במאמר זה מתוארת שיטה למדידת קרינה באתרה ברקמה חיה. עבודה זו כוללת פירוט של בניית גשושיות בקנה מידה מיקרו למדידות שונות של קרינה וקרינה, מספקת הדרכה להרכבת רקמה לאפיון קרינה, ומתווה שיטות חישוביות לניתוח הנתונים המתקבלים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיקרו-בדיקה רדיומטרית תוך-רקמתית למדידת קרינה באתרה ברקמה חיה
במאמר זה
סיכום
תקציר
אורגניזמים נראים אטומים בעיקר משום ששכבות הרקמה החיצוניות שלהם מתפזרות בחוזקה לאור מאורע; פיגמנטים בעלי ספיגה חזקה, כגון דם, הם בדרך כלל בעלי ספיגה צרה, כך שהנתיב החופשי הממוצע של אור מחוץ לפסגות הספיגה יכול להיות ארוך למדי. מאחר שאנשים אינם יכולים לראות דרך רקמות, הם בדרך כלל מדמיינים שרקמות כמו המוח, השומן והעצם מכילות מעט אור או כלל לא. עם זאת, חלבוני אופסין מגיבים לאור באים לידי ביטוי בתוך רבות מהרקמות הללו, ותפקידיהם אינם מובנים היטב. קרינה פנימית לרקמה חשובה גם להבנת הפוטוסינתזה. לדוגמה, צדפות ענק סופגות חזק אך שומרות על אוכלוסייה צפופה של אצות עמוק ברקמה. התפשטות אור דרך מערכות כמו משקעים וביופילמים יכולה להיות מורכבת, והקהילות האלה יכולות להיות תורמות משמעותיות לפרודוקטיביות של מערכות אקולוגיות. לכן, פותחה שיטה לבניית מיקרו-גשושיות אופטיות למדידת קרינה סקלרית (שטף פוטונים החוצה נקודה) וקרינה יורדת (שטף פוטונים החוצה מישור בניצב) כדי להבין טוב יותר תופעות אלה בתוך רקמה חיה. טכניקה זו ניתנת לטיפול גם במעבדות שדה. מיקרו-גשושיות אלה עשויות מסיבים אופטיים שנמשכים בחום ומאובטחים בפיפטות זכוכית משוכות. כדי לשנות את הקבלה הזוויתית של הבדיקה, כדור בגודל 10-100 מיקרומטר של אפוקסי הניתן לריפוי UV מעורבב עם דו תחמוצת טיטניום מאובטח לאחר מכן לקצה של סיב משוך וגזוז. הבדיקה מוחדרת לרקמה חיה, ומיקומה נשלט באמצעות מיקרומניפולטור. בדיקות אלה מסוגלות למדוד את זוהר הרקמה באתרה ברזולוציות מרחביות של 10-100 מיקרומטר או בקנה מידה של תאים בודדים. גשושיות אלה שימשו לאפיון האור המגיע לתאי השומן והמוח הנמצאים 4 מ"מ מתחת לעורו של עכבר חי ולאפיון האור המגיע לעומקים דומים בתוך רקמת צדפות ענק עשירות באצות חיות.
מבוא
באופן מפתיע, לחיות יבשה ולשוכני אוקיינוס רדודים יש מספיק אור בתוך גופם לפיזיולוגיה חזותית ואפילו פוטוסינתזה. לדוגמה, רמות האור במרכז ראשו של עכבר (מחוץ לרצועות ספיגת ההמוגלובין החזקות) מוחלשות בשלושה או ארבעה סדרי גודל ביחס לעולם החיצון. זה בערך ההבדל בין רמות האור בתוך הבית ובחוץ. לכן, האטימות של רקמה או חומר עקב פיזור חזק אינה זהה לאטימות עקב בליעת אור חזקה. אור יכול להמשיך להתפשט למרחקים ארוכים במערכת פיזור חזק קדימה, בדומה לאור המתפשט דרך מערכות ימיות עם ריכוזים גבוהים של תאים וחלקיקים1. תצפית זו בולטת במיוחד לאור העובדה שחלבוני אופסין באים לידי ביטוי כמעט בכל הרקמות של כל בעלי החיים. לכן, חשוב להבין כיצד והיכן האור נחלש ומפוזר בתוך רקמה חיה. עם זאת, בניגוד למערכות ימיות, עם רקמה חיה, אי אפשר לטבול מכשיר בעמודת המים ולקבל מדידות זוהר וקרינה, ויש צורך בטכניקה חדשה.
