מאמר שיטה

הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens

DOI:

10.3791/64651

⸱

10 בפברואר 2023

 , 
1Department of Biology, University of Louisville

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. באופן כללי, עבור תצפיות על פני תקופה ארוכה, הטכניקה דורשת טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי; עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציה גנטית גוזלת זמן או אינה זמינה מבחינה טכנית. כתב יד זה מציג פרוטוקול להדמיית קיטוע זמן תלת-ממדי של דינמיקת דופן התא במשך 3 ימים באמצעות צבע קלקופלור (המכתים תאית בדופן תא הצמח), שפותח בפטנס פיסקומיטריום טחב. אות צבע הקלקופלור מדופן התא יציב ויכול להימשך שבוע ללא ריקבון ברור. באמצעות שיטה זו, הוכח כי ניתוק התאים במוטציות ggb (שבו תת-היחידה בטא geranylgeranyltransferase-I הוא דפק החוצה) נגרמת על ידי התרחבות תאים בלתי מבוקרת פגמים שלמות דופן התא. יתר על כן, דפוסי צביעת calcofluor להשתנות עם הזמן; אזורים מוכתמים פחות בעוצמה מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות העתידיים של התאים בסוג הבר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דפנות תאי הצמח עוברות שינויים דינמיים במהלך התרחבות התאים והתפתחותם 1,2,3. שמירה על שלמות דופן התא היא קריטית להידבקות תאי צמח במהלך גדילה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. למרות שהדמיית דינמיקה של דופן התא של תאים חיים לאורך תקופת זמן ארוכה היא קריטית להבנת האופן שבו הידבקות התא נשמרת במהלך הפיתוח והסתגלות לשינויים סביבתיים, השיטות הנוכחיות לצפייה ישירה בדינמיקה של דופן התא עדיין מאתגרות.

הדמיה בהילוך מהיר של שינויים תאיים יכולה לספק דינמיקה התפתחותית אינפורמטיבית של אורגניזם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה 4,5,6,7. בעוד שהדמיית תלת-ממד בהילוך מהיר היא בעלת פוטנציאל רב לחקר שינויים דינמיים בצורת התא במהלך גדילה והתפתחות, הטכניקה דורשת בדרך כלל טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי 4,5,6,7. עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציות גנטיות גוזלות זמן רב או מאתגרות מבחינה טכנית. כחלופה, צבעים פלואורסצנטיים המתחברים לרכיבים תאיים זמינים זה מכבר. הצבעים הפלואורסצנטיים יכולים לפלוט אור פלואורסצנטי לאחר הקרנה עם אור באורך גל מסוים. דוגמאות נפוצות הן Edu, DAPI, PI, FM4-64 ו- calcofluor לבן 8,9,10. חיסרון עיקרי אחד, עם זאת, הוא שצבעים אלה יכולים לשמש בדרך כלל רק ברקמות קבועות או לניסויים קצרים, בין השאר בשל הנזק שהם גורמים לתא 8,9,10.

עם הפרוטוקול המוצג כאן, אותות calcofluor יציבים כאשר calcofluor לבן מעורבב בתוך התווך במהלך ניסויים time-lapse ב טחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ניתוק תאים במוטציות ggb באמצעות הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר נצפהבמשך תקופה של 3 ימים 3 (איור 1). שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים והציוד ובטבלה 1 לקבלת רשימת הפתרונות שישמשו בפרוטוקול זה.

