מאמר שיטה

הערכת תהליכים וקינטיקה של ביטוי כיטין דאצטילאז רקומביננטי בתאי E. coli Rosetta pLysS באמצעות טכניקה סטטיסטית

DOI:

10.3791/64590

⸱

10 במרץ 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול הנוכחי, יושמה טכניקה סטטיסטית, עיצוב מרוכב מרכזי (CCD), כדי לייעל את תנאי התהליך לביטוי של כיטין דאצטילאז חיידקי רקומביננטי (BaCDA) בתאי E. coli Rosetta pLysS. השימוש ב-CCD הביא לעלייה של פי 2.39~ בביטוי ובפעילות של BaCDA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות צבר חשיבות המסלול הירוק יותר של דה-אצטילציה של כיטין לצ'יטוזן באמצעות האנזים כיטין דאצטילאז. לצ'יטוזן שהומר אנזימטית עם מאפיינים מחקים יש מגוון רחב של יישומים, במיוחד בתחום הביו-רפואי. דווח על מספר כיטין דאצטילאז רקומביננטיים ממקורות סביבתיים שונים, אך אין מחקרים על אופטימיזציה של תהליכים לייצור כיטין דאצטילאז רקומביננטי אלה. המחקר הנוכחי השתמש בתכנון המרוכב המרכזי של מתודולוגיית משטח התגובה כדי למקסם את ייצור החיידק הרקומביננטי כיטין דאצטילאז (BaCDA) ב-E. coli Rosetta pLysS. תנאי התהליך האופטימליים היו ריכוז גלוקוז של 0.061%, ריכוז לקטוז של 1%, טמפרטורת דגירה של 22 מעלות צלזיוס, מהירות תסיסה של 128 סל"ד ו-30 שעות תסיסה. בתנאים אופטימליים, הביטוי עקב השראת לקטוז החל לאחר 16 שעות של תסיסה. הביטוי המקסימלי, הביומסה ופעילות BaCDA נרשמו 14 שעות לאחר האינדוקציה. במצב האופטימלי, פעילות BaCDA של BaCDA מבוטא גדלה פי 2.39~. אופטימיזציה של התהליך הפחיתה את מחזור התסיסה הכולל ב-22 שעות ואת זמן הביטוי ב-10 שעות לאחר האינדוקציה. זהו המחקר הראשון המדווח על אופטימיזציה של תהליך ביטוי כיטין דאצטילאז רקומביננטי באמצעות עיצוב מרוכב מרכזי ופרופיל קינטי שלו. התאמת תנאי הגידול האופטימליים הללו יכולה לגרום לייצור חסכוני בקנה מידה גדול של המונרן דאצטילאז שנחקר פחות, ולצאת לדרך ירוקה יותר לייצור צ'יטוזן בדרגה ביו-רפואית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיטין, β מבנית, פולימר טבעי מקושר לגליקוזיד 1-4, הוא הפוליסכריד השני בשכיחותו בטבע אחרי תאית. למרות עובדה זו, לכיטין יש יישומים תעשייתיים מוגבלים בשל חוסר המסיסות שלו1. צוואר בקבוק זה מטופל על ידי הכפפת כיטין ל-N-deacetylation, המקנה מטען חיובי ומגביר את המסיסות של הפולימר המתקבל, צ'יטוזן1. ניתן לשנות את הכיטין לצ'יטוזן בשני מסלולים שונים: כימי ואנזימטי. היישום הביו-רפואי של צ'יטוזן דורש דה-אצטילציה מבוקרת ומוגדרת, המוגבלת בדרכים כימיות 2,3. ניתן לטפל במגבלה זו באמצעות כיטין דאצטילאז (CDAs), גישה אנזימטית ירוקה לתהליך הדאצטילציה 4,5.