שיטות נוספות ששימשו בעבר לאפיון תכונות הבליעה והפיזור של רקמה חיה כוללות מדידת בדיקות החזרת רקמות ו/או שילוב כדורים2,3, שיטות מיקרוסקופיות כגון סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי4, מדידת דיפוזיה של אור לייזר על פני השטח5, וטכניקות מידול כגון העברת קרינת מונטה קרלו6. שיטות הניסוי שהוזכרו דורשות לעיתים קרובות ציוד ספציפי, גדול ויקר או ידע מפורט על מבנה הרקמה ובדרך כלל מוגבלות ביכולתן לאפיין את המבנה המרחבי של האור בעומק הרקמה.
ישנן גם שיטות דומות מבוססות בדיקה המשתמשות במחט היפודרמית כדי להחדיר סיב אופטי דרך רקמה 7,8,9. מניסיוננו, מחטים מהונדסות יעילות בניקור רקמות אך דורשות כוח רב ובדרך כלל קורעות רקמות עדינות כאשר הן עוברות דרך תאים צפופים. לכן, מחטים אלה דורשות בדרך כלל הליך כירורגי להחדיר יותר ממילימטר בערך לתוך שכבת רקמה. השיטה המתוארת כאן, באמצעות תמיכת זכוכית משומנת ומשוכה, מסוגלת להחליק בין תאים עם פגיעה מינימלית של הרקמה וללא ניתוח נוסף.
כתב יד זה מציג שיטה בהשראת עבודתם של יורגנסון ועמיתיו על מדידת אור בתוך מחצלות אצות10,11, באמצעות מיקרו-גשושיות אופטיות נתמכות זכוכית ואלקטרוניקה ניידת המתאימות לחיטוט עמוק לתוך רקמות צפופות ולבנייה ושימוש בשטח. ניתן לבנות גשושיות אלה כדי לאפיין קרינה סקלרית (אור הפוגע בנקודה מכל הכיוונים) וקרינה יורדת (אור החוצה מישור אופקי) בתוך רקמה חיה ברזולוציות מרחביות גבוהות. גשושיות אלה פותחו במקור כדי למדוד מעבר קרינה בתוך הרקמה של צדפות ענק פוטוסימביוטיות12. מדידות סטנדרטיות של ספיגה והעברה של הרקמה הכוללת לא הספיקו כדי לאפיין את הביצועים הפוטוסינתטיים של הרקמה, שכן זה משנה מאוד אם כל אור האירוע נבלע על ידי תאים בודדים החווים עוצמה גבוהה על פני השטח של הרקמה או תאים רבים החווים עוצמות נמוכות לאורך נפח הרקמה. בפרויקט שני, גשושיות אלה שימשו למדידת קרינה in vivo בתוך מוחו של עכבר13,14, ובכך אפיינו את סביבת האור של אופסינים המתבטאים עמוק בתוך המוח. מיקרו-גשושיות אלה הן קטנות ורגישות מספיק כדי למדוד קרינה בתוך רקמת המוח של עכבר כאשר כל הפרווה, העור והעצם שלמים, ולהראות כי רמות האור הפיזיולוגי גבוהות מספיק בקלות כדי לעורר אופסינים בעומק המוח.
בדיקה מיקרו-אופטית זו ומערך מדידה זה יכולים להיות שימושיים לחוקרים הזקוקים לכמת ולאפיין את האור הפנימי לרקמה ביולוגית, במיוחד להבנה דקדקנית יותר של פוטוסינתזה או תפקודים של פיגמנטים חזותיים המתבטאים מחוץ לעיניים. ניתן להשתמש בשיטה זו לבד או בשילוב עם טכניקות אחרות כדי לאפיין באופן מלא את התכונות האופטיות והתפשטות האור בתוך רקמה חיה בעלות נמוכה, עם ציוד נייד קטן מובנה בתוך הבית ועם פרמטרים מתכווננים תלויי משימה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה תואם את כל התקנות האתיות הרלוונטיות של אוניברסיטת ייל בנוגע למחקר בעלי חוליות וחסרי חוליות בבעלי חיים.
1. בניית המיקרו-בדיקה האופטית
- בניית שרוול זכוכית, חומר: פיפטה פסטר, 5.75 אינץ' (ראה טבלת חומרים)
- בעזרת תפס תנין הניתן להרכבה (טבלת חומרים), הרכיבו את פיפטת הזכוכית בקצה הרחב כך שהקצה המחודד פונה כלפי מטה לכיוון הרצפה וכיוון הפיפטה מאונך לרצפה.
- תלו ידית אחיזה מפלסטיק של 50 גרם (טבלת חומרים) מהקצה המחודד של הפיפטה. הניחו כרית של סרט חשמלי בין פיפטה לבין ידית האחיזה כדי לסייע במניעת החלקה.