1. הכנת צמחים לכלים תחתונים מזכוכית

  1. לגדל את הרקמה פרוטונמלית טחב בתווך אגר BCDAT בצלחת פטרי 13 ס"מ תחת אור לבן קבוע (~ 50 μmol m-2 s-1) במשך 7 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה.
  2. יש לסנן-לעקר את הקלקופלור בלבן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. מגיב יציב במשך מספר חודשים.
  3. פזרו את רקמת הטחב בת 7 הימים לתוך מיקרו-צינורית בנפח 1.5 מ"ל המכילה 20 מיקרוליטר מים מעוקרים. ודא שרקמת הטחב פרוטונמלית מפוזרת מספיק כחתיכות קטנות במים. עבור סוג פראי (WT), השתמש במלקחיים כדי להפריד את הפרוטונמטה; עבור מוטציית GGB , השתמש בפיפט P-1000.
  4. הוסף 10 μL של calcofluor לבן מעוקר לתוך microtube 1.5 מ"ל ולהשאיר את microtube זקוף במכסה המנוע במשך 2 דקות עבור צביעה.
  5. מיד לאחר הצביעה, יש לערבב את הצמחים עם 200 μL של BCDATG מקורר, המכיל BCDAT בינוני בתוספת 0.5% (w/v) גלוקוז ו-0.4% (w/v) gellan gum, על ידי פיפטה חמש פעמים עם פיפטה P-1000.
    הערה: ודא שמדיום BCDATG מקורר מספיק (ממש לפני שהתווך מתמצק) כדי למנוע לחץ על הצמחים.
  6. מעבירים את התערובת המכילה את הצמחים ואת מדיום BCDATG לצלחת בסיס זכוכית בקוטר 27 מ"מ. ודא כי נפח BCDATG לערבוב התאים אינו עולה על 200 μL וכי 200 μL של BCDATG עם דגימות מופץ באופן שווה על פני השטח של צלחת תחתית זכוכית 7 מ"מ כדי לייצר שכבה דקה של סרט, כך הדגימות נמצאות במרחק העבודה האובייקטיבי במהלך ההדמיה.
  7. לאחר התמצקות במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, מכסים את השכבה הדקה ב-3 מ"ל BCDATG מקורר ומניחים לה להתייצב למשך 10 דקות כדי להתמצק שוב.
    הערה: ודא ששלבים 1.2-1.5 מתבצעים במכסה מנוע סטרילי כדי למנוע זיהום.
  8. בתחתית המנה, ציירו תשעה קווים כל אחד בכיוונים מקבילים ומאונכים (איור 2). סמן את השורות בתווים מ- a עד h וסמן את העמודות במספרים מ- 1 עד 8. השתמש בחלק העליון, התחתון, הימני, האמצעי והשמאלי כדי לסמן את המיקומים בתוך כל ריבוע. לדוגמה, אם צמח נמצא בריבוע בשורה השנייה ובעמודה השישית וממוקם בחלק השמאלי העליון של הריבוע, אז צמח זה מקבל את השם "b6_upper_left".
  9. קדם גידול צלחת תחתית זכוכית המכילה את הצמחים תחת אור אדום במשך 5 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה, ולאחר מכן תחת אור לבן במשך 1-2 ימים לפני להיות נתון הדמיה time-lapse כל יום עד 3 ימים. עבור WT, טרום גידול הצמחים באור אדום חלש (0.5 μmol m-2 s-1) מלעיל במשך 5 ימים כדי לגרום לתגובה פוטוטרופית של הפרוטונמטה, כך שהצמחים יכולים להתחבר לתחתית הכלים11.
    הערה: האור האדום החלש מסופק על ידי העברת אור לבן דרך מסנן פלסטיק אקרילי אדום בעובי 3 מ"מ לתוך קופסאות חסינות אור. עבור מוטנטים של ggb, גידול באור אדום הוא אופציונלי, מכיוון שלמוטנטים של ggb אין תגובה פוטוטרופית3.