כיטין דאצטילאז שייך למשפחת הפחמימות אסטראז 4 (CE-4), המוגדרת במאגר האנזימים הפעילים בפחמימות (CAZY). האנזימים ממשפחת CE-4 חולקים את תחום הומולוגיה NodB או פוליסכריד דאצטילאז כאזור השמור העיצוב המרוכב המרכזי (CCD), כלי סטטיסטי, משמש לאופטימיזציה של מספר אנזימים משני כיטין מסוג פרא 6,7,8,9. עם זאת, השלבים במורד הזרם בשימוש באורגניזמים מסוג בר הופכים מייגעים, ומכאן המעבר לאנזימים רקומביננטיים 10,11,12,13,14,15,16,17. בשנים האחרונות, CDA רקומביננטי הלופילי ממקורות ימיים צבר חשיבות בשל קלותם ביישום תעשייתי וייצור של צ'יטוזן בדרגה ביו-רפואית18,19.

לייצור אנזימים רקומביננטיים ב-E. coli יש מגבלה על התהליך, ויש צורך באופטימיזציה של המדיה מכיוון שהביטוי שלו ב-E. coli משתנה בהתאם לגן ולפלסמיד המשמש20. לפיכך, סינון של תהליך מתאים ופרמטרים תזונתיים הופך להיות חשוב. גורם אחד בכל פעם (OFAT), שיטת האופטימיזציה הנפוצה, דורשת משאבים וזמן אדירים לביצוע ניסויים שלב אחר שלב. שיטה זו סובלת ממחסור במידע סטטיסטי לגבי האינטראקציה בין הפרמטרים 20,21,22,23. לכן, CCD של מתודולוגיית משטח התגובה (RSM) אומץ כדי לחקור את תפוקת הביטוי של חיידק הלופילי כיטין דאצטילאז (BaCDA) ופעילות BaCDA ב- E. coli Rosetta pLysS. הפרמטרים שנלקחו בחשבון לאופטימיזציה של הביטוי במארח E. coli היו ריכוז הלקטוז, ריכוז הגלוקוז, טמפרטורת הדגירה, קצב התסיסה וזמן הדגירה. ברוב מחקרי הביטוי של E. coli, מדיה Luria Bertani (LB) עם Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) שימשה כמשרה. תוספת זו של IPTG דרשה ניטור גדילה קבוע24. תיווכים חוזרים ונשנים אלה במהלך תהליך התסיסה פותחים גם דרכים לזיהום. לפיכך, קבוצות מחקר עברו למרק נהדר (TB) עם לקטוז כמשרה. הכללת הלקטוז במדיה במקום IPTG נותנת מענה לחשש זה; E. coli צורך את הלקטוז הזה ומייצר אלו-לקטוז כתוצר לוואי, וכתוצאה מכך מצב של אינדוקציה עצמית. מדיה זו של השרה עצמית כוללת גליצרול, שהראה תשואות משופרות של חלבון רקומביננטי25.  ביטוי יתר זה של חלבונים רקומביננטיים בתקשורת שחפת שופר עוד יותר על ידי אופטימיזציה של פרמטרי התהליך. במחקר הנוכחי יושם עיצוב מרוכב מרכזי כדי לייעל את הביטוי ההטרולוגי של BaCDA הלופילי בתאי E. coli Rosetta pLysS. פרמטרי התהליך שנבחרו היו טמפרטורת הדגירה, קצב התסיסה וזמן הדגירה, והפרמטרים התזונתיים שהוערכו היו ריכוז גלוקוז ולקטוז. ביטוי BaCDA ההלופילי הוערך עם המצב האופטימלי החזוי ותוקף צולב באמצעות SDS-PAGE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מצב תקשורת ותרבות ביטוי

  1. הפוך את וקטור ה-pET-22b המכיל את הגן BaCDA לתאים מוכשרים של E. coli Rosetta pLysS בשיטת הלם חום, כמתוארב-15.
    הערה: יש לנקוט בזהירות בעת עבודה עם מיקרואורגניזמים. כל העבודות המיקרוביולוגיות צריכות להתבצע בתוך מכסה המנוע של ארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום.
  2. בצע את מחקר הביטוי הראשוני במצע שחפת המכיל 0.05% (w/v) גלוקוז ו-0.2% (w/v) לקטוז ב-16 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד. גדל 6.792 x 107 תאי E. coli Rosetta pLysS ב-100 מ"ל של מדיה המכילה פלסמיד משובט BaCDA עד שהוא מגיע לשלב הנייח. בתנאי הגידול שהוזכרו, תאי E. coli Rosetta pLysS מגיעים לצפיפות אופטית 600 (OD600) של 10.85 ± 0.21.
    הערה: הרכב מדיית ה-TB (% w/v): טריפטון, 1.2; תמצית שמרים, 2.4; גליצרול, 0.6; ו-1x מלח TB (17 מ"מ KH2PO4 ו-74 מ"מ K2HPO4)17.

