אחד המניעים העיקריים של פנוטיפים של תאים באיקריוטים הוא ביטוי גנים. הבקרה על ביטוי הגנים חיונית ומסתמכת על מספר חלבונים ורנ"א, החל משעתוק ועד לתהליכי תרגום1. שינויים לאורך שלבים אלה יכולים לעורר מספר מחלות שונות. עיבוד ושחבור RNA מהווים קבוצה חשובה של תגובות האחראיות ליצירת מולקולות RNA בוגרות 2,3,4,5. שחבור מסיר אינטרונים ומצטרף לאקסונים כדי ליצור מולקולת RNA בוגרת המסוגלת לבצע פעילויות פונקציונליות ומבניות. היעילות ושיעורי השחבור משפיעים מאוד על הפנוטיפים שנצפו בתנאים שונים6.
השחבור מבוצע על ידי מנגנון מקרומולקולרי מורכב בשם spliceosome, המורכב מחמישה snRNAs ויותר מ-100 חלבונים 5,7. בנוסף לרכיבי חלבון הליבה, לספלייסאוזומים יש חלבונים טרנס-אקטיביים, שעשויים להשפיע ישירות על ויסות תהליך זה 8,9. חשיבות השחבור באה לידי ביטוי בספקטרום הרחב של מחלות הנגרמות על ידי שינויים בתהליך זה, כולל הפרעות ניווניות, מחלות נוירומוסקולריות ומספר סוגים של סרטן 3,10,11. חקר דינמיקת שחבור והרכבת שחבור יכול להשפיע מאוד על הבנת הביולוגיה של הפרעות אלו.
הרכבת Spliceosome מתחילה באסוציאציה של U1 snRNP עם אזור ספציפי של הקדם-mRNA ששועתק לאחרונה, אתר החיבור 5' 5,8. ההתאמה והזיהוי היעילים של אתרי אחוי 5' על ידי U1 snRNA לא רק מגדירים את אתרי החיבור שיש להשתמש בהם, אלא גם שולטים אילו פרה-RNAs יחוברו ראשונים, או בצורה יעילה יותר 6,12,13. השימוש באתרי חיבור שונים יכול ליצור איזופורמים חלופיים מרובים של RNA בוגרים מאותו גן. שחבור אלטרנטיבי הוא מקור עיקרי למגוון פרוטאומי, המאפשר יצירת RNA וחלבונים הנדרשים במהלך ההתפתחות או בתאים ורקמות שונות14,15. תעתיקי RNA חלופיים יכולים ליצור איזופורמים של חלבון קטומים או לא פונקציונליים, שעלולים לגרום למחלות10,16. לכן, למרכיבי החלבון של קומפלקס U1 snRNP יש תפקיד רגולטורי חשוב בשחבור1. גלקטין-1 וגלקטין-3 (Gal1 ו-Gal3) הם מרכיבים של U1 snRNP17,18. Voss et al.19 מציעים שיטת פיצול תמצית גרעינית להשגת קומפלקסים מועשרים ב-Gal3-U1 snRNP המסוגלים להציל פעילות שחבור בתאים שהתרוקנו מ-U1. ניתוח זה תורם להבנת המנגנון של קשר Gal3 לספלייסוזומים, וניתן להשתמש בגישות דומות כדי לחקור חלבונים מווסתים פוטנציאליים אחרים.
הקישור של U1 snRNP לאתרי חיבור 5' הוא מתווך חשוב של נאמנות שחבור20. מוטציות באתרי החיבור 5' הן קריטיות וגורמות לאובדן זיווג U1 snRNP, וכתוצאה מכך פגמי שחבור2. סיסטיק פיברוזיס, למשל, נגרמת על ידי אתר חיבור 5' מוטנטי בגן CFTR21. Wong et al.22 מתארים שיטה לפיצוי על מוטציות באתר חיבור 5' עם מוטציות משלימות ב-U1 snRNAs. הגישה מקדמת בהצלחה הכללת אקסון, מייצרת RNA בוגרים וכתוצאה מכך חילוץ מפגמי שחבור. בנוסף להצעת טיפול אפשרי מבוסס RNA למחלות אלה, גישה זו יכולה להיות שימושית לניתוח רצפים רגולטוריים בודדים ב-pre-mRNAs23.