- מחממים את הקצה המחודד של הפיפטה בעזרת לפיד בוטאן קטן (טבלת חומרים). יש להפעיל את הלהבה 1 ס"מ מעל ידית האחיזה. החזיקו את הפנס כך שהחלק הבהיר ביותר של הלהבה יהיה במרחק של 3 ס"מ מהזכוכית והזכוכית נמצאת בקצה הלהבה. כאשר אורך הפיפטה גדל בכ-15 ס"מ, הסירו מיד את הלהבה.
- השתמש במספריים קטנים או בחותך זכוכית כדי לחתוך את הקצה הנמשך של פיפטה בנקודה שבה קוטר המשיכה החדש כפול בערך מזה של הסיב האופטי המשמש בסעיף הבא (ראה שלב 1.2). תייק את כל האזורים החדים בקצה החתוך באמצעות נייר קרבורונדום (Table of Materials). יש לשטוף את כל שברי הזכוכית או האבק הקטנים שנוצרו באמצעות בקבוק איזופרופיל אלכוהול ולאחר מכן אוויר דחוס.
- משיכת הסיב האופטי (איור 1D)
- השתמש בסכין גילוח כדי לנתק את הסיב האופטי, והסר מחבר SMA אחד של סיב אופטי SMA בקוטר 200 מיקרומטר (תוכן חומרים). חתכו קרוב לאחת מסיומות ה-SMA. לאחר מכן, השתמש בסכין הגילוח כדי להסיר את 5 הס"מ הבאים של פלסטיק וציפוי פיברגלס, כך שהסיב האופטי החשוף ייחשף ויבלוט משאר המכלול השלם.
- השתמשו בלפיד הבוטאן כדי לשרוף את ציפוי פולימר הפולימיד מסיבי הזכוכית. יש לשטוף עם איזופרופנול. נגבו את סיבי הזכוכית החשופים באמצעות מגבון ללא סיבים.
- השלב הבא הוא להרכיב את הסיב החשוף כך שניתן יהיה למשוך אותו גם עם להבה. הרכיבו את הקצה החשוף של הסיב האופטי ישירות במהדק צבת (Table of Materials) על שולחן או קצה מדף, ואפשרו לקצה המסתיים SMA של הסיב להיתלות לכיוון הרצפה. הוסף את המשקולות למשיכה בצורה של שני מלחציים קטנים (משקל כולל: 10 גרם) על קצה הז'קט של הסיב כ -12 אינץ 'למטה מהמקום שבו מוחזק הסיב האופטי החשוף במהדק הצבת.
- כדי למשוך את הסיבים, התחילו עם להבת לפיד הבוטאן דולקת. כשהלהבה דולקת, החזיקו את לפיד הבוטאן במרחק של 1 ס"מ מהסיב החשוף כך שהלהבה תהיה בניצב לסיב האופטי ו-3 ס"מ למטה אנכית מהמקום שבו מהדק הצבת מחזיק את הסיב החשוף. אפשרו לסיב להימתח, למשוך, להפריד וליפול לרצפה.
- בדוק את קצה הסיב האופטי שנמשך כתוצאה מכך. יש לסלק בעדינות כל חריגה עם נייר קרבורונדום, לנקות עם אלכוהול איזופרופיל ומגבון ללא סיבים, ולייבש עם אוויר דחוס.
הערה: בשלב זה, ניתן להשתמש במיקרוסקופ כדי לאפיין ולתעד את גודל וצורת הסיב המושך. - השתמשו בעט אטום כדי להכהות את צידי הסיב ולמנוע כניסת אור תועה (Table of Materials). משכו בעדינות את הסיב לאורך קצה העט, והשאירו רק אזור קטן בקצה חשוף.
- הרכבת הסיב המשוך בתוך שרוול פיפטת הזכוכית (איור 1A)
- עבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, הכנס בזהירות את הסיב האופטי המחודד משלב 1.2 לקצה הרחב של פיפטת הזכוכית שהשתנתה משלב 1.1, ודחוף את הסיב דרך עד ~ 1 מ"מ של סיבים חשופים בולט מהקצה המחודד של הפיפטה.
- באמצעות סרט חשמלי, מחברים את קצה הסיב האופטי לקצה הרחב של הפיפטה.
- שים טיפה של דבק ציאנואקרילט על מחט קטנה (טבלה של חומרים). בזהירות לגעת טיפה של דבק בקצה לחתוך של פיפטה משוך, הימנעות הקצה החשוף של הסיב משוך.
- אפשר לפעולה נימית לפתל את הדבק לתוך הפיפטה, להרטיב את האזור שבין דופן פיפטה לבין הסיב האופטי. הניחו לדבק להירפא למשך 15 דקות לפחות לפני הזזת מכלול הבדיקה.