2. אופטימיזציה ותכנון ניסויים

  1. לתכנן את הניסויים ולהתאים את המודל הפולינומיאלי מסדר שני בתכנון מרוכב מרכזי באמצעות תוכנת הכלים הסטטיסטיים. התוכנה הסטטיסטית ששימשה במחקר הנוכחי הייתה MINITAB 17.0 (גרסת ניסוי).
    1. לשם כך, פתח את התוכנה ולחץ על הכפתורים הבאים: Stat > DoE > משטח תגובה > צור משטח תגובה > עיצוב תגובה > מרוכב מרכזי. הפלט מופיע כתיבת דו-שיח.
  2. הזינו את חמשת הפרמטרים, טמפרטורת הדגירה, קצב התסיסה, זמן הדגירה, ריכוז הגלוקוז וריכוז הלקטוז, בחמש רמות (-2, -1, 0, +1, +2) בתיבת הדו-שיח.
    1. לשם כך, הזן את הפרמטרים עם הרמות בתיבת הדו-שיח, הזן את הפרטים של כל הפרמטרים ולחץ על אישור. זה יוצר את מטריצת התכנון הניסיונית עם שישה שכפולים בנקודת המרכז, הדורשים 32 ריצות ניסיוניות. התוכנה מייצרת טבלה המכילה את הפרמטרים ורמותיהם במונחים מקודדים ולא מקודדים, המשמשים באופטימיזציה של התהליך באמצעות CCD (טבלה 1).
  3. בצע את 32 הניסויים עם התנאים שנוצרו על ידי התוכנה. הזינו את תוצאות הניסוי למטריצת תכנון הניסוי (שנוצרה על ידי התוכנה) המכילה רמות ופרמטרים במונחים של יחידות מקודדות ולא מקודדות (טבלה 2).
  4. לנתח את מטריצת התכנון הניסויי (טבלה 2) באמצעות התוכנה. לשם כך, פתח את התוכנה והזן את התגובה לגיליון הנתונים. בחר עמודת תגובה > סטטיסטיקה > משטח תגובה של DoE > > ניתוח עיצוב משטח תגובה > אישור. הפלט מנותח למובהקות סטטיסטית, ומודל נחזה על ידי התוכנה.

טבלה 1: הפרמטרים ורמותיהם במונחים מקודדים ולא מקודדים המשמשים בתכנון הניסוי להערכת הביטוי של כיטין דאצטילאז רקומביננטי בתאי E. coli Rosetta pLysS. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: מטריצת תכנון ניסויית עם פעילות Ba CDA ניסיונית וחזויה (ביטוי) של כיטין דאצטילאז רקומביננטי בתאי E. coli Rosetta pLysS. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

3. אימות המודל

  1. אמת את המודל המעוצב באמצעות כלי אופטימיזציית התגובה הזמין בתוכנה.
  2. חזור על התסיסה בתנאים אופטימליים שחזתה התוכנה והשווה את הערך הניסיוני לערך החזוי על ידי התוכנה.
    1. לשם כך, פתח את התוכנה ובחר בעמודת תגובה > סטטיסטיקה > DoE > משטח תגובה > ממטב תגובה > מקסימום > אישור. הפלט הוא תנאי תהליך וערכים אופטימליים הצפויים על ידי התוכנה. חזור על התסיסה בתנאים אופטימליים חזויים והשווה את הערכים.

