מאמר שיטה

שימוש ב - C. elegans לניטור חוסר איזון של פרוטאוסטזיס

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64643

⸱

24 באוגוסט 2022

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

במאמר זה

תקציר

רשת הפרוטאוסטזיס היא מערכת בקרת איכות חלבון תאית המבטיחה פונקציונליות של פרוטאום, ומקדמת את בריאות התאים והאורגניזמים. עם הגיל, נאמנותו יורדת, מה שמוביל לפגיעות מוגברת של הפרוטאום ללחץ ובסופו של דבר למחלות כמו הפרעות ניווניות וסרטן. כדי להדגיש את המחקר על רשת שמורה אבולוציונית זו, כתב העת לניסויים חזותיים (JoVE) מציג אוסף של שיטות של חוקרים המשתמשים ב-C. elegans כדי לנטר חוסר איזון של פרוטאוסטזיס. מאמר מערכת זה מספק סקירה קצרה של גישות ניסיוניות שונות אלה להבנת רשת הפרוטאאוסטזיס ברמת התא, הרקמה והאורגניזם.

מאמרים שנדונו:

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. שיטות סטנדרטיות למדידת אינדוקציה של תגובת הלם החום ב- Caenorhabditis elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. (161), doi:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. et al. RT-PCR כמותי בעל תפוקה גבוהה בדגימות C. elegans בודדות ובתפזורת באמצעות טכנולוגיה ננו-פלואידית. כתב העת לניסויים חזותיים. (159), doi:10.3791/61132 (2020).

בר-זיו, ר. ואח'. מדידות של תגובות לחץ פיזיולוגיות ב- C. Elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. (159), doi:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. יישור תולעת ו-Worm_CP, שני צינורות קוד פתוח ליישור וכימות של נתוני תמונה פלואורסצנטיים המתקבלים מ-Caenorhabditis elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. (159), doi:10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמה ב- Caenorhabditis elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. (175), doi:10.3791/61100 (2021).

דרור, ש., מידן, ט.ד., קראדי, א., בן-צבי, א. שימוש ב-Caenorhabditis elegans כדי לסנן אינטראקציות מלווה ספציפיות לרקמות. כתב העת לניסויים חזותיים. (160), doi:10.3791/61140 (2020).

מיילס, ג'יי., ואן אוסטן-האוול, פ. כלי RNAi ספציפיים לרקמות לזיהוי רכיבים לאיתות מתח מערכתי. כתב העת לניסויים חזותיים. (159), doi:10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. כימות in vivo של תחלופת חלבון בהזדקנות C. elegans באמצעות dendra הניתנת להמרה פוטו2. כתב העת לניסויים חזותיים. (160), doi:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. אפיון מבני עמילואיד בהזדקנות C. elegans באמצעות הדמיית אורך חיים פלואורסצנטית. כתב העת לניסויים חזותיים. (157), doi:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. מדידת רעילות פפטיד RAN ב- C. elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. (158), doi:10.3791/61024 (2020).

ארנולד, מ.ל., קופר, ג'יי., גרנט, ב.ד., דריסקול, מ. גישות כמותיות לניקוד במצטבר עצבי in vivo ושחול אברונים בשלפוחיות אקסופר גדולות ב-C. elegans. כתב העת לניסויים חזותיים. (163), doi:10.3791/61368 (2020).

מאמר מערכת

הומאוסטזיס חלבון, או פרוטאוסטזיס, הוא בסיסי לבריאות התאים והאורגניזמים 1,2. תהליכים תאיים משומרים משתפים פעולה כדי לשמור על פרוטאום מקופל כהלכה על ידי השפעה על סינתזת חלבון, קיפול ופינוי 3,4. הפרעות בפרוטאוסטזיס נקשרו למחלות ניווניות הקשורות לגיל ולסרטן 5,6. בהתבסס על רמת השימור הגבוהה, אורגניזמים מודלים כמו הנמטודה Caenorhabditis elegans (C. elegans) היו חיוניים בהבנת תפקיד הפרוטאוסטזיס בבריאות האדם ובמחלות 7,8. ל-C. elegans יש מאפיינים רבים שהופכים אותו למודל ניסיוני אידיאלי, כולל מחזור החיים הקצר שלו, הקוטיקולה השקופה וקלות המניפולציות הכימיות והגנטיות9. אוסף שיטות זה מספק פרוטוקולים מפורטים לניטור חוסר איזון של פרוטאוסטזיס ברמה המולקולרית, התאית והאורגניזמית ב- C. elegans.