- שינוי קצה הסיב בעזרת כדור פיזור (איור 1C)
- צור את חומר הגלם עבור קצה כדור הפיזור על ידי ערבוב טיפה של דבק הניתן לריפוי UV עם אבקת טיטניום דו חמצני (טבלה של חומרים) ב ~ 1: 1 v/v.
- חבר את הגשושית למיקרומניפולטור עם מחזיק מוטות הרכבה (טבלה של חומרים) כך שהגשושית תהיה בכיוון אופקי. מכינים מיכל עבודה של חומר הפיזור על ידי טבילת קצה חוט או מחט בתערובת הדבק/TiO2 שהוכנה לעיל כך שתיווצר טיפת דבק. הר את החוט או המחט עם הטיפה ליד קצה הבדיקה האופקית. נוח לעשות זאת באמצעות קליפס תנין המותקן על הספסל.
- הפקד כדור פיזור על קצה הגשוש. השתמש במיקרומניפולטור כדי לדחוף לאט ובזהירות את קצה הסיב האופטי של הגשושית לתוך טיפת הדבק/TiO2. לאחר מכן, למשוך במהירות את קצה מן הדבק. חזור על הפעולה פעמיים עד שלוש עד שטיפה כדורית של דבק בגודל הרצוי מונחת על קצה הסיב האופטי.
הערה: כדור הפיזור יהיה יציב בקטרים הגדולים פי שניים עד פי שמונה מקוטר הסיב האופטי המחודד. הגודל האופטימלי הסופי תלוי ביישום הרצוי הסופי. - רפא את הכדור על ידי חיבור הקצה המסתיים SMA של הסיב האופטי למקור אור UV מצומד סיבים (טבלה של חומרים).
הערה: מקור האור ששימש במחקר זה היה בהספק של 5.3 mW. בשלב זה, זמן הריפוי המומלץ הוא לפחות 12 שעות או לילה. לאחר הריפוי הוא זמן טוב לאפיין ולמדוד את גודל קצה הבדיקה האופטית הסופי.
2. הכנה והרכבה של הרקמה למדידות אופטיות (איור 2 ואיור 3)
- הכינו את הכלים כדי להרכיב את הדגימות לניסוי. מחממים את הקצה הגדול של פיפטת פסטר באמצעות לפיד בוטאן כדי ליצור אגרוף להמסת חור בקוטר 0.5 ס"מ בתחתית צלחת פטרי מפלסטיק בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ. אטמו את החור בצד התחתון של הצלחת בעזרת סרט חשמלי או סרט מעבדה. בצע כמה בכל פעם ליעילות.
- הכינו ג'לטין נוזלי (טבלת חומרים) בהתאם להוראות שעל האריזה.
הערה: ג'לטין מסחרי ללא טעם באיכות מזון מהמכולת עדיף למטרה זו מאשר ג'לטין באיכות כימית מספקים כימיים מכיוון שהג'לטין ברמה כימית פחות ברור אופטית ופחות אמין מכנית ממוצר המזון. - בצע את הדיסקציה וההכנה של הרקמה שתשמש.
הערה: מניסיון, כל רקמה שטוחה בעובי של עד 1 ס"מ ניתנת למדידה מוצלחת בניסוי זה באמצעות כל טכניקת דיסקציה המתאימה למערכת העניין. עבור רקמת צדפה ענקית, נעשה שימוש בניקוב ביופסיה של 8 מ"מ כדי ליצור עיגול שטוח וסדיר של רקמת צדפה לשימוש בניסוי12. עבור מערכת זו, רק דגימה אחת יכולה להיות מוכנה ביעילות בכל פעם בהתחשב במשך הזמן הדרוש להשלמת מדידה כדי להבטיח שהדגימה עדיין הייתה במצב דמוי חיים בסוף הניסוי. - מלאו שתי צלחות פטרי משלב 2.1 רבע מהדרך בג'לטין הנוזלי, ותנו להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) רק לפני הג'לציה. בצלחת אחת, מניחים את הביופסיה בכרית של ג'לטין צמיג שנוצר בחור בתחתית המנה. השתמשו בפיפטה של פסטר כדי להוסיף בעדינות ג'לטין RT סביב הביופסיה עד שצלחת הפטרי מלאה (איור 3). ממלאים את המנה השנייה בג'לטין כדי ליצור מדגם ריק.
- הכניסו את הכלים לדוגמה למקרר למשך כ-10-30 דקות עד שהג'לטין נרפא לחלוטין ואלסטי מעט למגע.