4. שיטות אנליטיות

  1. ביטוי, ביומסה וכימות חלבונים
    1. בצע את התסיסה ב-32 תנאים שניתנו על ידי התוכנה במטריצת התכנון הניסויי (טבלה 2). השג את הגלולה לאחר כל ריצה על ידי צנטריפוגה של התרבית ב-5,405 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שקלו את כדור התא כדי לקבוע את תפוקת הביומסה.
      הערה: כל הטיפול המיקרוביאלי צריך להיעשות בתנאים אספטיים (כלומר, בתוך ארונות בטיחות ביולוגית).
    2. ליזה את כדור התא כדי להשיג חלבון פריפלזמי על ידי סוניקציה. הוסף 5 מ"ל של מאגר ליזה (50 מ"מ Tris-HCl, 300 מ"מ NaCl, 10 מ"מ אימידזול) לכל גרם של גלולת תא ושבש על ידי סוניקציה למשך 10 מחזורים עם דופק של 10 שניות דולק ו-10 שניות כבוי במשרעת של 60%. אוספים את הליזאט על ידי צנטריפוגה ב-5,405 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. כמת את ריכוז החלבון על ידי מבחן ברדפורד26.
      הערה: כדי למנוע דנטורציה של חלבון, סוניקציה חייבת להיעשות בתנאים קרים. הניחו את הדגימות על קרח בזמן ביצוע סוניקציה.
    3. נתח את ביטוי BaCDA באמצעות SDS-PAGE ואחריו תוכנת ImageJ. טען 10 מיקרוליטר של ליזאט תאים מסיס (חלבון פריפלזמי) על ג'ל ביס-אקרילאמיד 12% והפעל תחת מאגר 1x tris-glycine-SDS (TGS) בזרם של 100 וולט למשך שעתיים. לאחר סיום הריצה, צבעו את הג'ל בכחול Coomassie והימנעו כדי להסיר את הרקע27.
    4. צלם תמונה באמצעות יחידת תיעוד ג'ל. קבע את ביטוי BaCDA על ידי השוואת עוצמת הפס בצורה של ערכי הפיקסלים באמצעות תוכנת ImageJ. קחו בחשבון את הריצה הניסיונית עם הפעילות הנמוכה ביותר של BaCDA וביומסה כפיקסל הייחוס 28.
      1. לשם כך, פתח את התוכנה ופתח את קובץ התמונה, ולאחר מכן בחר כל נתיב באמצעות התיבה המלבנית. עבור אל ניתוח והגדר כל נתיב כ-100%, ולאחר מכן בחר את הרצועה המוגזמת בכל נתיב באמצעות התיבה המלבנית. עבור אל ניתוח וקבע את עוצמת הרצועה, חזור על התהליך בכל נתיב וייצא את התוצאה כקובץ .xls. קחו בחשבון את עוצמת הרצועה של ריצת הניסוי עם פעילות BaCDA הנמוכה ביותר כעוצמת הייחוס ונתחו את הביטוי של כל נתיב.
  2. בדיקת פעילות אנזימים
    1. קבע את פעילות BaCDA באמצעות ערכת בדיקת אצטט15, באמצעות אתילן גליקול כיטין (1 מ"ג/מ"ל; EGC) כמצע29.
    2. אפשר ל-20 מיקרוליטר של BaCDA להגיב עם 40 מיקרוליטר של המצע בנוכחות 40 מיקרוליטר של מאגר Tris-HCl (pH 7) של 50 מ"מ למשך שעה ב-30 מעלות צלזיוס על ידי תסיסה ב-800 סל"ד.
    3. לאחר שעה אחת, צנטריפוגה את המגיב 100 מיקרוליטר דרך עמודה של 3 kDa ב-2,111 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-retentate המורכב מ-BaCDA ואספו את המסנן המכיל אצטט ששוחרר במהלך התגובה. השתמש בסינון לבדיקת האצטט כדי לקבוע את פעילות BaCDA.
      הערה: יחידה אחת של האנזים מוגדרת כפעילות המשחררת 1 מיקרומטר של אצטט מהסובסטרט למיקרוליטר אנזים לדקה. בדיקת פעילות האנזים בוצעה בשלוש פעמים, ופעילות האנזים המתאימה חושבה בהתאם.