תאים מגיבים לשיבושים בפרוטאוסטזיס על ידי הפעלת מגוון תגובות לחץ, כולל תגובת הלם חום (HSR), תגובת החלבון הפרושה (UPR) ותגובת המתח החמצוני (OxSR) כדי להתאים מחדש את הפרוטאום התאי10. כדי לשפר את יכולת השחזור בשטח, פרקטיקות סטנדרטיות לאינדוקציה חזקה של HSR מתוארות על ידי גולדן ועמיתיו11. RT-qPCR היא שיטה רגישה בשימוש נרחב לניתוח ביטוי גנים על ידי כימות mRNA, וניתן להשתמש בבדיקה זו כדי למדוד את רמות ה-mRNA התאיות של גנים שונים המעוררים הלם חום11. כדי להרחיב גישה זו לניתוח בקנה מידה גדול ובתפוקה גבוהה, Chauve et al.12 מתארים התאמה חדשה להכנת cDNA, יחד עם פלטפורמת RT-qPCR ננו-פלואידית שהיא חזקה ורגישה מאוד. ניתן לבצע מדידות מדויקות של ביטוי גנים על תולעים בודדות או דגימות בתפזורת12. מטרות גן תגובת לחץ מומלצות יחד עם זוגות הפריימרים למדידת ויסות השעתוק של גנים של תגובת לחץ מפורטים בפרוטוקולים המתאימים12,13.

מגבלה אחת של שימוש ב-RT-qPCR להערכת הפעלת תגובות לחץ היא שזה יכול להיות יקר, קשה מבחינה טכנית ודורש שימוש בציוד מיוחד. לכן, זני דיווח שעתוק ספציפיים למסלול המבטאים חלבון פלואורסצנטי תחת מקדם השראת מתח (למשל, hsp-16.2p::gfp לניטור HSR) משמשים לעתים קרובות להערכת תגובות לחץ תאיות11. באמצעות זרימת עבודה פשוטה מבוססת פיג'י בקוד פתוח בשם Worm-align בשילוב עם Worm_CP צינור CellProfiler, Okkenhaug ועמיתיו מתארים14 שלבים לכימות מהיר של פלואורסצנטיות מתולעים בודדות. בנוסף, בר-זיו ואחרים מתארים שיטה בעלת תפוקה גבוהה באמצעות ציטומטר זרימת חלקיקים גדולים המאפשר לכידת עוצמת הקרינה, גודלה והתפלגות מרחבית (2D) של אלפי בעלי חיים. מידע על מדווחי שעתוק להערכת הפעלת תגובות מתח תאיות יחד עם ההגדרות המומלצות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית וכימות באמצעות מיון ביולוגי של תולעיםמסופקים 13. חשוב לציין, ניתן לשייך את המדווחים הללו למבחני הישרדות מתח פיזיולוגיים ספציפיים המנטרים את בריאותו של בעל חיים בעקבות משטר לחץ ספציפי11,13. למרות שלמדווחים פלואורסצנטיים יש יתרון בחשיפת הבדלים ספציפיים לרקמות, הם יכולים לזהות רק אינדוקציה מעל סף מסוים והיציבות של פלואורופורים מסוימים, כגון GFP, מונעת זיהוי של וריאציות דינמיות בביטוי גנים. יתר על כן, רוב הבדיקות הפיזיולוגיות גוזלות זמן ולכן יש להן מדרגיות מוגבלת. למרות מגבלות אלה, שיטות אלו מאפשרות אפיון מקיף של ההשפעות התאיות והפיזיולוגיות של גורמי לחץ פנימיים וחיצוניים.

