כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט להדמיה של הדינמיקה התלת-ממדית של דופן התא ברקמת טחב חי, המאפשר הדמיה של ניתוק דפנות התא במוטנטים מסוג ggb ועיבוי דפוסי דופן התא בסוג הבר במהלך ההתפתחות לאורך תקופה ארוכה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של דינמיקה של דופן התא באמצעות calcofluor ב-Moss Physcomitrium patens
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה בהילוך מהיר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרת התבוננות בשינויים הדינמיים של גדילה והתפתחות ברמה התאית והתת-תאית. באופן כללי, עבור תצפיות על פני תקופה ארוכה, הטכניקה דורשת טרנספורמציה של חלבון פלואורסצנטי; עם זאת, עבור רוב המערכות, טרנספורמציה גנטית גוזלת זמן או אינה זמינה מבחינה טכנית. כתב יד זה מציג פרוטוקול להדמיית קיטוע זמן תלת-ממדי של דינמיקת דופן התא במשך 3 ימים באמצעות צבע קלקופלור (המכתים תאית בדופן תא הצמח), שפותח בפטנס פיסקומיטריום טחב. אות צבע הקלקופלור מדופן התא יציב ויכול להימשך שבוע ללא ריקבון ברור. באמצעות שיטה זו, הוכח כי ניתוק התאים במוטציות ggb (שבו תת-היחידה בטא geranylgeranyltransferase-I הוא דפק החוצה) נגרמת על ידי התרחבות תאים בלתי מבוקרת פגמים שלמות דופן התא. יתר על כן, דפוסי צביעת calcofluor להשתנות עם הזמן; אזורים מוכתמים פחות בעוצמה מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות העתידיים של התאים בסוג הבר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מערכות רבות אחרות המכילות קירות התא וכי יכול להיות מוכתם על ידי calcofluor.
מבוא
דפנות תאי הצמח עוברות שינויים דינמיים במהלך התרחבות התאים והתפתחותם 1,2,3. שמירה על שלמות דופן התא היא קריטית להידבקות תאי צמח במהלך גדילה והתפתחות, כמו גם לתגובה לאותות סביבתיים. למרות שהדמיית דינמיקה של דופן התא של תאים חיים לאורך תקופת זמן ארוכה היא קריטית להבנת האופן שבו הידבקות התא נשמרת במהלך הפיתוח והסתגלות לשינויים סביבתיים, השיטות הנוכחיות לצפייה ישירה בדינמיקה של דופן התא עדיין מאתגרות.
הדמיה בהילוך מהיר של שינויים תאיים יכולה לספק דינמיקה התפתחותית אינפורמטיבית של אורגניזם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימת החומרים והציוד ובטבלה 1 לקבלת רשימת הפתרונות שישמשו בפרוטוקול זה.
1. הכנת צמחים לכלים תחתונים מזכוכית
- לגדל את הרקמה פרוטונמלית טחב בתווך אגר BCDAT בצלחת פטרי 13 ס"מ תחת אור לבן קבוע (~ 50 μmol m-2 s-1) במשך 7 ימים ב 25 ° C בתא הצמיחה.
- יש לסנן-לעקר את הקלקופלור בלבן ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. מגיב יציב במשך מספר חודשים.
- פזרו את רקמת הטחב בת 7 הימים לתוך מיקרו-צינורית בנפח 1.5 מ"ל המכילה 20 מיקרוליטר מים מעוקרים. ודא שרקמת הטחב פרוטונמלית מפוזרת מספיק כחתיכות קטנות במים. עבור סוג פראי (WT), השתמש ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטה זו מאפשרת תצפית על דינמיקה של דופן התא במהלך ההתפתחות במוטנטים מסוג בר ומוטציות ggb (איור 1). התוצאות הראו שאזורים עם פחות עיבוי של דופן התא מתואמים עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות של התא, מה שמאפשר חיזוי של אתרי התפשטות/הסתעפות בסוג הבר (איור 1A). פני השטח של דפנות התא במוטנטים של ggb נקרעו לגזרים במהלך ההתפתחות עקב התפשטות בלתי מבוקרת של תאים3 (איור 1B). יתר על כן, אות הצביעה של פני השטח השב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שחזור תלת-ממדי בהילוך מהיר, או הדמיה 4-D, הוא כלי רב עוצמה לצפייה בדינמיקה של המורפולוגיה התאית במהלך תהליכים התפתחותיים. בפרוטוקול זה, על ידי ערבוב הקלקופלור הלבן בתווך, ניתן לראות את הדינמיקה של המורפולוגיה התאית התלת-ממדית בטחב P. patens. באמצעות שיטה זו, ראינו כי פני השטח של דפנות התא במוטציות ggb נקרעים לגזרים במהלך התפתחות3. יתר על כן, העיבוי המופחת של דפנות התא מתואם עם אתרי ההתפשטות/הסתעפות התא בסוג פראי, מה שמאפשר חיזוי של אתרי ההתפשטות/הסתעפות. יתר על כן, מכיוון שניתן ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים או כלכליים.
תודות
המחברים מודים לד"ר סוסי פטרישיה ובטי נון מאוניברסיטת לואיוויל על הסיוע במיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (1456884 ל- M.P.R.) ועל ידי הסכם שיתוף פעולה של הקרן הלאומית למדע (1849213 ל- M.P.R).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מסנן אור פלסטיק אדום בעובי 3 מ"מ | מיצובישי | מס' 102 | |
| צלחת בסיס זכוכית בקוטר 27 מ"מ | איוואקי | 3930-035 | |
| אגר | סיגמא | A6924 | |
| Calcofluor לבן | סיגמא | 18909-100ML-F | Calcofluor לבן M2R, 1 גרם/ליטר וכחול אוונס, 0.5 גרם/ליטר |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | ניקון | תוכנת אלמנטים A1 | NIS; קובץ .nd2 במציג NIS-elements, להורדה מ-https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | ניקון | TE200 | מצויד במצלמת DS-U3; |
| מסטיק גלן | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| תאי גידול צמחים | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| מזרק מעוקר 0.22 μ מסנן m | Millipore | SLGV033RS |
מקורות
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant d....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
