מאמר שיטה

שיטות לחקר אוסטיאואנרגטיקה ומטבוליזם

DOI:

10.3791/64649

⸱

12 באוגוסט 2022

 , 
1Department of Medicine, Clinical Pharmacology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Internal Medicine, Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמרים שנדונו:

שן, ל., קרנר, ס.מ. הערכת צריכת חומצות אמינו בתאי עצם מתורבתים ופירי עצם מבודדים. כתב העת לניסויים חזותיים. (182), e62995 (2022).

Jayapalan, S., Nandy, A., Rendina-Ruedy, E. שימוש באננליזר שטף מטבולי של תאים בזמן אמת לניטור ביואנרגטיקה של אוסטאובלסטים. כתב העת לניסויים חזותיים. (181), e63142 (2022).

Song, C., Valeri, A., Long, F. הערכת חמצון מצע אנרגיה במבחנה עם לכידת 14CO2 . כתב העת לניסויים חזותיים. (181), e63568 (2022).

קים, ס.פ., לי, ז., רידל, ר.ק. הערכת חמצון חומצות שומן בתאי עצם מתורבתים. כתב העת לניסויים חזותיים. (182), e63638 (2022).

Guo, W., Wu, C. ניצול מתח חמצן נמוך להפחתת תאים המופויאטיים בתרביות תאי סטרומה של מח עצם עכבר. כתב העת לניסויים חזותיים. Epub לקראת הדפוס (2022).

מאמר מערכת

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצם היא רקמה דינמית שעוברת שיפוץ מתמשך, הכולל אוסטאוקלסטים סופגי עצם ואוסטאובלסטים יוצרי עצם. חשוב לציין, תהליכים אלה משולבים עם תאים אחרים השוכנים בחלל מח העצם, כגון תאים המטופויאטיים ואדיפוציטים של מח העצם. ניתוק בתחלופת העצם מביא לשבריריות השלד ולעלייה בשבריםלאחר מכן 1. מחקרים אחרונים הוכיחו את החשיבות של מצעים מטבוליים ומטבוליזם אנרגטי לוויסות היווצרות העצם וספיגת העצם 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17. התמקדות במסלולים מטבוליים משמשת לטיפול בסוגי סרטן שונים ויכולה להיות כלי פרובוקטיבי שניתן ליישם כדי להילחם במצבים שונים המובילים לשכיחות מוגברת של שברים18. בשל כך, חשוב שתהיה הבנה מלאה של חילוף החומרים התאי בכל תאי העצם. למרבה הצער, חקר תאי עצם בסביבתם הטבעית הוא מאתגר בשל מיקומם בתוך הרקמה המינרלית. בהשוואה לרקמות לא מינרליות, השלבים הנדרשים לעיבוד עצם מקשים על מחקרים מולקולריים ומכניסטיים של מצבן המטבולי. ככזה, אוסף זה נועד להדגיש טכניקות מבוססות המשמשות לניטור מסלולים מטבוליים בתאים המבודדים מנישת השלד שלהם.

"אוסטאואנרגטיקה" מתארת את התהליכים המטבוליים והפוטנציאל הביו-אנרגטי של אוסטאובלסטים ונותרה תחום פעיל של עניין וחקירה מדעית. עם זאת, לפני יכולתם של התאים לייצר ולנצל ATP, יש לרכוש תחילה סובסטרטים אנרגטיים. שלושה מאמרים באוסף זה מדגישים שיטות המשמשות לניטור גורלות סובסטרט ספציפיים בתוך תאי עצם. ראשית, שן וקרנר19 מתארים טכניקות להערכת צריכת חומצות אמינו בתאים מתורבתים במבחנה או בעצמות מבודדות ex vivo. במערכת במבחנה, תאי ST2 מתורבתים מודגרים עם L-[3,4-3 H]-גלוטמין למשך זמן קבוע מראש, וספיגת הגלוטמין מכומתת באמצעות מונה נצנוץ. באופן דומה, במערכת ex vivo, עצמות שנקטפו מעכברים יילודים מודגרות בחומצות אמינו עם תווית רדיו, וספיגת חומצות אמינו מוערכת באמצעות מונה נצנוץ. שיטות אלו מאפשרות הערכה מהירה ורגישה של ספיגת חומצות אמינו בתאי עצם או בעצמות מבודדות. חשוב לציין, שיטות אלה ניתנות לשינוי בקלות כדי להעריך חומצות אמינו שונות או מצעים אנרגטיים אחרים ולבחון שאלות מדעיות שונות.