  3. קינטיקה של תסיסה של אינדוקציה לקטוז
    1. חקור את פרופיל הפעילות כדי לקבוע את נקודת השראת הלקטוז ונקודת ההתחלה של הביטוי. פרופיל הפעילות נעשה על ידי הערכת פעילות ביומסה ו-BaCDA עם תנאי התסיסה האופטימליים.
    2. קבע את ריכוז הגלוקוז במדיה באמצעות ערכת הערכת גלוקוז. שרטט את פרופיל הפעילות באמצעות ביומסה, ריכוז גלוקוז ופעילות BaCDA כנגד זמן התסיסה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אופטימיזציה של תהליך הביטוי של אנזים רקומביננטי פריפלזמי כיטין דאצטילאז ב-E. coli באמצעות תכנון מרוכב מרכזי (CCD)
מבנה ה-pET22b-Ba CDA, כאשר גדל בתנאים לא אופטימליים, נתן תפוקת ביומסה מקסימלית ופעילות BaCDA של 22.26 ±-0.98 גרם/ליטר ו-84.67 ±-0.56 U/L, בהתאמה. במחקר הנוכחי אומצה גישה סטטיסטית CCD כדי למצוא את תנאי התהליך האופטימליים לביטוי אנזים רקומביננטי פריפלזמי כיטין דאצטילאז בתאי E. coli Rosetta pLysS. חמשת הפרמטרים של התהליך, טמפרטורת הד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לצ'יטוזן, כיטין נטול אצטיליות, יש יישומים רבים, במיוחד בתחום הביו-רפואי30. עם זאת, יכולת השחזור של צ'יטוזן לגבי מידת האצטילציה (DA) ודפוס האצטילציה (PA) היא דאגה מרכזית בנוסף לחששות סביבתיים אחרים. הנתיב הירוק יותר, באמצעות אנזימים, נוצל לפיכך. ניתן להשתמש במערך ה-CDAs כדי ליצור צ'יטוזן עם דפוס ייחודי של דה-אצטילציה, מה שיגדיל את היישומים הביו-רפואיים שלהם 4,5. בעבודה הקודמת שלנו, הגן המשובט BaCDA התבטא בתאי E. coli Roset...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לאקדמיית מניפל להשכלה גבוהה (MAHE) על קרן MAHE UNSW, והמחברים מבקשים להודות למועצה למחקר מדעי ותעשייתי - קבוצת פיתוח משאבי אנוש (CSIR-MHRD), ממשלת הודו על מלגת מחקר בכירה, מכתב פרס מספר 09/1165(0007)2K19 EMR-I מתאריך 31.3.2019.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת בדיקת ערכות
אצטטMegazyme, אירלנדK-ACETAKהפרוטוקול שונה מעט ומותאם לביצוע הבדיקה בערכת
הערכת גלוקוזAgappe diagnosis Ltd., India12018013הפרוטוקול שונה מעט ומותאם לביצוע הבדיקה בצלחת
96 בארות<חזק>כימיקלים
חומצה אצטיתהיי-מדיה, הודוAS001משמש להכנת תמיסת צביעה וניקוי SDS-PAGE
אקרילאמידהיי-מדיה, הודוMB068משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
אמוניום פרסולפטהיי-מדיה, הודוMB003משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
ביס-אקרילאמידהיי-מדיההודוMB005משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, הודוMB092משמש להכנת תמיסת צביעה וניקוי SDS-PAGE
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, הודוMB153משמש להכנת הבדיקה של ברדפורד