הפרעות פרוטאוטוקסיות כרוניות קשורות לקריסת רשת הפרוטאוסטזיס (PN), מנגנון בקרת האיכות האחראי על שמירה על פרוטאום פונקציונלי 5,6. ירידה מתקדמת בפרוטאאוסטזיס מעורבת במחלות רבות הקשורות לגיל. C. elegans היא מערכת מודל נהדרת לבחינת הפגיעות של רקמות ספציפיות לכשלים בפרוטאוסטזיס. Lazaro-Pena et al.15 מתארים גישה לניטור דופן הגוף, השרירים או תפקוד העצבים ככל שהתולעת מזדקנת. ניתן להתאים גישה זו לניתוח גנטי בתפוקה גבוהה יותר או לבדיקת תרופות15. האתגר העיקרי הוא להבין כיצד פועלות האינטראקציות בין המרכיבים השונים של ה-PN in vivo. כדי להתמודד עם חיסרון זה, דרור ועמיתיו פיתחו מערכת לאיסוף מידע ספציפי על האינטראקציות של מלווים מולקולריים, מרכיבים מרכזיים של ה-PN, ברקמות ספציפיות במהלך ההתפתחות וההזדקנות. על ידי צימוד הפרעות ספציפיות לרקמה של שיווי משקל מתקפל עם מוטציות זמינות או זנים טרנסגניים המאפשרים השתקה ספציפית לרקמה של גני מטרה על ידי RNAi, ניתן לבחון את רשת המלווה ברקמה נתונה. השלמת אסטרטגיה זו עם מבחנים התנהגותיים פשוטים המעריכים את הפונקציונליות של רקמות או סוגי תאים ספציפיים יכולה לחשוף אינטראקציות רלוונטיות ביולוגית של ה-PN in vivo 15,16. חשוב להכיר בכך שחוסר איזון של פרוטאוסטזיס ברקמה אחת או בסוג תא אחד עלול להשפיע על מערכת בקרת האיכות של רקמות נוספות באופן לא אוטונומי של התא. מיילס ו-ואן-אוסטן-האוול17 מתארים גישה לזיהוי מנגנונים ורכיבים של ה-PN הלא-אוטונומי של התא באמצעות גישות RNAi ספציפיות לרקמות בשילוב עם מגוון מדווחי מתח וחיישני פרוטאוסטזיס17. אסטרטגיה זו מאפשרת לבחון את יכולת ה-PN ברקמות שונות כתוצאה ממנגנוני תגובת לחץ לא אוטונומיים המופעלים על ידי תאים.

C. elegans משמש בדרך כלל למודל מחלות ניווניות הקשורות לגיל הנגרמות על ידי מוטציות התפשטות חוזרות של פוליגלוטמין, כגון מחלת הנטינגטון18. חיישן פרוטאוסטזיס שנמצא בשימוש רב הוא מקטע פוליגלוטמין (polyQ) המותך לחלבון פלואורסצנטי היוצר מוקדים in vivo בהתאם לאורך polyQ וגיל19. שיפור יכולת השחזור בניסויים ביולוגיים, בין אנשים ובין מעבדות, דורש להגדיר מה מקבל ניקוד כמוקדים. Lazaro-Pena et al.15 מתארים אסטרטגיה למדידה מדויקת של היווצרות מוקדי polyQ::YFP בתוך נוירונים או שרירי דופן הגוף במהלך ההזדקנות. כדי לנטר את שיעורי התחלופה של חלבון הנטינגטין המוטנטי הנוטה לצבירה הנושא התרחבות פוליגלוטמין, Pigazzini ו-Kirstein20 מתארים טכניקה לא פולשנית הדורשת שימוש בפלואורופור הניתן להמרה Dendra2. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וזן C. elegans המבטא הנטינגטין מוטנטי שהתמזג לדנדרה2, ניתן לנטר ולכמת את הפירוק של חלבון זה הנוטה לצבירה באורגניזם מזדקן20. כדי לכמת פיבריליזציה של עמילואיד של חלבונים המועדים לצבירה כגון הנטינגטין מוטנטי, ניתן להשתמש במיקרוסקופ הדמיה לכל החיים פלואורסצנטי (FLIM)21. FLIM מאפשר ניתוח לא פולשני של תהליך הצבירה על ידי ניטור הכיבוי של פלואורופורים בסמיכות למבני עמילואיד, ובכך מפחית את אורך החיים הקרינה21. אורך החיים הקרינה נמצא בקורלציה שלילית עם צבירה של חלבון העמילואיד המאוחה ואינו תלוי ברמות הביטוי של פלואורופור. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לעקוב אחר השפעות ההזדקנות ופגיעה ב-PN על נטיית הצבירה של כל חלבון. עם זאת, אם עוצמת הפלואורופור נמוכה, הדבר עלול להפוך לבעייתי מכיוון ש-FLIM דורש רכישה של מספר גדול יחסית של פוטונים. לכן יש צורך בעוצמת לייזר עירור גבוהה יותר, מה שמוביל להלבנה מהירה יותר ועקומת דעיכה לא אמינה. יתר על כן, הטכניקה דורשת ציוד מתוחכם ויקר כתוספת למערכות מיקרוסקופיה קיימות. גישה סטנדרטית חשובה כלולה עבור פרוטוקול אחר החוקר תרגום חוזר שאינו תלוי AUG (RAN) הקשור ל-RNA המכיל הרחבות חוזרות. מכיוון שתרגום RAN אינו דורש קודון התחלה כדי לקבוע את מסגרת הקריאה, מספר הפפטידים הרעילים האפשריים הקשורים למחלה עולה. רודיך ועמיתיו22 מספקים פרטים כיצד לכמת רעילות פפטיד RAN באמצעות תנועה ורבייה של C. elegans .