הערה: בחדר קריר, ייתכן שלא יהיה צורך בכך; כאשר עובדים באזורים הטרופיים, שלב זה נדרש כדי לרפא באופן מלא את הג'לטין. - יצירת תושבת עבור צלחת הפטרי על המיקרומניפולטור (איור 2)
- חותכים ריבוע בגודל 6X6 ס"מ של 1/4 בפרספקס עבה (טבלת חומרים).
- לקדוח או להמיס חור בריבוע הפלסטיק באותו קוטר כמו צלחת פטרי (~ 35 מ"מ). ודאו שצלחת הפטרי מתאימה היטב לחור הזה ומוחזקת במקומה עם חיכוך. מוסיפים סרט הדבקה לקצוות המנה כדי להגדיל מעט את הגודל ואת מגע החיכוך.
- קודחים או ממיסים חור בקוטר 1/4 בפינת ריבוע הפלסטיק. השתמש בחור זה כדי לחבר את הריבוע למיקרומניפולטור באמצעות 1/4 בורג ובריח.
- כסו את ריבוע הפלסטיק בסרט חשמלי שחור כדי להפחית את האור התועה המגיע לבדיקה. באופן דומה, השתמשו בסרט הדבקה כדי ליצור חצאית סביב צידי הריבוע הנמשכת מתחת לתחתית התבנית המוחדרת (>10 מ"מ) כדי להפחית את האור התועה (איור 2B).
- השתמש בבורג ובחומרה מתאימה כדי לחבר את מחזיק צלחת הפטרי למיקרומניפולטור המאפשר התאמות תלת ממדיות ותנועה אנכית פתורה היטב על פני היקף גדול מעובי הדגימות (חלק 1 וחלק 2 של המניפולטור המוזכרים בטבלת החומרים הם דוגמאות טובות). הצמד מיקרומניפולטור זה ללוח לחם אופטי.
3. מערך מדידה לביופסיות רקמה
- הרכיבו מקור אור מעל האזור שבו מתבצעת המדידה, כך שהאור יתנגש כאשר הוא יגיע למישור שבו תמוקם הדגימה (איור 2A). לדוגמה, חברו עדשה מתנגשת בקוטר 5 ס"מ (Table of Materials) למדריך אור נוזלי בקוטר 5 מ"מ (Table of Materials), והגביהו מעל הדגימה ב-0.6 מ' > באמצעות סגן ומסגרת המחוברים ללוח לחם אופטי (Table of Materials). לאחר מכן, חבר את מדריך האור למקור אור בפס רחב, כגון מקור אור הפלזמה המופיע בטבלת החומרים.
- חבר את הגשושית לתושבת בכיוון אנכי כך שתצביע לעבר מקור האור. אבטח את הבדיקה באמצעות מלחציים, מהדקי צינור או סרט דבק לעמוד שולחן אופטי.
הערה: בניסוי צדפות ענק, נעשה שימוש במחזיק מוט שעוצב במיוחד, כגון המיקרומניפולטור המופיע בטבלת החומרים. בעבודה זו הוא אובטח באמצעות מגנטים ללוח לחם אופטי (Table of Materials). דרגות החופש הנוספות ליישור המתקבלות על ידי הימצאות הן של הגשושית והן של הדגימה על מניפולטורים הן נוחות אך אינן נדרשות. היזהר לא להיצמד יתר על המידה לפוסט, מכיוון שזה יכול לשבור את בית הפיפטה. - מקם את מניפולטור הדגימה ליד הגשושית המותקנת אנכית. השתמש במניפולטור הדגימה כדי להתאים את מיקום שלב הדגימה כך שהבדיקה ממורכזת בפתח של 0.5 ס"מ בתחתית צלחת הפטרי. יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מלגעת או להיתקל בקצה הגשושית המותקנת.
הערה: סטריאומיקרוסקופ רכוב על בום הממוקם מעל אזור הדגימה יכול להיות שימושי. בדרך זו ניתן לראות את היישור מלמעלה למטה של קצה הגשושית, השלב והדגימה לפני תחילת ניסוי (איור 2A). - חבר את הקצה המסתיים ב-SMA של הסיב האופטי של הגשושית לספקטרומטר סיב אופטי USB (Table of Materials), וחבר את הספקטרומטר למחשב באמצעות כבל USB.
4. איסוף נתונים
- מערך ניסיוני
- יש את הבדיקה ואת מניפולטורים במצב מיושר בדיוק שבו הנתונים ייאספו, כמו בשלב 3.4.
- השתמש במקלון צמר גפן או מחט מדידה עדינה כדי למרוח בזהירות כמות קטנה של חומר סיכה סיליקון (טבלה של חומרים) על החלק של הבדיקה שיוכנס לתוך הרקמה כדי להפחית את החיכוך בין הצדדים של הבדיקה לבין דגימת הרקמה. מרחו מחדש את חומר הסיכה מסיליקון לפני כל מדידה בסיסית או רקמה.