אתילן גליקול צ'יטוזןסיגמא-אולדריץ', ארה"בE1502שימש להכנת אתילן גליקול כיטין ואתילן גליקול כיטין שימש כמצע לתגובה אנזימטית
D-גלוקוזHi-media, הודוMB037שימש כרכיב מדיה.
אימידזולהיי-מדיה, הודוGRM1864משמש במאגר ליזה
לקטוזהיי-מדיה, הודוGRM017משמש כרכיב מדיה.
מתנולפינאר, הודו30930LC250משמש להכנת תמיסת צביעה וניקוי SDS-PAGE
נתרן כלורי (NaCl)היי-מדיה, הודוMB023משמש במאגר ליזה
חומצה זרחתיתHi-media, הודוMB157משמש להכנת בדיקת ברדפורד
נתרן דודציל סולפט (SDS)Hi-media, הודוGRM6218משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
נתרן פוספט דו-בסיסינטול מים היי-מדיה, הודוMB024משמש להכנת מלח שחפת למדיה ומאגר לתגובה אנזימטית.
נתרן פוספט חד בסיסינטול מים Hi-media, הודוGRM3964משמש להכנת מלח שחפת למדיה ומאגר לתגובה אנזימטית.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Hi-media, הודוMB026משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
Tris baseHi-media, הודוMB029משמש להכנת ג'ל SDS-PAGE
TryptoneHi-media, הודוRM7707משמש כרכיב מדיה.
תמצית שמריםהיי-מדיה, הודוRM027משמש כרכיב מדיה.
Equipment
AlphaImager יחידת תיעוד ג'ל של HPProteinSimple, ארה"ב92-13823-00משמש לצילום תצלומי SDS-PAGE
מיקסר BenchtopEppendorf, גרמניה 9.776 660משמש לשמירה לתגובה אנזימטית עם מתאם 2 מ"ל
שייקר ביואינקובטורמכשירי טרישול, הודו13410622משמש לדגירת תרבית חיידקים בטמפרטורות שונות
ובביוספקטרופוטומטראפנדורף, גרמניה 6135000009משמש לביצוע כל הקריאות הספקטרוסקופיות
צנטריפוגת קירוראפנדורף, גרמניה 5805000017משמש לתרבית צנטריפוגות, ליזאט וכל שאר פרוטוקולי הצנטריפוגה
יבשLabnet International, ארה"בS81522039משמש לניקוי דגימת חלבון עבור מיקרופיפטות SDS-PAGE
Eppendorf, גרמניה 3123000900משמש דרך הפרוטוקול למדידות נפח
שייקר נדנדהמכשירי טרישול, הודו11770719משמש לנער ג'ל SDS-PAGE לצביעה והימנעות
יחידת SDS-PAGEBio-Rad, ארה"ב1658001FCמשמש ליציקה והפעלה של ג'ל SDS-PAGE
אולטרה סוניקטורסוניקטור & Materials, Inc., ארה"בVCX 130משמש לליזה של תא החיידק על ידי אולטרה סוניקציה
איזון שקילהSartorius, גרמניהBSA124 Sמשמש למדידת משקל לאורך הפרוטוקול
Devices
Nanosep מכשירים צנטריפוגליים עם ממברנת אומגה (3 kDa)PALL מדעי החיים, ארה"בOD003C33משמש להפרדת אנזים אחר מצע treatment
SoftwaresVersionפותח ב-MINITAB
17.0  (גרסת ניסיון)  אוניברסיטת פנסילבניהסטייט שימש לתכנון המודל הניסיוני ולניתוח הנתונים
ImageJ1.53oהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)משמש לניתוח רמת הביטוי באמצעות SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck- Millipore, ארה"ב69744מאוחסן ב & מינוס; 20 & מעלות; C
Cells
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, ארה"ב70956מתוחזק ב-Luria– ציר ברטאני (LB) המכיל 25% גליצרול במינוס & 80 מעלות; ג
בצלחת 96 באר סל"ד אמבט

