את המטרות ולהציף אותן אל פני השטח של דגימות נוזלים 8,9. על ידי תפקוד מיקרו-שבבים עם נוגדנים (כלומר, אנטי-CD3), ניתן לבחור באופן חיובי את אוכלוסיות תאי ה-T הרצויות מדגימות דם היקפיות. לאחר מכן, השימוש באוכלוסייה שונה של מיקרו-שבבים מתפקדי נוגדנים (כלומר, אנטי-CD28) כדי לעורר ולהפעיל תאי T שנבחרו באופן חיובי בהשעיה מודגם בעבודה זו. Microbubbles מציעים זרימת עבודה פשוטה וניתנת לכוונון של בידוד והפעלה שמייצרת תאי T מוכנים לתרבית תאים מושהית וליישומים במורד הזרם כגון שינוי גנטי והרחבה. באופן קריטי, הפעלת תאים צפים עם מיקרו-שבבים מקדמת גירוי תאים מאופק כדי למנוע תשישות מוגזמת של תאי T7.

עבור מחקר זה, ציטומטריה של זרימה הייתה הכלי העיקרי ששימש לניתוח הצלחת הבידוד, ההפעלה וההתמרה של המיקרו-בועות הפונקציונליות, כמו גם כדי לספק מידע מפורט על תת-האוכלוסיות הספציפיות הקיימות בשלבי הצמיחה וההתרחבות שלאחר הטרנסדוקציה. בנוסף לציטומטריה של זרימה, נעשה שימוש במיקרוסקופיה של שדה בהיר ופלואורסצנטי כדי לאשר את בריאות התא, המורפולוגיה והצלחת ההתמרת. בהתבסס על תוצאות אלה, הטכנולוגיה והפרוטוקול של microbubble מספקים חלופה מתכווננת ועדינה יותר לשיטות הבידוד וההפעלה המסורתיות הנמצאות כיום בשימוש; בפרט, תאים המופעלים על-ידי מיקרו-בועות מראים ביטוי נמוך יותר באופן ניכר של סמני תשישות של תאי T בהשוואה לתאים הנצפים בדרך כלל בכלים ובערכות המקובלים בתעשייה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בידוד של תאי T עם microbubbles באמצעות בחירה חיובית

הערה: פרוטוקול זה מפרט גישת בחירה חיובית של CD3+ בקנה מידה קטן באמצעות SAMBs.

  1. דגירה 3 x 108 PBMCs שהושגו באופן מסחרי ב-2.5 מ"ל של חיץ הפרדה עם נוגדן אנטי-CD3 (OKT3) שעבר ביוטינילציה בריכוז של 25 ננוגרם נוגדן למיליון תאים (25 ננוגרם/מ'). מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה, ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  2. הוסף מיקרו-שבבים של סטרפטווידין (SAMBs) ביחס של 0.5 (כמות SAMB):1 (כמות תאים) בהתאם לריכוז ה-SAMB המדווח של היצרן.
  3. מערבבים באמצעות רוטטור מסחרי מקצה לקצה (EOE) ב-20 סל"ד למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר.
  4. לאחר צנטריפוגה, התאים שנבחרו באופן חיובי יהיו בחלק העליון של המתלה עם ה- SAMBs. שאר התאים שלא נבחרו יהיו בכדור התא בתחתית הצינור. באמצעות פיפטה זכוכית 9 אינץ ', הכנס את הקצה שמתחת לשכבת תא הבועה לתחתית הצינור, שאף את כדור התא ואת subnatant עם פיפטה אלקטרונית ולהעביר אותם לצינור חדש.

