Method Article

שיטות ופרוטוקולים להדמיה חיה בפיתוח

DOI:

10.3791/64642

⸱

January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמרים שנדונו:

Januschke, J., Loyer, N. יישומים של קיבוע רקמות דרוזופילה עם קרישי פיברין להדמיה חיה. כתב העת לניסויים חזותיים. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. מערכת אקספלנט למחקרי הדמיה בזמן-lapse של הרכבת מעגלי הריח בדרוזופילה. כתב העת לניסויים חזותיים. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. הדמיה in vivo של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור. כתב העת לניסויים חזותיים. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי תא דגימה. כתב העת לניסויים חזותיים. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית. כתב העת לניסויים חזותיים. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון שומנים ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה. כתב העת לניסויים חזותיים. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. אבלציות נפח עמוקות ומבוקרות מרחבית באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני בגסטרולה של דג הזברה. כתב העת לניסויים חזותיים. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתפתחות מאופיינת בשינוי דינמי של מבנים ברמת האברונים, התאים והאיברים. היכולת של הדמיית זמן-lapse לאסוף מידע ארבע-ממדי מאותו מבנה במצבו הפיזיולוגי הופכת אותו לטכניקה אידיאלית לחקר תהליך ההתפתחות הדינמי 1,2,3,4,5,6. כמות הנתונים העצומה הנאספת באמצעות הדמיה חיה מאפשרת גם ניתוח כמותי של הפיתוח. למרות שהדמיית זמן-lapse הייתה בשימוש נרחב יותר לתרבית תאים חד-שכבתית, הדמיה של רקמות חיות או בעלי חיים תלת מימדיים היא הרבה יותר מאתגרת בגלל קשיים טכניים, כגון פיזור אור של רקמות חיות, פיתוח אסטרטגיית הרכבה ושיטת תיוג מתאימה, שמירה על מצב פיזיולוגי תקין במהלך תקופת הדמיה ממושכת, נגישות למיקרוסקופ מתאים, וכו. אתגרים אלה מגבילים את השימוש בהדמיה חיה במעבדות רבות. באוסף שיטות זה, שבעה מאמרים דיווחו על שיטות חדשות להכנת דגימות חיות, תיוג ומניפולציה מבוססת לייזר. כל השיטות הללו מאפשרות הדמיה חיה של תהליכי התפתחות מזוויות שונות.

הדמיה ישירה של אזורים עמוקים היא מאתגרת מבחינה טכנית בשל הפיזור החזק של רקמות חיות. ניתן למזער פיזור זה על ידי חשיפת איברים פנימיים באמצעות דיסקציה, ובכך לשפר את הרזולוציה המרחבית של התמונות. באוסף זה, Januschke ו-Loyer7 תיארו פרוטוקול לניתוח מוחות של זחלי דרוזופילה ושיטת הרכבה באמצעות קרישי פיברין. אסטרטגיית הרכבה זו אפשרה הדמיית זמן-lapse באמצעות מיקרוסקופים הפוכים של מספר דגימות על אותה צלחת מכיוון שהיא דרשה רק תוספת של פיברינוגן וטרומבין. לי ולואו8 הציגו פרוטוקול לדיסקציה של אנטנה-מוח מגלמים של זבובים ומצב תרבית ex vivo ששמר על התפתחות תקינה של מעגל הריח למשך 24 שעות. המערכת שלהם אפשרה הדמיה של מיקוד אקסונלי ודנדריטי בהרכבה של מעגל ריח זבוב ממצבו הפיזיולוגי. מערכת אקספלנט זו מתאימה למיקרוסקופ דו-פוטוני ומיקרוסקופ יריעות אור סריג עם הדמיה מבוססת אופטיקה אדפטיבית, המאפשרת הן הדמיה רציפה לטווח ארוך והן הדמיה מהירה ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה בפרק זמן קצר. Schramm et al.9 פיתחו הליך כירורגי זעיר פולשני להסרת העור וסחוס הגולגולת הרך של דג הזברה באמצעות מיקרו-פילינג. זה איפשר להם לצפות בכמה אירועי מפתח בשלבי התפתחות מאוחרים יותר, כולל התמיינות עצבית, התבגרות, פלסטיות וחולף Ca2+ עד 30 יום לאחר ההפריה. זה גם אפשר להם לבצע הדמיה חיה לאחר פיגמנטציה של עורות זחלי דג הזברה. בנוסף לדיסקציה, הרכבה מתאימה של דגימות חיונית גם להדמיה חיה. Ratke et al.10 הציגו מסגרת ניסויית להדמיה חיה בו זמנית של עוברי זבובים מרובים באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. פרוטוקול זה הגדיל את התפוקה הכוללת והוא אידיאלי למחקר השוואתי.