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadav, M., et al. Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing. 6 (1), 1-20 (2019).
  2. Anil, S. Potential medical applications of chitooligosaccharides. Polymers. 14 (17), 3558(2022).
  3. Amiri, H., et al. Chitin and chitosan derived from crustacean waste valorization streams can support food systems and the UN Sustainable Development Goals. Nature Food. 3 (10), 822-828 (2022).
  4. Wattjes, J., et al. Patterns matter part 1: Chitosan polymers with non-random patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104583(2020).
  5. Cord-Landwehr, S., et al. Patterns matter part 2: Chitosan oligomers with defined patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104577(2020).
  6. He, Y., Xu, J., Wang, S., Zhou, G., Liu, J. Optimization of medium components for production of chitin deacetylase by Bacillus amyloliquefaciens Z7, using response surface methodology. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 28 (2), 242-247 (2014).
  7. Pareek, N., Vivekanand, V., Saroj, S., Sharma, A. K., Singh, R. P. Purification and characterization of chitin deacetylase from Penicillium oxalicum SAE M-51. Carbohydrate Polymers. 87 (2), 1091-1097 (2012).
  8. Yonis, R. W., Luti, K. J. K., Aziz, G. M. Statistical optimization of chitin bioconversion to produce an effective chitosan in solid state fermentation by Asperigellus flavus. Iraqi Journal of Agricultural Sciences. 50 (3), 916-927 (2019).
  9. Deeba, F., Shakir, H. A., Irfan, M., Khan, M., Qazi, J. I. Utilization of agro-industrial waste for chitinase production by locally isolated bacillus subtilis using response surface methodology. Pakistan Journal of Zoology. 54 (2), 551-560 (2022).
  10. Pandey, A., Tripathi, A. H., Tripathi, P. H. Production, purification, and application of the microbial enzymes. Industrial Applications of Microbial Enzymes. , CRC Press. 19-39 (2022).
  11. Bhat, P., et al. Expression of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli pLysS: Sustainable production, purification and characterisation. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 1008-1013 (2019).
  12. Hamer, S. N., et al. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases. Scientific Reports. 5, 8716(2015).
  13. Kadokura, K., et al. Production of a recombinant chitin oligosaccharide deacetylase from Vibrio parahaemolyticus in the culture medium of Escherichia coli cells. Biotechnology Letters. 29 (8), 1209-1215 (2007).
  14. Liu, J., et al. Identification and characterization of a chitin deacetylase from a metagenomic library of deep-sea sediments of the Arctic Ocean. Gene. 590 (1), 79-84 (2016).
  15. Pawaskar, G. M., Raval, K., Rohit, P., Shenoy, R. P., Raval, R. Cloning, expression, purification and characterization of chitin deacetylase extremozyme from halophilic Bacillus aryabhattai B8W22. Biotech. 11 (12), 515(2021).
  16. Raval, R., Simsa, R., Raval, K. Expression studies of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli Rosetta cells. International Journal of Biological Macromolecules. 104, 1692-1696 (2017).
  17. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).
  18. Yang, G., et al. Enzymatic modification of native chitin and chitin oligosaccharides by an alkaline chitin deacetylase from Microbacterium esteraromaticum MCDA02. International Journal of Biological Macromolecules. 203, 671-678 (2022).
  19. Amer, O. A., et al. Exploring new marine bacterial species, Alcaligenes faecalis Alca F2018 valued for bioconversion of shrimp chitin to chitosan for concomitant biotechnological applications. International Journal of Biological Macromolecules. 196, 35-45 (2022).
  20. Packiam, K. A. R., Ramanan, R. N., Ooi, C. W., Krishnaswamy, L., Tey, B. T. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (8), 3253-3266 (2020).
  21. Jayakumar, D., Sachith, S. K., Nathan, V. K., Rishad, K. S. M. Statistical optimization of thermostable alkaline protease from Bacillus cereus KM 05 using response surface methodology. Biotechnology Letters. 43 (10), 2053-2065 (2021).
  22. Balakrishnan, R., Mohan, N., Sivaprakasam, S. Application of design of experiments in bioprocessing: process analysis, optimization, and reliability. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 289-319 (2022).
  23. Papaneophytou, C. P., Kontopidis, G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review. Protein Expression and Purification. 94, 22-32 (2014).