2. גירוי משותף (הפעלה) של תאי T שנבחרו באופן חיובי

  1. יש להשעות את שכבת תאי הבועה שנותרה בצינור המקורי ב-1 מ"ל של מדיום שלם של תאי T (או מדיום רצוי אחר).
  2. ספירת התאים בתת-התא באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר באמצעות מונה תאים אוטומטי, והפחת ערך זה ממספר התא ההתחלתי כדי לקבוע את מספר התאים שנלכדו בשכבת תאי הבועה.
  3. לפני שלב זה, יש לערבב את הנוגדן הביוטינילי נגד CD28 עם SAMBs מסחריים למשך שעתיים לפחות כדי ליצור את ה-SAMBs המצומדים נגד CD28. פנה ליצרן ה-SAMBs כדי לקבוע את כמות הנוגדן נגד CD28 הדרושה להצמדה. הוסף את ה-SAMBs המצומדים נגד CD28 לתרחיף תאי הבועה כתוצאה משלב 2.1 באמצעות יחס של 1.5 (אנטי-CD28 SAMBs):1 (תאים).
  4. מערבבים באמצעות סיבוב EOE במשך 15 דקות, ולאחר מכן מתאימים את הנפח הכולל ל-2 מיליון תאים למ"ל עם מדיום שלם של תאי T או מדיום רצוי אחר בהתאם למספר התא המתקבל בשלב 2.2.

3. הרחבת התאים המעוררים במדיום תרבית התאים

  1. יש לפזר 1 מ"ל של תאים פעילים משלב 2.4 בריכוז של 2 M/mL לכל באר בצלחת של 24 בארות. דגירה בחממה לחה 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לאחר 24 שעות, יש להוסיף 50 U/mL של IL-2 ו-25 נ"ג/מ' של אנטי-CD3 מסיס (OKT3) כדי לעודד עוד יותר את ההתרחבות, כפי שחושב באמצעות המספר הראשוני של התאים המצופים ביום 0. החזירו את לוחית התא לאינקובטור CO2 הלח, ותנו לה לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

4. אופציונלי: התמרה של תאי T פעילים עם lentivirus

הערה: הגישה המשמשת כאן מותאמת מ- Prommersberger et al. 10.

  1. מפשירים את נגיף הלנטי בטמפרטורת החדר, ומערבבים לזמן קצר על ידי פיפטציה.
  2. הסירו בעדינות את ה-mid-natant, 600 μL מכל באר, מבלי לגעת בתאי הבת שנמצאים כעת בתחתית הבאר או בשכבת הבועה שנשארה על פני השטח של התמיסה.
  3. יש להוסיף 5 מיקרוגרם/מ"ל הקסדימתרין ברומיד לכל באר כדי לשפר את ההתמרה הנגיפית. הוסף את החלקיקים הלנטי-ויראליים בריבוי של זיהום (MOI) של 3 (חלקיקים לנטי-ויראליים לכל תא).
  4. צנטריפוגה את הצלחת במשך 45 דקות ב 800 x g ו 32 °C באמצעות האצה איטית וללא הפסקה להאטה. דגירה של התאים במשך 4 שעות באינקובטור CO2 לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר 4 שעות, הוסיפו 600 μL של מדיום תאי T שלמים וטריים הזמינים מסחרית ו-50 U/mL של IL-2 לכל באר, והחזירו את צלחת התא לחממת CO2 הלחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס להרחבת תאי T.

5. הרחבת תאי T (עם או בלי התמרה מוקדמת)

  1. כל יומיים, יש להסיר מחצית מהמדיום מהמדיום, להחליף אותו במדיום טרי ושלם של תאי T, ולהוסיף IL-2 בריכוז של 50 U/mL.
  2. ספרו את תאי ה-T פעמיים בשבוע כדי להעריך את צפיפות התאים. כאשר צפיפות התאים עולה על 2 x 10 6-2.5 x 106 תאים / מ"ל, להעביר את התאים לתוך כלי גדול יותר, לדלל אותם ל 5 x 105 תאים / מ"ל.

