מכניקת DNA וכרומטין

Rohini Muthuswami

תקציר

מאמרים שנדונו:

Ling, X. et al. ניתוח זרימה ציטומטרי של סמנים ביולוגיים לאיתור פגמים תפקודיים בזרע אנושי. כתב העת לניסויים חזותיים. (182), e63790 (2022).

Arya, V., Dutta, A., Muthuswami, R. ספקטרוסקופיה CD לחקר אינטראקציות חלבון-DNA. כתב העת לניסויים חזותיים. (180), e63147 (2022).

Bobde, C. R. et al. אפיון במבחנה של מלווים היסטונים באמצעות מבחנים אנליטיים, נפתחים ומלווים. כתב העת לניסויים חזותיים. (178), e63218 (2021).

Kang, Y., Bae, S., An, S., Lee, J. Y. פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת וילון DNA. כתב העת לניסויים חזותיים. (181), e63501 (2022).

Qasim, M. N. et al. פרופיל גנומי של אינטראקציות קשירת גורם שעתוק-DNA בקנדידה אלביקנס: שיטת CUT&RUN מקיפה וזרימת עבודה לניתוח נתונים. כתב העת לניסויים חזותיים. (181), e63501 (2022).

מאמר מערכת

כרומטין הוא מבנה דינמי ונוזלי הנשמר על ידי חלבון-DNA כמו גם אינטראקציות חלבון-חלבון. גם חלבוני היסטון וגם חלבונים שאינם היסטונים מעורבים בשמירה על מבנה הכרומטין. כיצד מתווכות אינטראקציות אלה וכיצד מבנה הכרומטין משתנה במהלך תהליכים הכוללים DNA כמצע?

טכניקות רבות פותחו כדי לשפוך אור על הדינמיקה של חלבון-DNA כמו גם אינטראקציות חלבון-חלבון. אלה כוללים הן טכניקות ביופיזיקליות כגון ספקטרוסקופיה CD והן שיטות ביוכימיות כגון כרומטוגרפיה של סינון ג'ל. אוסף זה מדגיש כמה מהטכניקות הללו שניתן להשתמש בהן כדי לחקור את הדינמיקה של ארכיטקטורת הכרומטין.

ניתן לנתח את שלמות ה-DNA על ידי ציטומטריית זרימה (FACS), ולינג ואחרים ^{מתאימים שיטה} זו לאיתור פגמים תפקודיים בזרע אנושי. ניתן להעריך את הפיזיולוגיה של הזרע באמצעות סמנים ביולוגיים כגון נזק ל-DNA, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואפופטוזיס זרע. לינג ועמיתיו מראים כי ניתן להתאים בקלות את FACS לניטור כל אחד מהפרמטרים הללו כדי להעריך את הפיזיולוגיה של הזרע, ובכך להוכיח כי הטכניקה היא ערכת כלים מעשית ואמינה לאבחון אי פוריות גברית.

ספקטרוסקופיה CD היא אולי אחת השיטות הקלות ביותר לחקור את הקונפורמציה של חלבון ו-DNA. לכל קונפורמטור של DNA יש דפוס פס חתימה. ניתן לתאם את השינוי בדפוס הלהקה עם השינוי בקונפורמציה של ה-DNA, וכך, ניתן לנטר את השינוי בארכיטקטורת ה-DNA בנוכחות חלבונים אינטראקטיביים באמצעות ספקטרופוטומטר CD. Arya et ^al.2 משתמשים בטכניקה זו כדי לחקור את השינוי ב-DNA הנגרם על ידי אינטראקציה עם חלבון שיפוץ הכרומטין התלוי ב-ATP, SMARCAL1, בהיעדר ונוכחות של ATP. הם מראים כי ניתן לתאם את השינויים במבנה ה-DNA עם פעילות השעתוק של החלבון.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ומבחנים נפתחים משמשים באופן שגרתי לניטור אינטראקציות חלבון-חלבון. הרכבת נוקלאוזומים מתאפשרת על ידי מלווים היסטונים הנקשרים להיסטונים. Bobde et ^al.3 מתארים שיטות ומבחנים שניתן להשתמש בהם כדי לזהות אם פונקציית חלבון נתונה היא מלווה היסטון או לא.

כיצד אנו חוקרים את מנגנוני הרכבת הנוקלאוזומים בזמן אמת? טכניקות הדמיה של מולקולה בודדת כגון וילון DNA פותחו כדי להמחיש את תהליך ההרכבה בזמן אמת. וילון DNA הוא טכניקה היברידית המשלבת נזילות שומנים, מיקרופלואידיקה ומיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל כדי לדמות את אינטראקציית החלבון-DNA בזמן אמת. קאנג ואחרים ^מתארים את וילון הדנ"א כטכניקה לחקר המנגנון העומד בבסיס הרכבת מלווה ההיסטון, Abo1, מ-S. pombe. הטכניקות המתוארות מספקות דרך לבחון דינמיקת כרומטין, הממלאת תפקיד חשוב הן ביציבות הגנומית והן בוויסות האפיגנטי של תהליכים המעורבים בחומר הגנטי.

משקעים חיסוניים מסורתיים של כרומטין (ChIP) דורשים נוגדנים ספציפיים לחלבון המבוקש. פעמים רבות, הנוגדנים אינם ספציפיים מספיק, מה שמוביל לתוצאות חיוביות כוזבות, במיוחד בעת בחינת אתרי הקישור של גורמי השעתוק. נוגדנים גם לא תמיד זמינים לחלבונים בכל האורגניזמים. Candida albicans הוא אורגניזם כזה שעבורו נוגדנים אינם זמינים. שיטת Cut and Run עוקפת את המגבלות הללו על ידי מיזוג MNase לגורם השעתוק המעניין. Qasim et ^al.5 מתארים את השימוש בשיטה זו כדי לקבוע את אתרי הקישור של גורמי שעתוק ב - C. albicans.

השיטות המתוארות באוסף זה מספקות הצצה לטכניקות העומדות לרשות החוקרים. כל השיטות הללו מגוונות וניתנות להתאמה בקלות כדי לענות על השאלות שהחוקרים שואלים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

למחברים אין אישורים.

מקורות

Ling, X., et al. Flow cytometric analysis of biomarkers for detecting human sperm functional defects. Journal of Visualized Experiments. (182), e63790(2022).
Arya, V., Dutta, A., Muthuswami, R. CD spectroscopy to study protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (180), e63147(2022).
Bobde, C. R., et al. In vitro characterization of histone chaperones using analytical, pull-down and chaperoning assays. Journal of Visualized Experiments. (178), e63218(2021).
Kang, Y., Bae, S., An, S., Lee, J. Y. Deciphering molecular mechanism of histone assembly by DNA curtain technique. Journal of Visualized Experiments. (181), e63501(2022).
Qasim, M. N., et al. Genome-wide profiling of transcription factor-DNA binding interactions in Candida albicans: A comprehensive CUT&RUN method and data analysis workflow. Journal of Visualized Experiments. (181), e63501(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה