Method Article

הערכת תהליכים וקינטיקה של ביטוי כיטין דאצטילאז רקומביננטי בתאי E. coli Rosetta pLysS באמצעות טכניקה סטטיסטית

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הנוכחי, יושמה טכניקה סטטיסטית, עיצוב מרוכב מרכזי (CCD), כדי לייעל את תנאי התהליך לביטוי של כיטין דאצטילאז חיידקי רקומביננטי (BaCDA) בתאי E. coli Rosetta pLysS. השימוש ב-CCD הביא לעלייה של פי 2.39~ בביטוי ובפעילות של BaCDA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות צבר חשיבות המסלול הירוק יותר של דה-אצטילציה של כיטין לצ'יטוזן באמצעות האנזים כיטין דאצטילאז. לצ'יטוזן שהומר אנזימטית עם מאפיינים מחקים יש מגוון רחב של יישומים, במיוחד בתחום הביו-רפואי. דווח על מספר כיטין דאצטילאז רקומביננטיים ממקורות סביבתיים שונים, אך אין מחקרים על אופטימיזציה של תהליכים לייצור כיטין דאצטילאז רקומביננטי אלה. המחקר הנוכחי השתמש בתכנון המרוכב המרכזי של מתודולוגיית משטח התגובה כדי למקסם את ייצור החיידק הרקומביננטי כיטין דאצטילאז (BaCDA) ב-E. coli Rosetta pLysS. תנאי התהליך האופטימליים היו ריכוז גלוקוז של 0.061%, ריכוז לקטוז של 1%, טמפרטורת דגירה של 22 מעלות צלזיוס, מהירות תסיסה של 128 סל"ד ו-30 שעות תסיסה. בתנאים אופטימליים, הביטוי עקב השראת לקטוז החל לאחר 16 שעות של תסיסה. הביטוי המקסימלי, הביומסה ופעילות BaCDA נרשמו 14 שעות לאחר האינדוקציה. במצב האופטימלי, פעילות BaCDA של BaCDA מבוטא גדלה פי 2.39~. אופטימיזציה של התהליך הפחיתה את מחזור התסיסה הכולל ב-22 שעות ואת זמן הביטוי ב-10 שעות לאחר האינדוקציה. זהו המחקר הראשון המדווח על אופטימיזציה של תהליך ביטוי כיטין דאצטילאז רקומביננטי באמצעות עיצוב מרוכב מרכזי ופרופיל קינטי שלו. התאמת תנאי הגידול האופטימליים הללו יכולה לגרום לייצור חסכוני בקנה מידה גדול של המונרן דאצטילאז שנחקר פחות, ולצאת לדרך ירוקה יותר לייצור צ'יטוזן בדרגה ביו-רפואית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיטין, β מבנית, פולימר טבעי מקושר לגליקוזיד 1-4, הוא הפוליסכריד השני בשכיחותו בטבע אחרי תאית. למרות עובדה זו, לכיטין יש יישומים תעשייתיים מוגבלים בשל חוסר המסיסות שלו1. צוואר בקבוק זה מטופל על ידי הכפפת כיטין ל-N-deacetylation, המקנה מטען חיובי ומגביר את המסיסות של הפולימר המתקבל, צ'יטוזן1. ניתן לשנות את הכיטין לצ'יטוזן בשני מסלולים שונים: כימי ואנזימטי. היישום הביו-רפואי של צ'יטוזן דורש דה-אצטילציה מבוקרת ומוגדרת, המוגבלת בדרכים כימיות 2,3. ניתן לטפל במגבלה זו באמצעות כיטין דאצטילאז (CDAs), גישה אנזימטית ירוקה לתהליך הד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מצב תקשורת ותרבות ביטוי

  1. הפוך את וקטור ה-pET-22b המכיל את הגן BaCDA לתאים מוכשרים של E. coli Rosetta pLysS בשיטת הלם חום, כמתוארב-15.
    הערה: יש לנקוט בזהירות בעת עבודה עם מיקרואורגניזמים. כל העבודות המיקרוביולוגיות צריכות להתבצע בתוך מכסה המנוע של ארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום.
  2. בצע את מחקר הביטוי הראשוני במצע שחפת המכיל 0.05% (w/v) גלוקוז ו-0.2% (w/v) לקטוז ב-16 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. גדל 6.792 x 107 תאי E. coli Rosetta pLysS ב-100 מ"ל של מדיה המכילה פלסמיד משובט BaCDA עד שהוא מגיע לשלב הנייח. בתנאי הגידול שהוזכרו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטימיזציה של תהליך הביטוי של אנזים רקומביננטי פריפלזמי כיטין דאצטילאז ב-E. coli באמצעות תכנון מרוכב מרכזי (CCD)
מבנה ה-pET22b-Ba CDA, כאשר גדל בתנאים לא אופטימליים, נתן תפוקת ביומסה מקסימלית ופעילות BaCDA של 22.26 ±-0.98 גרם/ליטר ו-84.67 ±-0.56 U/L, בהתאמה. במחקר הנוכחי אומצה גישה סטטיסטית CCD כדי למצוא את תנאי התהליך האופטימליים לביטוי אנזים רקומביננטי פריפלזמי כיטין דאצטילאז בתאי E. coli Rosetta pLysS. חמשת הפרמטרים של התהליך, טמפרטורת הד.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לצ'יטוזן, כיטין נטול אצטיליות, יש יישומים רבים, במיוחד בתחום הביו-רפואי30. עם זאת, יכולת השחזור של צ'יטוזן לגבי מידת האצטילציה (DA) ודפוס האצטילציה (PA) היא דאגה מרכזית בנוסף לחששות סביבתיים אחרים. הנתיב הירוק יותר, באמצעות אנזימים, נוצל לפיכך. ניתן להשתמש במערך ה-CDAs כדי ליצור צ'יטוזן עם דפוס ייחודי של דה-אצטילציה, מה שיגדיל את היישומים הביו-רפואיים שלהם 4,5. בעבודה הקודמת שלנו, הגן המשובט BaCDA התבטא בתאי E. coli Roset.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לאקדמיית מניפל להשכלה גבוהה (MAHE) על קרן MAHE UNSW, והמחברים מבקשים להודות למועצה למחקר מדעי ותעשייתי - קבוצת פיתוח משאבי אנוש (CSIR-MHRD), ממשלת הודו על מלגת מחקר בכירה, מכתב פרס מספר 09/1165(0007)2K19 EMR-I מתאריך 31.3.2019.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ערכת בדיקת ערכות
אצטטMegazyme, אירלנדK-ACETAKהפרוטוקול שונה מעט ומותאם לביצוע הבדיקה בערכת
הערכת גלוקוזAgappe diagnosis Ltd., India12018013הפרוטוקול שונה מעט ומותאם לביצוע הבדיקה בצלחת
96 בארות<חזק>כימיקלים
חומצה אצטיתהיי-מדיה, הודוAS001משמש להכנת תמיסת צביעה וניקוי SDS-PAGE
אקרילאמידהיי-מדיה, הודוMB068משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
אמוניום פרסולפטהיי-מדיה, הודוMB003משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
ביס-אקרילאמידהיי-מדיההודוMB005משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, הודוMB092משמש להכנת תמיסת צביעה וניקוי SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, הודוMB153משמש להכנת הבדיקה של ברדפורד
אתילן גליקול צ'יטוזןסיגמא-אולדריץ', ארה"בE1502שימש להכנת אתילן גליקול כיטין ואתילן גליקול כיטין שימש כמצע לתגובה אנזימטית
D-גלוקוזHi-media, הודוMB037שימש כרכיב מדיה.
אימידזולהיי-מדיה, הודוGRM1864משמש במאגר ליזה
לקטוזהיי-מדיה, הודוGRM017משמש כרכיב מדיה.