- הסר את סרט הדבק המכסה את החור בצלחת פטרי הדגימה הריקה, והנח אותו במחזיק הדגימה (שלב 2.7), וודא שהוא מוחזק היטב במקומו על ידי חיכוך.
- השתמש במיקרומניפולטור כדי להוריד את הדגימה אל הבדיקה. אפשרו לגשושית להיכנס לג'לטין דרך החור בחלק התחתון של צלחת הפטרי. ממשיכים עד שהבדיקה נמצאת במרחק של כ-5 מ"מ מתחתית שכבת הג'לטין.
- הפעל את מקור האור. באמצעות תוכנת הספקטרומטר, התאם את זמן שילוב הספקטרומטר עד שהאות גבוה ככל האפשר אך לא רווי. הגדר את מספר הסריקות הממוצע בין שתיים לחמש ואת ערך הפיקסלים המחליקים על שש. זמני שילוב שמישים בשלב זה עשויים לנוע בין 1-50 אלפיות השנייה עבור תוכנית בסיסית זו.
- איסוף ספקטרום הייחוס
- אספו מדידה כהה.
- לאחר הגדרת פרמטרי הספקטרומטר עם הדגימה הריקה, נתקו את סיב הגשושית מהספקטרומטר, וכסו את היציאה בכיסוי המתכת האטום שהגיע עם הספקטרומטר.
- קבל מדידה כהה מהספקטרומטר (לעתים קרובות באמצעות סמל הנורה הכהה בממשק המשתמש הגרפי) כדי לאפיין את רעש הספקטרומטר ללא אור קלט. שמור מדידה זו בהתאם לאסטרטגיית איסוף הנתונים.
- אספו מדידת מנורה. חברו מחדש את סיב הגשושית לספקטרומטר, המתינו עד שהאות יתייצב ורכשו ספקטרום נוסף. מדידה זו מאפיינת את האור המגיע לגשושית דרך הג'לטין בהיעדר רקמה.
- אספו מדידה כהה.
- איסוף ספקטרום הרקמה
- הסר את הסרט בתחתית צלחת פטרי הדגימה, והניחו אותו במחזיק הדגימה.
- יישרו את צלחת הדגימה עם הבדיקה באמצעות מניפולציה תלת ממדית כך שביופסיה הרקמה ממורכזת מעל קצה הבדיקה.
- מרחו ג'ל סיליקון על הבדיקה (ראו 4.1.2), והורידו את הדגימה לאט לאט אל הבדיקה עד שקצה הבדיקה עבר דרך הג'לטין התומך בדגימת הרקמה ונכנס זה עתה לדגימת הרקמה.
הערה: ספקטרומטרים ותוכנות מחשב מסוימים מאפשרים ניטור בזמן אמת של האור שזוהה. השתמש באפשרות זו כדי לקבוע מתי הבדיקה נכנסת לרקמה. עוצמת הספקטרום תרד בפתאומיות ברגע שקצה הבדיקה נמצא במגע ישיר עם הרקמה. - ודא שזמן האינטגרציה מתאים למדידה על ידי הבטחה שהספקטרום הנמדד אינו רועש מדי או רווי. שנה את זמן השילוב במידת הצורך.
- בכל פעם שזמן האינטגרציה מותאם, בצע ואחסן מדידה כהה חדשה (שלב 4.2.1). אין לשנות את מספר הסריקות הממוצע או את מספר הפיקסלים המוחלקים.
- לאחר מציאת פרמטרי מדידה מתאימים, קחו את המדידות ושמרו את הספקטרום.
- הזז את הדגימה למרחק מסוים באמצעות המיקרומניפולטור. עבור המניפולטור ששימש למחקר זה, כל סימן שנתות קטן היה 0.001 אינץ 'או 25.4 מיקרומטר. הדגימה הועברה למטה דרך חמישה סימני שנת, או 127 מיקרומטר, עבור כל מדידה. חזור על שלב 4.3.4.
- המשך לשמור את הספקטרום בכל מיקום אנכי בתוך הרקמה.
הערה: עבור המערכת המתוארת כאן, זמני האינטגרציה הנדרשים נעו בין 1ms ל- 5 s עבור המדידות בתוך דגימת רקמה אחת. בסופו של דבר, קצה הבדיקה ייצא מהחלק העליון של הרקמה וייראה שם (איור 4A). זוהי המדידה הסופית ומאפיינת את אירוע האור בחלק העליון של הרקמה.