בנוסף לחומצות אמינו, גלוקוז וחומצות שומן ארוכות שרשרת (LCFA) מייצגים אספקה צפופה של אנרגיה תאית או ATP. ביכולת זו, LCFA נכנס למיטוכונדריה באמצעות קרניטין פלמיטואיל טרנספראז (CPTI/II), שם הם מתחמצנים בקלות באמצעות חמצון β, ולאחר מכן יכולים להיכנס לחומצה טריקרבוקסילית (TCA) או למחזור זרחון חמצוני כדי להניב ATP. סדרה זו של תגובות כימיות מביאה בסופו של דבר לשחרור פחמן כפחמן דו חמצני גזי (CO2), שקשה לכמת. סונג ואחרים וקים ואחרים מתארים במומחיות שתי שיטות קשורות למדידת המטבוליטים הנוצרים בתהליך החמצון20,21. שתי הטכניקות משתמשות במצע פחמן עם תווית C 14ונייר סינון ככלי "לכידה" כדי לכמת את 14CO2 המשוחררים. עם זאת, כל שיטה חשובה באותה מידה מכיוון שהיא מתארת כלי תרבות ייחודיים וטכניקות נורמליזציה של נתונים. בנוסף, Song et al.20 מתארים כיצד לחשב חמצון מצע, בעוד ש-Kim et al.21 כוללים שיטה נוספת למדידת מטבוליטים מסיסים בחומצה.

מחקרי מעקב אלה מאפשרים לחוקר לקבוע את גורלם המטבולי של מצעים שונים. כהשלמה, Jayapalan et al.22 משתמשים בניתוחי שטף מטבולי כדי לנטר תהליכים מטבוליים, כולל גליקוליזה וזרחון חמצוני באמצעות נשימה מיטוכונדריאלית. ציוד זה מודד באופן בסיסי חמצן ו-pH בתרביות תאים חיים בזמן אמת. לכן, על ידי תרבית תאי סטרומה ראשוניים של מח העצם (BMSCs) באמצעות התמיינות אוסטאובלסטים, ניתן לבצע מגוון ניסויים תוך ניטור המסלולים המטבוליים23. ניתן לבצע טכניקה זו בארבע זריקות שונות, המאפשרות לחוקרים להתאים את הניסויים לשאלות מדעיות ספציפיות תוך יכולת לעקוב אחר פרוטוקולים סטנדרטיים, כולל קצב ATP, ניצול דלק/מצע, נשימה מיטוכונדריאלית ומבחני קצב גליקוליטי. לבסוף, מכיוון שרבים מהניסויים הללו הם מכניסטיים באופיים, הכרחי לשמור על אוכלוסיית תאים הומוגנית ללא זיהום על ידי סוגי תאים אחרים. למערכות תרבית תאים במבחנה המשמשות לניטור תהליכים מטבוליים של תאי עצם יש מגבלות אינהרנטיות רבות. Guoו-Wu 24 מציעים סקירה מצוינת של המגבלות שהוצגו במהלך תרביות BMSC סטנדרטיות ותורמים שיטה מפורטת להעשרת אוכלוסיות תאי סטרומה ולמזעור זיהום המטופויאטי באמצעות היפוקסיה.

לסיכום, אוסף זה מדגים טכניקות לניטור ניצול מצע ויכולת ביו-אנרגטית במגוון מודלים של שלד הן במבחנה והן ב-ex vivo. רוב השיטות הללו מבוצעות באמצעות מערכות תרבית תאים ולכן מציגות מגבלות עקב הסביבה המלאכותית. אמנם נכון שתאים ראשוניים מאפשרים מערכת פיזיולוגית יותר, אך תאים אלה מגודלים לעתים קרובות בחמצן גבוה במצע המכיל ריכוזים עודפים של מצעים מטבוליים, ולפעמים, אפילו עם אוכלוסיות תאים מזהמות. לכן, זה קריטי שהניסויים המכאניסטיים הללו יתמכו בנתונים נוספים in vivo. עם זאת, תחום מחקר מרגש זה כבר הוכיח את עצמו כמועיל. בהקשר זה, המשך אפיון תהליכים מטבוליים "נורמליים" לעומת פתולוגיים הוא נישה מדעית מבטיחה. יתר על כן, חקר אוסטיאואנרגטיקה ומטבוליזם כדי להבין כיצד, מדוע ומתי תאי עצם משתמשים במצעים שונים וההשלכות שיש להם על בריאות העצם הכללית פותח שטח רחב למטרות טיפוליות. לשם כך, נמצא כי ביספוספונטים אנטי-ספיגה מהדור הראשון (כלומר, אטידרונאט וקלודרונאט) המשמשים לטיפול באוסטאופורוזיס משפיעים על אנרגטיקה של אוסטאוקלסטים. תרופות מרשם נרחבות אלה מייצגות דוגמה מושלמת לאופן שבו ניתן לנצל מסלולים מטבוליים כדי להשפיע על בריאות העצם הכללית ולשפר את איכות חייו של המטופל. בנוסף לטיפולים נוגדי ספיגה, ישנם שני טיפולים אנבוליים שאושרו על ידי ה-FDA, Teriparatide ו-Romosozumab, המפעילים את מסלולי ה-PTH וה-WNT, בהתאמה. גם PTH וגם WNT ממריצים את ספיגת הגלוטמין ואת חילוף החומרים באוסטאובלסטים 6,11,25,26. תוך הדגשת ההשלכות הטיפוליות של זה, עיכוב פעילות חילוף החומרים של גלוטמין מפחית את היווצרות העצם בתגובה לטיפולי WNT או PTH אנבוליים 6,11. לכן, יש צורך בהמשך חקירה כדי לחקור את חילוף החומרים והביו-אנרגטיקה בתאי העצם. הטכניקות המתוארות באוסף זה מספקות בסיס להתייחסות לשאלות מדעיות שונות הקשורות לאוסטאואנרגטיקה ומטבוליזם בתאי עצם.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) והמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (NIAMS) AR072123 (ל-ERR), AR076325 ו-AR071967 (ל-CMK); ומענק המכון הלאומי להזדקנות (NIA) AG069795 (ל-ERR).