מתנולפינאר, הודו30930LC250משמש להכנת תמיסת צביעה וניקוי SDS-PAGE
נתרן כלורי (NaCl)היי-מדיה, הודוMB023משמש במאגר ליזה
חומצה זרחתיתHi-media, הודוMB157משמש להכנת בדיקת ברדפורד
נתרן דודציל סולפט (SDS)Hi-media, הודוGRM6218משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
נתרן פוספט דו-בסיסינטול מים היי-מדיה, הודוMB024משמש להכנת מלח שחפת למדיה ומאגר לתגובה אנזימטית.
נתרן פוספט חד בסיסינטול מים Hi-media, הודוGRM3964משמש להכנת מלח שחפת למדיה ומאגר לתגובה אנזימטית.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Hi-media, הודוMB026משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
Tris baseHi-media, הודוMB029משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
TryptoneHi-media, הודוRM7707משמש כרכיב מדיה.
תמצית שמריםהיי-מדיה, הודוRM027משמש כרכיב מדיה.
Equipment
AlphaImager יחידת תיעוד ג'ל של HPProteinSimple, ארה"ב92-13823-00משמש לצילום תצלומי SDS-PAGE
מיקסר BenchtopEppendorf, גרמניה 9.776 660משמש לשמירה לתגובה אנזימטית עם מתאם 2 מ"ל
שייקר ביואינקובטורמכשירי טרישול, הודו13410622משמש לדגירת תרבית חיידקים בטמפרטורות שונות
ובביוספקטרופוטומטראפנדורף, גרמניה 6135000009משמש לביצוע כל הקריאות הספקטרוסקופיות
צנטריפוגת קירוראפנדורף, גרמניה 5805000017משמש לתרבית צנטריפוגות, ליזאט וכל שאר פרוטוקולי הצנטריפוגה
יבשLabnet International, ארה"בS81522039משמש לניקוי דגימת חלבון עבור מיקרופיפטות SDS-PAGE
Eppendorf, גרמניה 3123000900משמש דרך הפרוטוקול למדידות נפח
שייקר נדנדהמכשירי טרישול, הודו11770719משמש לנער ג'ל SDS-PAGE לצביעה והימנעות
יחידת SDS-PAGEBio-Rad, ארה"ב1658001FCמשמש ליציקה והפעלה של ג'ל SDS-PAGE
אולטרה סוניקטורסוניקטור & Materials, Inc., ארה"בVCX 130משמש לליזה של תא החיידק על ידי אולטרה סוניקציה
איזון שקילהSartorius, גרמניהBSA124 Sמשמש למדידת משקל לאורך הפרוטוקול
Devices
Nanosep מכשירים צנטריפוגליים עם ממברנת אומגה (3 kDa)PALL מדעי החיים, ארה"בOD003C33משמש להפרדת אנזים אחר מצע treatment
SoftwaresVersionפותח ב-MINITAB
17.0  (גרסת ניסיון)  אוניברסיטת פנסילבניהסטייט שימש לתכנון המודל הניסיוני ולניתוח הנתונים
ImageJ1.53oהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)משמש לניתוח רמת הביטוי באמצעות SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck- Millipore, ארה"ב69744מאוחסן ב & מינוס; 20 & מעלות; C
Cells
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, ארה"ב70956מתוחזק ב-Luria– ציר ברטאני (LB) המכיל 25% גליצרול במינוס & 80 מעלות; ג
בצלחת 96 באר סל"ד אמבט

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadav, M., et al. Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing. 6 (1), 1-20 (2019).
  2. Anil, S. Potential medical applications of chitooligosaccharides. Polym....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chitin DeacetylaseRecombinant ExpressionE Coli RosettaChitosan ProductionProcess OptimizationCentral Composite DesignResponse Surface MethodologyEnzyme KineticsLactose InductionFermentation Process
Video Coming Soon

Related Articles