- טעינה ועיבוד של הנתונים
- השתמש בתוכנת הספקטרומטר כדי להמיר את כל הספקטרום שנאסף (ספקטרום כהה, ספקטרום מנורות ומדידות רקמות) לקבצי טקסט מופרדים.
- באמצעות Matlab או שפת קידוד לפי בחירה, טענו את כל קובצי המדידה לדגימה. עבור כל ספקטרום מדידת רקמות, החסר את הספקטרום הכהה עם זמן האינטגרציה התואם, ולאחר מכן חלק אותו בזמן האינטגרציה.
הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בסקריפט Matlab לטעינה ולעיבוד של הנתונים (קובץ משלים 1). - חשב את אחוז האור המקרי המגיע לכל מיקום ברקמה על ידי חלוקת הספקטרום המתקבל עם הגשושית בתוך הרקמה בספקטרום קו הבסיס המתקבל בג'לטין ריק.
הערה: המדידה בחלק העליון של הרקמה (שלב 4.3.6) צריכה להיות דומה מאוד למדידת קו הבסיס בג'לטין (שלב 4.1), וכאשר היא מחולקת, צריכה להיות קרובה ל-100%. בהתאם להקשר הניסויי, ספקטרום המנורה (הספקטרום מג'לטין ריק או זה מהחלק העליון של הרקמה) יכול לשמש כנקודת התייחסות. עם זאת, עדיין חשוב לאסוף ספקטרום מנורה לפני תחילת הניסוי. הסיבה לכך היא שאם הגשושית נשברת או שהניסוי נכשל בדרך אחרת לפני שהגיע לחלק העליון של הרקמה, הנתונים שהתקבלו לפני הכישלון עדיין שמישים, וזה לא המקרה אם אין ספקטרום ייחוס ראשוני מתאים של המנורה. - הצג את הנתונים באופן חזותי; חלקות מתאר יכולות להיות מועילות (איור 4B).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול זה מתאר את ההליך לבניית גשושית מיקרו-אופטית שניתן להשתמש בה כדי למדוד את הקרינה היורדת (האור המגיע לנקודה מכיוון אחד) או, בתוספת קצה כדורי מפזר אור, למדוד את הקרינה הסקלרית (האור המגיע לנקודה מכל הכיוונים). בדיקות אלה יכולות למדוד קרינה ברזולוציות מרחביות המתקרבות לסקאלות האורך של תאים בודדים בתוך רקמה חיה. פרוטוקול זה מתאר גם שיטה מייצגת להכנת דגימת רקמה למדידות קרינה באמצעות הגשושית המתוארת ושיטה מייצגת לצפייה וניתוח נתונים.
איור 1 מראה את התפוקה של ייצ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לאפיון שיטתי של הסביבה האופטית באמצעות נפח גדול של רקמה חיה ברזולוציה מרחבית בערך בקנה מידה של תאים בודדים. שיטה זולה, גמישה וניתנת לעיבוד שדה זו יכולה להיות שימושית לכל חוקר החוקר את התפשטות האור בתוך מערכות חיות. מניסיון, בהשוואהלשיטות 7 הקיימות, בדיקות אלה דורשות מעט יותר תרגול ומיומנות כדי לבנות אך מביאות לפחות נזק לרקמות וליכולת לאפיין באופן מקיף יותר נפחים גדולים יותר של רקמה צפופה.
שיטה זו מורכבת מארבעה חלקים. החלק הראשון, בניית הגשושית, נ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי עניינים.