6. קצירת תאי T וציטומטריה של זרימה

  1. מערבבים בעדינות את תכולת כל באר על ידי צנרת למעלה ולמטה. הסר את כל התוכן של הבאר, כולל microbubbles, ולהעביר אותם לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  2. יש לשטוף כל באר ב-400 מיקרו-ליטר של DPBS נטולי סידן ומגנזיום (−/−), ולהעביר את התמיסה לצינור של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה בגודל 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לשאוף את supernatant, ולהשהות את גלולת התא ב 50 μL של חיץ הפרדה.
  4. כתם עם נוגדן הפעלה ותשישות / קוקטייל מכתים, ודגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. הכינו את הקוקטיילים המכתימים באופן הבא- קוקטייל הפעלה: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; קוקטייל תשישות: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ הפרדה ומערבבים בעדינות. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשטוף נוגדנים עודפים. שאפו את הסופר-נאטנט לחלוטין.
  6. יש לתלות את כדור התא ב-1 מ"ל של חיץ הפרדה, ולהעביר לכלי מתאים (למשל, צינור FACS, צלחת 96 בארות וכו') לצורך ניתוח ציטומטריה של זרימה. ערכת ניתוח הציטומטריה המומלצת של זרימה מפורטת באיור 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T בודדו מ-PBMCs שנרכשו וצופו להפעלה כמתואר בפרוטוקול. דגימות הבקרה השליליות (PBMCs שנרכשו) לא הופעלו. דגימות בקרה אלה נכללו כדי להדגים את ההשפעה שהייתה לתהליך ההפעלה של microbubble על דגימות הניסוי בהשוואה לבקרות תאי T שלא נגעו בהן ולא עוררו, והבטיחו כי סמני ההפעלה שנצפו היו תוצאה של גורמי ההפעלה הנוספים ולא היו טבועים בתאי ה-T עצמם. לפי מתווה הניסוי באיור 2, התאים נזרעו ב-2 x 106 תאים למ"ל במדיום תאי T, ולא נגעו/לא עוררו אותם או עוררו אותם יחד עם אנטי-CD3 (שיבוט OKT3) ואנטי-C...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר מאפשר בידוד של תאי T מדגימות PBMC והפעלה של תאי T מרחפים במדיית תרבית עם מיקרו-בועות. שיטה זו מסתמכת על מיקרו-שבבים פונקציונליים שהציפה הטבועה בהם מציעה הזדמנות ייחודית להכניס אותות מגרים משותפים לתאים ולהפעיל אותם בזמן שהם תלויים בתווך תרבית, ובכך להפחית את החשיפה של התאים המתרחבים לגירוי ממושך; גירוי יתר כזה יכול לגרום לביטוי מוגבר של סמני תשישות של תאי T וליעילות טיפולית מופחתת11. תאי T מגורים המחוברים באופן צף למיקרו-שבבים פונקציונליים מייצרים תאי בת שלא נגעו בהם, אשר צונחים ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים, בעת ההגשה, הם עובדי Akadeum Life Sciences, המייצרת ומוכרת מוצרי הפרדת מיקרו-בועות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולGibco21985-023CAS: 60-24-2
צלחות תרבית מרובות בארות Biologix צלחות 24 בארותVWR 76081-560
ביוטין אנטי אנושי CD28 (28.2) נוגדןBiolegend302904
ביוטין אנטי אנושי CD3 (OKT3) נוגדןBiolegend317320
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםGibco14190-136
תוסף GlutaMAXThermofisher35050061
Human Recombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
חלקיקים לנטי-ויראלי rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LeukopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
PBMCs אנושיים רגיליםBioIVTHUMANHLPB-0002562
פניצילין/סטרפטומיצין 100X לתרבית רקמותVWR97063-708CAS: 8025-06-7
פוליברן מגיב זיהום/טרנספקציהMillipore SigmaTR-1003-GCAS:28728-55-4
מאגר אנושי AB סרום פלזמה שמקורו בחוםמומת מחקר חדשניISERABHI100mL
RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX,Gibco72400047
Streptavidin (כולל מאגר ההפרדה של אקדמיום)Akadeum11110-000
ערכת מיקרו-בועות HEPES

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T Cell IsolationMicrobubble ActivationPeripheral Blood MononuclearT Cell ExpansionBuoyancy Activated Cell SortingCD3 Positive SelectionAnti CD28 MicrobubblesFlow CytometryT Cell ExhaustionActivation Marker CD69

מאמרים קשורים