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annual Review Pathology. 6, 121-145 (2011).
  2. Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
  3. Esen, E., et al. WNT-LRP5 signaling induces Warburg effect through mTORC2 activation during osteoblast differentiation. Cell Metabolism. 17 (5), 745-755 (2013).
  4. Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular Cell Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
  5. Guntur, A. R., et al. Osteoblast-like MC3T3-E1 cells prefer glycolysis for ATP production but adipocyte-like 3T3-L1 cells prefer oxidative phosphorylation. Journal of Bone Mineral Research. 33 (6), 1052-1065 (2018).
  6. Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
  7. Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).
  8. Shares, B. H., Busch, M., White, N., Shum, L., Eliseev, R. A. Active mitochondria support osteogenic differentiation by stimulating beta-catenin acetylation. Journal of Biological Chemistry. 293 (41), 16019-16027 (2018).
  9. Shares, B. H., et al. Inhibition of the mitochondrial permeability transition improves bone fracture repair. Bone. 137, 115391(2020).
  10. Shen, L., Hu, G., Karner, C. M. Bioenergetic metabolism in osteoblast differentiation. Current Osteoporosis Reports. 20 (1), 53-64 (2022).
  11. Stegen, S., et al. Glutamine metabolism in osteoprogenitors is required for bone mass accrual and PTH-induced bone anabolism in male mice. Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 604-616 (2021).
  12. Stegen, S., et al. HIF-1alpha promotes glutamine-mediated redox homeostasis and glycogen-dependent bioenergetics to support postimplantation bone cell survival. Cell Metabolism. 23 (2), 265-279 (2016).
  13. Wei, J., et al. Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).
  14. Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
  15. Arnett, T. R., Orriss, I. R. Metabolic properties of the osteoclast. Bone. 115, 25-30 (2018).
  16. Indo, Y., et al. Metabolic regulation of osteoclast differentiation and function. Journal of Bone Mineral Research. 28 (11), 2392-2399 (2013).
  17. Kim, J. M., et al. Osteoclast precursors display dynamic metabolic shifts toward accelerated glucose metabolism at an early stage of RANKL-stimulated osteoclast differentiation. Cellular Physiology and Biochemistry. 20 (6), 935-946 (2007).
  18. Stine, Z. E., Schug, Z. T., Salvino, J. M., Dang, C. V. Targeting cancer metabolism in the era of precision oncology. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (2), 141-162 (2022).
  19. Shen, L., Karner, C. M. Evaluation of amino acid consumption in cultured bone cells and isolated bone shafts. Journal of Visualized Experiments. (182), e62995(2022).
  20. Kim, S. P., Li, Z., Riddle, R. C. Evaluation of fatty acid oxidation in cultured bone cells. Journal of Visualized Experiments. (182), e63638(2022).
  21. Song, C., Valeri, A., Long, F. Assessing energy substrate oxidation in vitro with 14CO2 trapping. Journal of Visualized Experiments. (181), e63568(2022).
  22. Jayapalan, S., Nandy, A., Rendina-Ruedy, E. Using real-time cell metabolic flux analyzer to monitor osteoblast bioenergetics. Journal of Visualized Experiments. (181), e63142(2022).
  23. Misra, B. B., Jayapalan, S., Richards, A. K., Helderman, R. C. M., Rendina-Ruedy, E. Untargeted metabolomics in primary murine bone marrow stromal cells reveals distinct profile throughout osteoblast differentiation. Metabolomics. 17 (10), 86(2021).
  24. Guo, W., Wu, C. Utilizing low oxygen tension to reduce hemopoietic cells in murine bone marrow stromal cell cultures. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  25. Dietrich, J. W., Canalis, E. M., Maina, D. M., Raisz, L. G. Hormonal control of bone collagen synthesis in vitro: effects of parathyroid hormone and calcitonin. Endocrinology. 98 (4), 943-949 (1976).
  26. Yee, J. A. Effect of parathyroid hormone on amino acid transport by cultured neonatal mouse calvarial bone cells. Journal of Bone and Mineral Research. 3 (2), 211-218 (1988).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Amino Acid ConsumptionCultured Bone CellsBone ShaftsMetabolic Flux AnalyzerOsteoblast BioenergeticsEnergy Substrate Oxidation14CO2 TrappingFatty Acid OxidationLow Oxygen TensionHemopoietic CellsBone Marrow Stromal Cells

מאמרים קשורים