תודות
המחברים מודים לסאנז והידיניה על שהכיר לנו את עמיתיו של ד"ר יורגנסן ואת עבודתו. מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממשרד המחקר הצבאי (מס' W911NF-10-0139), המשרד למחקר ימי (באמצעות פרס MURI מס' N00014-09-1-1053), ופרס NSF-INSPIRE NSF-1343158.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 אינץ' מרכז מיסב כדורי נסיעות + D11 + A2: D31 + A2: A2: D31 | אופטיקה אדמונד | 37-935 | חלק 2 של מניפולטור להורדת מדגם יריעת |
| אקריליק בעובי 1/4 אינץ' | McMaster-Carr | 8505K754 | להכנת מחזיק צלחת פטרי |
| 3/4 אינץ' מהדק קפיץ מיני | סדן | 99693 | השתמש כמשקל למשיכת סיבים אופטיים |
| אגרוף ביופסיה 8 מ"מ | פישר סיינטיפיק | NC9324386 | לדגימת רקמות |
| לפיד בוטאן | מקמאסטר-קאר | MT-51 | מקור חום למשיכת סיבים ופיפטה |
| עדשת קולימציה | Thorlabs | LLG5A1-A | לקולימציה של מקור אור באמצעות מוביל אור נוזלי |
| אוויר דחוס | McMaster-Carr | 7437K35 | לייבוש סיבים משוכים ופיפטה |
| דבק ציאנואקרילט - נוזלי | McMaster-Carr | 66635A31 | לאבטחת קצה סיבים מחודדים בחלק העליון של פיפטה משוכה |
| סרט חשמלי | McMaster-Carr | 76455A21 | לאבטחת סיבים בפיפטה ולהוספת אחיזה למהדקים |
| נייר קרבורונדום בדרגה עדינה | McMaster-Carr | 4649A24 | משולש קטן על מחזיק סכין exacto עובד היטב |
| ג'לטין | נוקס | 10043000048679 | לאבטחת ביופסיית הרקמה בצלחת |
| הפטריזכוכית פסטר פיפט | פישר מדעי | 13-678-20B | פיפטת זכוכית חד פעמית באורך 5.75 אינץ' |
| מזרקי אינסולין, מחט 31G | BD | 320440 | למריחת דבק |
| איזופרופנול | מקמאסטר-קאר | 54845T42 | לניקוי סיבים משוכים ופיפטה |
| Kimwipe | Cole-Parmer | מק"ט 33670-04 | לניגוב סיבים אופטיים ופיפטה זכוכית |
| נקייה LED דרייבר | Thorlabs | LEDD1B | להפעלת נוריות ה-UV |
| מקור אור למדידות | Cole-Parmer | UX-78905-05 | מקור אור לבן בחום נמוך למדידות |
| ליניארי XYZ מתלה ציר ושלב פיניון | Edmond Optics | 55-023 | חלק 1 של מניפולטור להורדת דגימה |
| מדריך אור נוזלי | Thorlabs | LLG5-4T | למקור אור במדידות |
| רגליים מגנטיות | Siskiyou | MGB 8-32 | לשימוש עם רצועות מגנטיות |
| רצועות מגנטיות | Siskiyou | MS-6.0 | להרכבה מגנטית למניפולטור לוח אב-טיפוס |
| #1 | מניפולטור Siskiyou | MX10R | 4 צירים עם מחזיק פיפטה |
| עט אטום, | גוון חלון | TOP01 | לצד אטום של סיבים אופטיים כדי למנוע כניסת אור תועה לבדיקה |
| לוח אב-טיפוס אופטי | Edmond Optics | 03-640 | להדבקה יציבה של מחזיק בדיקה, דגימה, מיקרוסקופ ומקור אור |
| סיבים | אופטיים Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | כ-4 סיבים טובים למקור |
| אור פלזמה | Thorlabs | HPLS345 | למדידות רדיומטריית רקמות |
| מהדק צבת פלסטיק | McMaster-Carr | 5070A11 | מהדק פלייר המשמש למשקל במשיכת פיפטה |
| צלחות פטרי פוליסטירן | תומס מדעי | 3488N10 | מחזיקי דגימות, נפח מספיק כדי להחזיק עובי מדגם בתוספת ~10 מ"מ של ג'לטין למעלה |
| סכיני גילוח | McMaster-Carr | 3962A3 | להפשטת מעיל מסיבים אופטיים |
| חומר סיכה שמן סיליקון | תומס מדעי | 1232E30 | להפחתת החיכוך בין בדיקה לרקמה |
| תוכנה לניתוח נתונים | Matlab | תוכנה נבחרת לניתוח נתונים | |
| ספקטרומטר + ספקטרומטר תוכנת | Avantes | AvaSpec-2048L | ספקטרומטר יכול להיות כל מותג, זה תואם לסיבים אופטיים עם סיום SMA ומגיע עם תוכנה משלו להפעלת הספקטרומטר |
| אבקת טיטניום דו חמצני | סיגמא אולדריץ' | 718467-100G | להכנת כדור |
| פיזורToolour קליפ השולחן | Toolour | Toolour0004 | להחזקת פיפטה בזמן משיכה ולהחזקת בדיקות מוגמרות |
| מהדקי מוט פעולת הדק | mcMaster-Carr | 51755A2 | טוב להחזקת סיבים אופטיים תוך כדי משיכה או ריפוי |
| דבק הניתן לריפוי UV | Delo Photobond | GB368 | להכנת כדור פיזור |
| מקור אור UV | Thorlabs | M365FP1 | מקור אור לריפוי דבק בכדור פיזור, זה תואם סיבי sma, עוצמה גבוהה יותר = פחות זמן ריפוי |
| מקור אור LED לבן | Thorlabs | MCWHF2 | לאפיון סיבים משוכים וכדור פיזור |
מקורות
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393(2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309(2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316(2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, Springer. Berlin, Heidelberg. (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678(2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