חוסר איזון בפרוטאאוסטזיס מוביל לקיפול שגוי של חלבונים ולהצטברות של אגרגטים חלבונים שנקשרו למחלות נוירודגנרטיביות מרובות הקשורות לגיל 5,6. זני C. elegans המבטאים חלבונים שונים המועדים לצבירה שהתמזגו למדווחים פלואורסצנטיים שימשו לניטור חוסר איזון של פרוטאוסטזיס על פני סוגי תאים ורקמות שונים. ניתוח מודלים אלה הוביל לסדרה של תצפיות חדשות; מוניקה דריסקול ועמיתיה הבחינו כי נוירונים משחררים אגרגטים של PolyQ ופסולת תאית אחרת, כגון אברונים פגומים, ב"אקסופר", וחושפים ענף שלא זוהה בעבר של פרוטאוסטזיס עצבי23. מכיוון שמדובר בתופעה חדשה, חיוני לספק הנחיות ברורות לניטור ייצור האקסופר כדי להבטיח שחזור בתוך השדה. Arnold et al.24 מתארים את המאפיינים הפיזיקליים של C. elegans exophers, אסטרטגיות לגילוים, קריטריוני זיהוי ותזמון אופטימלי לכמות. יתר על כן, פרוטוקול זה מדגיש את תשומת הלב הקריטית הדרושה לשליטה קפדנית בתנאי הגידול כדי למנוע מתחים לא מכוונים שיכולים לווסת את רמות האקסופר כדי להשיג הערכה ניתנת לשחזור של ייצור האקסופר.

אוסף זה מספק אסטרטגיות מתודולוגיות מרובות לניטור חוסר איזון של פרוטאוסטזיס ברמה המולקולרית, התאית והאורגניזמית ב - C. elegans. גורמי לחץ, כגון חלבוני מחלה לא מקופלים, יכולים להיות מוכנסים באופן ניסיוני לסוגי רקמות ספציפיים, בעוד שהתגובה התאית והאורגניזמית לרעילות פרוטאוטוקסית מנוטרת לאורך זמן. אוסף זה מספק ערכת כלים לבדיקה וניטור של פרוטאוסטזיס, הערכת מערכות בקרת איכות השומרות על פרוטאום מקופל וחקירת חוסר ויסות של מערכות אלה המובילות למחלות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לעמיתינו על תרומתם החשובה ביותר לאוסף שיטות זה.

מקורות

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475 (7356), 324-332 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (11), 777-788 (2010).
  4. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  6. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), 004440(2011).
  7. Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Model Mechanism. 13 (10), (2020).
  8. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  9. Girard, L. R., et al. WormBook: the online review of Caenorhabditis elegans biology. Nucleic Acids Research. 35, 472-475 (2007).
  10. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cellular stress response pathways and ageing: intricate molecular relationships. The EMBO Journal. 30 (13), 2520-2531 (2011).
  11. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), e61030(2020).
  12. Chauve, L. High-throughput quantitative RT-PCR in single and bulk C. elegans samples using nanofluidic technology. Journal of Visualized Experiments. (159), e61132(2020).
  13. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61001(2020).
  14. Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61136(2020).
  15. Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (175), e61100(2021).
  16. Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions. Journal of Visualized Experiments. (160), e61140(2020).
  17. Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Tissue-specific RNAi tools to identify components for systemic stress signaling. Journal of Visualized Experiments. (159), e61357(2020).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods Enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  20. Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
  21. Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of amyloid structures in aging C. elegans using fluorescence lifetime imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), e61004(2020).
  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

Proteostasis NetworkProtein Quality ControlNeurodegenerative DisordersCellular HealthHeat Shock ResponsePhysiological Stress ResponsesTissue-specific ProteostasisRNAi ToolsProtein TurnoverPhotoconvertible Dendra2Experimental Approaches
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.