הנאמנות של אסוציאציה של U1 snRNA לאתרי חיבור נחקרת גם במערכת מודל השמרים על ידי ואן דר פלץ24. השמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae היו בשימוש נרחב כדי לחקור קינטיקה של שחבור והרכבת שחבור25. קינטיקה של שחבור והרכב השחבור נשמרים היטב באיקריוטים, ושמרים שימשו באופן נרחב לניטור היווצרותם של קומפלקסי ביניים במהלך ההרכבה26. בדיקת המדווח ACT1-CUP1 מבוססת על ביטוי של זוג גנים: ACT1, המכיל אינטרון אחד עם רצפי אתרי חיבור אופטימליים, ו-CUP1, המבטא כלאטור נחושת, המגן על התא מפני הנזק שנגרם על ידי יון מתכת זה. CUP1 מתבטא רק אם ACT1 מחובר כהלכה, ולכן נוצרת מערכת המדווח27. ניתן לנטר את צמיחת התאים בתנאים עם ריכוזי נחושת שונים כדי לטפל ביעילות השחבור של רצפי אינטרונים שונים או באמצעות חלבונים רגולטוריים שונים. ואן דר פלץ24 מציג שיטה לניתוח ההשפעות של חלבון רגולטורי שחבור באמצעות מערכת דיווח זו ומבחני כדאיות נחושת. ניתן להשתמש בגישה דומה לתכנון וריאציות ברצפי אינטרונים בשילוב עם חלבונים שונים כדי לטפל בהצלחת שחבור בשמרים.
בנוסף לאסוציאציה של snRNP, קשירת החלבונים חיונית במהלך הרכבת spliceosome1. השליטה בפעילות הספלייסוזום תלויה ישירות בהרכב החלבון שלו ובאינטראקציות המתרחשות במהלך היווצרותו. המאפיינים המבניים והתפקודיים של רכיבי החלבון חשובים להפעלת הקומפלקס 5,7. Carvalho et al.28 משתמשים בגישה המבוססת על שיטת Grafix, המסתמכת על קישור צולב של חלבון בלתי הפיך בניתוח שיפוע גליצרול. ניתוח זה מתייחס להרכב החלבונים ולאינטראקציות החולפות המתרחשות במהלך ההרכבה, שיכולות להיות קריטיות להרכבת הקומפלקס הפעיל ולהצלחת השחבור. ניתוח של קומפלקסים מקרומולקולריים דינמיים אחרים בגישה זו יכול להיות שימושי מאוד ולספק תובנות לגבי ארגון ואינטראקציות חלבון.
הכימיה ומהירות השחבור מושפעות גם מהאסוציאציה הדינמית של רכיבי השחבור השונים8. לאחרונה, השימוש במעכבי שחבור של מולקולות קטנות גילה כי ניתן לעכב שלבים ספציפיים במבחנה עקב המהירות המופחתת של תגובות שחבור 29,30. Basei et al.31 מציגים שיטה לניתוח שחבור חלופי על השפעת הגורם הרגולטורי של השחבור, Nek4. השכיחות של איזופורמים של תעתיק המובילים לפנוטיפים פרו-או אנטי-גידוליים בתאי HEK293 באמצעות מיניגן מטופלת. ויסות שגוי של שחבור או שימושים שונים באתרי חיבור עלולים להוביל ליצירת תעתיק חלופי, ולגרום לסוגים שונים של סרטן16. השימוש במודולטורים או מעכבי שחבור במהלך הטיפול יכול לקבוע את בחירת אתרי החיבור, ובכך להגדיר את האיזופורמים האלטרנטיביים שנוצרו, בין אם פרו-גידוליים או אנטי-גידוליים. פקליטקסל וציספלטין משמשים כיום כחומרים כימותרפיים. עם השימוש במיניגן E1A, מטופלות ההשפעות של תרופות אלו בשחבור אלטרנטיבי. ניתוח שחבור חלופי באמצעות מיניגנים הוא אסטרטגיה חשובה לניטור ההשפעות של חלבונים טרנס-אקטיביים ושינויי שחבור על טיפול ושימוש בתרופות ספציפיות.
בקו זה, דווח על מיקרו-RNA אינטרוני (miRNAs) רבים הקשורים לפנוטיפים גידוליים32,33. הבקרה והוויסות של סינתזת miRNA אינטרונית וביוגנזה יכולים להיות קשורים לשליטה בתגובות שחבור. miRNAs יכולים לווסת את היציבות והשכיחות של mRNAs בתאים, ולהשפיע על יציבות ה-RNA ועל קצב התרגום34. גאטי דה סילבה וקולטרי35 מתארים מערכת דיווח להערכת ביוגנזה והתבגרות של miRNA אינטרוני, אשר יכולה להיות קשורה ישירות לשינויים בפנוטיפים התאיים ולקביעת מאפיינים פרו-או אנטי-גידוליים. עם אפנון החלבון הרגולטורי שחבור HuR, המערכת מאפשרת ניתוח של הביוגנזה והפעילות התפקודית של miRNA אונקוגני אינטרוני.
ניתוח שחבור קדם-רנ"א והבשלה של רנ"א שונים בתאים ספציפיים יהיו חיוניים להבנה ולפירוש של מידע גנומי. שמרים ויונקים נשמרים, ומחקר בסיסי יכול לשפר את השימוש בשיטות השונות המיושמות בטיפולים ובביו-רפואה. למרות הכמות הגדולה של נתונים גנומיים הזמינים כיום, הביטוי של מידע זה בפנוטיפים עשוי להיות ספציפי לתא ותלוי בעיבוד RNA ושחבור. הבנת הרגולציה המורכבת של תהליך זה תהיה חיונית למחקר עתידי.