2. הדמיה ושחזור תלת מימד

  1. הניחו את צלחת תחתית הזכוכית המכילה צמחים על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, כאשר תחתית הזכוכית פונה למטרה. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי להדמיה של calcofluor עם עדשה אובייקטיבית 20x. צלם תמונות עם לייזר של 405 ננומטר, חור הסיכה ב- 1.0, רווח HV ב- 100, כוונון רקע היסט ב- 0, עוצמת לייזר ב- 5%-7%, גודל סריקה של 1,024 x 1,024 ומהירות סריקה של 1/2 מסגרת לשנייה. אסוף 17-30 מקטעים אופטיים מסדרה z בגודל צעד של 1.0 מיקרומטר. תן שם לתמונות באמצעות הקוד בשלב 1.6, כגון "b6_upper_left-day0", ושמור.
    1. בחר את ערוץ DAPI ברכישה וסמן את התיבה Z ב- ND Acquisition. כדי להגדיר את הגבול התחתון והעליון עבור ערימת Z, לחץ על הלחצנים העליון והתחתון.
  2. לבנייה מחדש של התמונות התלת-ממדיות, פתחו את קובץ ה-nd2 (איור 3A; ראו טבלת חומרים) ולחצו על אמצעי האחסון (איור 3B).

3. הדמיה של אותם צמחים בנקודות זמן שונות

  1. לאחר כל הדמיה, החזירו את צלחת בסיס הזכוכית לתא הצמיחה.
  2. חזור על הפעולה משלב 2.1 עבור הדמיה ושחזור תלת-ממדי.
    הערה: כדי למצוא את אותם צמחים, השתמש בקוד המוזכר בשלב 1.6 ותן את השם "b6_upper_left-day1", או "b6_upper_left-day2", בהתאם לגיל הצמחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו מאפשרת תצפית על דינמיקה של דופן התא במהלך ההתפתחות במוטנטים מסוג בר ומוטציות ggb (איור 1). התוצאות הראו שאזורים עם פחות עיבוי של דופן התא מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות של התא, מה שמאפשר חיזוי של אתרי התפשטות/הסתעפות בסוג הבר (איור 1A). פני השטח של דפנות התא במוטנטים של ggb נקרעו לגזרים במהלך ההתפתחות עקב התפשטות בלתי מבוקרת של תאים3 (איור 1B). יתר על כן, אות הצביעה של פני השטח השב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שחזור תלת-ממדי בהילוך מהיר, או הדמיה 4-D, הוא כלי רב עוצמה לצפייה בדינמיקה של המורפולוגיה התאית במהלך תהליכים התפתחותיים. בפרוטוקול זה, על ידי ערבוב הקלקופלור הלבן בתווך, ניתן לראות את הדינמיקה של המורפולוגיה התאית התלת-ממדית בטחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ראינו כי פני השטח של דפנות התא במוטציות ggb נקרעים לגזרים במהלך התפתחות3. יתר על כן, העיבוי המופחת של דפנות התא מתואם עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות התא בסוג פראי, מה שמאפשר חיזוי של אתרי ההתפשטות/הסתעפות. יתר על כן, מכיוון שניתן ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים או כלכליים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר סוסי פטרישיה ובטי נון מאוניברסיטת לואיוויל על הסיוע במיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (1456884 ל- M.P.R.) ועל ידי הסכם שיתוף פעולה של הקרן הלאומית למדע (1849213 ל- M.P.R).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסנן אור פלסטיק אדום בעובי 3 מ"מ  מיצובישי  מס' 102
צלחת בסיס זכוכית בקוטר 27 מ"מ איוואקי3930-035
אגר  סיגמאA6924
Calcofluor לבן   סיגמא18909-100ML-FCalcofluor לבן M2R, 1 גרם/ליטר וכחול אוונס, 0.5 גרם/ליטר
מיקרוסקופ קונפוקלי ניקון תוכנת אלמנטים A1

NIS; קובץ .nd2 במציג NIS-elements, להורדה מ-https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניקון TE200 מצויד במצלמת DS-U3;
מסטיק גלן Nacali Tesque12389-96
תאי גידול צמחיםSANYO Sanyo MLR-350H
מזרק מעוקר 0.22 μ מסנן mMilliporeSLGV033RS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116(2022).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Calcofluor StainingFluorescence Microscopy3D ImagingCell ExpansionCell Wall IntegrityPlant Cell WallProtonemata Separation

מאמרים קשורים