בנוסף להכנת הדגימות, שיטות תיוג חדשות מקלות על הדמיה של מבנים ספציפיים ברקמות חיות. Terzi et al.11 דיווחו על חיישן ביולוגי ספציפי H2O2 מקודד גנטית, roGFP2-Orp1, להדמיית רמות H2O2 תוך תאיות מתאי עצב וזחלים שלמים במהלך ההתפתחות. יתרון חשוב אחד של חיישן ביולוגי H2O2 מקודד גנטית זה היה שיפור הרזולוציה הזמנית והמרחבית של זיהוי H2O2 . מחקר אחר של Mutlu et al.12 תיאר מיקרוסקופ פיזור רמאן מגורה (SRS), שיטת הדמיה כימית ללא תוויות לזיהוי מהיר וכמותי של שומנים בתאים חיים ברזולוציה תת-תאית. גם H2O2 וגם שומנים הולכים לאיבוד בקלות במהלך קיבוע הדגימה. פיתוח שיטות תיוג או הדמיה ברקמות חיות לא רק עקף אתגר זה, אלא גם שמר על מידע מרחבי וזמני של מבנים אלה בתהליכים ביולוגיים.

לבסוף, אור יכול לשמש גם לאבלציה של תאים. Boutillon et al.13 הראו שיטה להפחתת נפחים עמוקים ומוגדרים היטב מבחינה מרחבית בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. בהשוואה לאבלציות תאים מבוססות לייזר אולטרה סגול, הלייזר הדו-פוטוני שיפר את הרזולוציה הצירית ואת חדירת הרקמות. פרוטוקול זה סיפק אסטרטגיית הפרעה לחקר אינטראקציה בין תאים במהלך ההתפתחות.

התקדמות הטכנולוגיות המיקרוסקופיות אפשרה לנו להבין תהליכי התפתחות רבים בארבעה ממדים. פרוטוקולים באוסף זה יסייעו למדענים נוספים להתגבר על המחסום הטכני של הדמיה חיה במערכות ביולוגיות שונות. אנו צופים כי בעתיד יפותחו שיטות נוספות המאפשרות הדמיה חיה.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחבר אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גיליון זה של אוסף שיטת JoVE מומן על ידי NIH 1K99DC01883001. אני מודה למנטור הפוסט-דוקטורט שלי ליקון לואו, לעמיתיי אריק בטציג וטיאן-מינג פו על התמיכה החזקה בפיתוח העניין שלי בהדמיית דולג זמן במהלך פרויקט הפוסט-דוקטורט שלי. אני גם מודה לבית הספר למדעי המוח ולרפואת המוח באוניברסיטת ג'ג'יאנג על שגייסו אותי ותמכו בי להמשיך במחקר הדמיה בהילוך מהיר במעבדה שלי.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
  3. Ezin, M., Fraser, S. Time-lapse imaging of the early avian embryo. Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).
  4. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Current Opinion in Cell Biology. 17 (6), 676-681 (2005).
  5. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  6. Christen, P., Muller, R. In vivo visualisation and quantification of bone resorption and bone formation from time-lapse imaging. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 311-317 (2017).
  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Live ImagingDrosophilaImmobilizationTime lapse ImagingOlfactory Circuit AssemblyIn Vivo ImagingBrain TissueZebrafish LarvaeLight Sheet Fluorescence MicroscopyNeuronal DevelopmentROS ImagingLipid Storage DynamicsCaenorhabditis ElegansStimulated Raman Scattering MicroscopyTwo photon MicroscopeVolume Ablations

Related Articles