  24. Tang, S. R., Somasundaram, B., Lua, L. H. L. Protein expression optimization strategies in E. coli: a tailored approach in strain selection and parallelizing expression conditions. Methods in Molecular Biology. 2406, 93-111 (2022).
  25. Nag, N., Khan, H., Tripathi, T. Strategies to improve the expression and solubility of recombinant proteins in E. coli. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , Academic Press. 1-12 (2022).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  27. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of staining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  28. Etemadzadeh, M. H., Arashkia, A., Roohvand, F., Norouzian, D., Azadmanesh, K. Isolation, cloning, and expression of E. coli BirA gene for biotinylation applications. Advanced Biomedical Research. 4, 149(2015).
  29. Yin, L., Wang, Q., Sun, J., Mao, X. Expression and molecular modification of chitin deacetylase from Streptomyces bacillaris. Molecules. 28 (1), 113(2023).
  30. Hamedi, H., Moradi, S., Hudson, S. M., Tonelli, A. E., King, M. W. Chitosan based bioadhesives for biomedical applications: A review. Carbohydrate Polymers. 282, 119100(2022).
  31. Falak, S., Sajed, M., Rashid, N. Strategies to enhance soluble production of heterologous proteins in Escherichia coli. Biologia. 77 (3), 893-905 (2022).
  32. Shahzadi, I., et al. Scale-up fermentation of Escherichia coli for the production of recombinant endoglucanase from Clostridium thermocellum. Scientific Reports. 11 (1), 7145(2021).
  33. Ganjave, S. D., Dodia, H., Sunder, A. V., Madhu, S., Wangikar, P. P. High cell density cultivation of E. coli in shake flasks for the production of recombinant proteins. Biotechnology Reports. 33, 00694(2022).
  34. Wurm, D. J., et al. The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (20), 8721-8729 (2016).
  35. Gennari, A., et al. Recombinant production in Escherichia coli of a β-galactosidase fused to a cellulose-binding domain using low-cost inducers in fed-batch cultivation. Process Biochemistry. 124, 290-298 (2023).
  36. Mostovenko, E., Deelder, A. M., Palmblad, M. Protein expression dynamics during Escherichia coli glucose-lactose diauxie. BMC Microbiology. 11, 126(2011).
  37. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-32 (2014).
  38. Studier, F. W. Stable cultures and auto-induction for inducible protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-22 (2014).
  39. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  40. Selvaraj, S., Natarajan, K., Nowak, A., Murty, V. R. Mathematical modeling and simulation of newly isolated bacillus cereus M1GT for tannase production through semi-solid state fermentation with agriculture residue triphala. South African Journal of Chemical Engineering. 35 (1), 89-97 (2021).
  41. Ghahremanifard, P., Rezaeinezhad, N., Rigi, G., Ramezani, F., Ahmadian, G. Designing a novel signal sequence for efficient secretion of Candida antarctica lipase B in E. coli: The molecular dynamic simulation, codon optimization and statistical analysis approach. International Journal of Biological Macromolecules. 119, 291-305 (2018).
  42. Vuillemin, M., Malbert, Y., Laguerre, S., Remaud-Siméon, M., Moulis, C. Optimizing the production of an α-(1→2) branching sucrase in Escherichia coli using statistical design. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (12), 5173-5184 (2014).
  43. Sattari, F., Rigi, G., Ghaedmohammadi, S. The first report on molecular cloning, functional expression, purification, and statistical optimization of Escherichia coli-derived recombinant Ficin from Iranian fig tree (Ficus carica cv.Sabz). International Journal of Biological Macromolecules. 165, 2126-2135 (2020).
  44. Hajihassan, Z., Biroonro, N. Enhanced expression of recombinant activin A in Escherichia coli by optimization of induction parameters. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran. 29 (2), 105-111 (2018).
  45. Rigi, G., Mohammadi, S. G., Arjomand, M. R., Ahmadian, G., Noghabi, K. A. Optimization of extracellular truncated staphylococcal protein A expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 217-225 (2014).
  46. Faust, G., Stand, A., Weuster-Botz, D. IPTG can replace lactose in auto-induction media to enhance protein expression in batch-cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences. 15 (8), 824-829 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Chitin DeacetylaseRecombinant ExpressionE Coli RosettaChitosan ProductionProcess OptimizationCentral Composite DesignResponse Surface MethodologyEnzyme KineticsLactose InductionFermentation Process
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים