הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/64686

⸱

10 בפברואר 2023

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2Department of Nutritional Sciences, The University of Texas at Austin

במאמר זה

סיכום

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

תקציר

הופעתן של טכנולוגיות נוקלאז CRISPR-Cas ממוקדות חוללה מהפכה ביכולת לבצע עריכת גנום מדויקת במערכות מודל מבוססות ומתפתחות כאחד. מערכות עריכת הגנום של CRISPR-Cas משתמשות ב-RNA מנחה סינתטי (sgRNA) כדי לכוון אנדונוקלאז הקשור לקריספר (Cas) ל-DNA loci גנומי ספציפי, שבו אנדונוקלאז Cas יוצר שבר דו-גדילי. תיקון שברים דו-גדיליים על ידי מנגנונים המועדים לטעויות מהותיות מוביל להחדרות ו/או מחיקות, המשבשות את הלוקוס. לחלופין, הכללתם של תורמי DNA דו-גדיליים או אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים של DNA בתהליך זה יכולה לעורר הכללת עריכות גנום מדויקות החל מפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים ועד תגים אימונולוגיים קטנים או אפילו מבנים חלבוניים פלואורסצנטיים גדולים. עם זאת, צוואר בקבוק משמעותי בהליך זה יכול להיות מציאת ובידוד העריכה הרצויה בקו הנבט. פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון ובידוד מוטציות של תאי נבט במוקדים ספציפיים בדגי זברה ( Danio rerio ); עם זאת, עקרונות אלה עשויים להיות ניתנים להתאמה בכל מודל שבו איסוף זרע in vivo אפשרי.

מבוא

מערכת CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas היא כלי רב עוצמה לביצוע מוטגנזה ספציפית ללוקי ועריכת גנום מדויקת במערכת מודל Danio rerio (דג זברה) 1,2,3,4. Cas-ribonucleoprotein (RNP) מורכב משני מרכיבים עיקריים: Cas endonuclease (בדרך כלל Cas9 או Cas12a) ו- RNA מדריך סינתטי ספציפי ללוקוס (sgRNA)5. יחד, Cas-RNP יוצר שבר דו-גדילי (DSB) במיקום הרצוי שניתן לתקן על ידי אחד משני מנגנוני תיקון פנימיים. מנגנון התיקון הלא הומולוגי של הצטרפות הקצה (NHEJ) מועד לשגיאות ולעתים קרובות גורם למגוון של הוספות או מחיקות (indels) סביב DSB. אינדלים אלה יכולים להיות מזיקים אם הם מציגים מוטציה frameshift או עצירה מוקדמת ברצף החלבונים המתקבל. לחלופין, מנגנון התיקון מונחה הומולוגיה (HDR) משתמש בתבנית תורם עם אזורי הומולוגיה המקיפים את אתר DSB כדי לתקן את הנזק. חוקרים יכולים לנצל את מערכת HDR כדי ליצור עריכות גנומיות מדויקות. באופן ספציפי, הם יכולים להזריק במשותף מבנה תורם DNA דו-גדילי המכיל את העריכות הרצויות, כמו גם אזורים של הומולוגיה הצמודים לאתר DSB בגנום. הגידול בכלכלת הגודל של רכיבי CRISPR המיוצרים באופן מסחרי צמצם מאוד את המחסומים לסינון אתרים מרובים ולהקמת מאמצים בקנה מידה גדול יותר לעריכה מדויקת של הגנום. עם זאת, במודלים של בעלי חיים המתרבים מינית, צוואר בקבוק עיקרי הוא זיהוי ובידוד של בעלי חיים מוטנטיים יציבי נבט.

מערכת מודל דגי הזברה מציגה מספר תכונות מפתח המשפרות את השימוש בה במחקרים גנטיים הפוכים. קל לגדל אותם במספרים גדולים עם ציוד דיור ימי בסיסי, והנקבות מפגינות פריון גבוה כל השנה6. יתר על כן, הטלת הביצים וההפריה החיצונית שלהם הופכות אותם למקובלים למיקרו-הזרקה של רכיבי CRISPR/Cas. ה- Cas-RNP מוזרק בדרך כלל לעוברים של דגי זברה בשלב חד תאי כדי ליצור DSBs/תיקון שהוא, בתיאוריה, בירושה על ידי כל תאי הבת. עם זאת, גנומים דיפלואידים דורשים שני אירועי DSB/תיקון כדי לבצע מוטגניזציה של שני הכרומוזומים ההומולוגיים. יתר על כן, למרות ש- Cas-RNP מוזרק בשלב התא האחד, ה- DSB/תיקון עשוי להתרחש רק בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. יחד, גורמים אלה תורמים לאופי הפסיפס של דגים המוזרקים F0. נוהג נפוץ הוא לחצות דגים המוזרקים F0 ולסנן את צאצאי F1 עבור indels / עריכות ספציפיות. עם זאת, מכיוון שלא לכל הדגים המוזרקים F0 יש מוטציות בקו הנבט, נוהג זה גורם להצלבות לא פרודוקטיביות רבות שאינן מייצרות את העריכה הרצויה. סינון הרקמה הסומטית F0 במקום F1 מגדיל את ההסתברות לבידוד מערך הנבט הרצוי ומקטין את מספר בעלי החיים הדרושים בתהליך זה.

ניתן לאסוף זרע בקלות מדגי זברה המוזרקים F0 ללא צורך בהמתת חסד. תכונה זו מאפשרת שימור בהקפאה וגזירה מחדש של מלאי זרע קפוא7 אך ניתן גם לנצל אותה כדי לסנן, לזהות ולבודד במהירות את נשאי הנבט של מוטציות גנומיות רצויות 8,9. Brocal et al. (2016) תיארו בעבר שיטה מבוססת ריצוף לסינון עריכות קו הנבט בדגי זברה זכרים בהזרקת F010. למרות שהיא שימושית לזיהוי האללים המוטנטים הנמצאים בקו הנבט, גישה זו עלולה להיות יקרה בתפוקה גבוהה וייתכן שלא תהיה נגישה לכל המעבדות. לעומת זאת, הפרוטוקול הנוכחי מציע אסטרטגיה נגישה וחסכונית מבוססת אלקטרופורזה לזיהוי עריכות קו הנבט. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון ובידוד מוטציות של קו הנבט באתרים ספציפיים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז ברזולוציה גבוהה. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה דומה לזיהוי שילוב מוצלח של מבנה תורם המכיל עריכות ספציפיות. כמו תמיד, אם יש צורך בעריכות ספציפיות, ניתן לבצע אסטרטגיות מבוססות רצף במקביל לפרוטוקול המתואר להלן. למרות שפרוטוקול זה הוא ספציפי למערכת מודל דגי הזברה, עקרונות אלה צריכים להיות ניתנים להתאמה לכל מודל שבו איסוף הזרע הוא הליך שגרתי. יחד, אסטרטגיות אלה יאפשרו זיהוי של זכרים עם הזרקת F0 עם indels/edits germline שניתן לפתור על ג'ל לאחר תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית (PCR) ו / או הגבלת digest.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת טקסס בוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוסטין (AUP-2021-00254).

1. תכנון sgRNA עבור מוטגנזה של קריספר

  1. השג את רצף האקסון המכיל את loci היעד.
  2. תכנן רנ"א מנחה סינתטי (sgRNA) עם אתר מוטיב סמוך פרוטוספייסר (PAM) הספציפי לאנדונוקלאז Cas.
    1. אם אתם מזריקים במשותף מבנה תורם, תכננו את ה-sgRNA כך שיהיה לו אתר חיתוך חזוי קרוב ככל האפשר לעריכות הרצויות.
      הערה: APE היא תוכנה חופשית עם כלי למציאת אתרי Cas9 sgRNA11. לחלופין, ניתן להשתמש בכלים כגון CHOPCHOP, המציע ממשק מקוון לתכנון sgRNA המתחשב באתרי PAM השונים של Cas9 ואנדונוקלאזות Cas אחרות12.
  3. עצבו פריימרים קדימה ואחורה כדי להגביר את האזור שמסביב לאתר חיתוך CRISPR/Cas מעוצב. מוצר ה-PCR צריך להיות באורך של כ-200-400 זוגות בסיסים (bp) כדי להיות מסוגל לפתור אינדל קטן על ג'ל בהמשך הפרוטוקול.
    הערה: CHOPCHOP11 מעצב פריימרים באופן אוטומטי עבור כל sgRNA שהוא מפיק.
  4. אופציונלי: תכנון מבנה תורם DNA עם העריכות הרצויות.
    1. קבל את הרצף הגנומי של האקסון המכיל את המוקדים של המוטציה הרצויה.
      הערה: רצפים אינטרוניים יכולים להשתנות בין אנשים, ולכן עדיף להימנע מהכללת רצפים אינטרוניים במבנה התורם מכיוון שהדבר עלול להפריע למסלול התיקון התלוי בהומולוגיה.
    2. אם רוצים שינוי מסוים בחומצת האמינו, שנו את הקודון הספציפי בהתאם.
      הערה: בעת ביצוע שינויים אלה, שים לב לתדירות הקודון. במידת האפשר, בחר קודון עם שימוש גבוה.
    3. כדי למנוע עיכול CRISPR/Cas של מבנה התורם, צור מוטציות נרדפות נוספות אשר (i) משבשות את ה- PAM ו / או (ii) משבשות את רצף sgRNA, עם עדיפות גבוהה יותר לביצוע שינויים לא נרדפים קרוב יותר לאתר ה- PAM.
    4. השתמש במאתר אתרי הגבלה (APE11 כולל גם תכונה זו) כדי למצוא אתרי הגבלה ייחודיים (אלה שמתרחשים רק פעם אחת) במכפלת ה- PCR החזויה של הרצף מסוג wild.
      1. חזור על תהליך זה עבור מוצר ה- PCR החזוי המשקף את השילוב המוצלח של מבנה התורם.
      2. השווה את רשימת אתרי ההגבלה בין הרצפים המשולבים בטבע לבין הרצפים המשולבים על ידי תורמים כדי למצוא אתר הגבלה שנמצא רק ברצף הערוך.
      3. אם לא נמצא אתר הגבלה ייחודי, המשך לבצע שינויים נרדפים במבנה התורם עד להשגת מטרה זו.
        הערה: במידת האפשר, המשך ליצור מוטציות נרדפות שישבשו את קשירת sgRNA למבנה התורם.
    5. חתוך את רצף התורמים לגודל הניתן לניהול (50-100 bp) עם לפחות 20 bp של הומולוגיה סביב אתר חיתוך CRISPR/Cas החזוי ועריכות, במידת האפשר.
  5. השג את האוליגונוקלאוטידים המתוכננים של sgRNA ו/או תורם DNA, כמו גם כל פריימר הדרוש לגנוטיפ.
    הערה: כדי למנוע עיכול של אוליגונוקלאוטידים מתורם DNA על ידי נוקלאזות, מומלץ לשנות את שלושת קשרי הפוספט הראשונים בקצוות 5' ו-3' של אוליגונוקלאוטידים של DNA עם זרחן.
  6. יש להזריק 1 nL מתערובת ההזרקה לעוברים בשלב חד-תאי. בדרך כלל, תערובת הזרקה סטנדרטית מכילה את הדברים הבאים:
    1 μL של 25 μM sgRNA ספציפי ללוקוס
    1 μL של 25 מיקרומטר Cas9 אנדונוקלאז
    אופציונלי: 1 μL של 3 מיקרומטר DNA מבנה תורם
    1. הביאו את הנפח הכולל ל-5 מיקרוליטר עם KCl נטול RNase בנפח 0.1 M.
  7. לאפשר לאנשים המוזרקים F0 להתפתח למבוגרים בוגרים מינית. שאר הפרוטוקול מתמקד בסינון הזכרים שהזריקו F0 לעריכות קו הנבט.

2. הקמת מיכלי הגידול

  1. זכרי F0 ראשוניים להזדווגות על ידי הקמת מיכלי רבייה עם מחיצות בין זכרי F0 לנקבות.
    1. כדי למזער את מספר מכלי הרבייה הדרושים, הציבו שלושה זכרים מול שתי נקבות בכל טנק.
      1. הגדר כמה שיותר זכרי F0 שניתן לבדוק ביעילות ולשכן כפרטים לאחר איסוף זרע. הגנוטיפ של הנקבות אינו חשוב מכיוון שהגמטות שלהן לא ייאספו במהלך הליך זה.
    2. הקימו מיכל רבייה אחד של זכרים פראיים מול הנקבות. זרע מסוג פרא ישמש כבקרה לפענוח התוצאות בהמשך ההליך.
  2. לדגור על מיכלי הרבייה המוכנים למשך הלילה.

3. הכנת החומרים להליך איסוף הזרע

  1. הכינו מספיק תמיסת הרדמה (0.016% טריקאין-HCl במי דגים) כדי למלא קערת זכוכית קטנה.
  2. יש להוציא 40 μL של 50 mM NaOH לתוך צינורות PCR של 0.2 מ"ל. הכינו צינורית אחת לכל דגימת זרע שתיאסף. יש לאחסן על קרח.
  3. הכינו מיכלי 0.8 ליטר נפרדים לכל דג שיידגמו במהלך ההליך. מכלים אלה יאחסנו את הדגים שנדגמו עד להשלמת הגנוטיפ.
    הערה: זהו הגורם העיקרי המגביל את מספר הדגים שניתן לסנן ביעילות בפרוטוקול זה. להבטיח מקום מספיק לשיכון הפרטים שנדגמו עד להשלמת הגנוטיפ.
  4. יש להרטיב ספוג בגודל 1 אינץ' על 1 אינץ' (לחתוך עם דיווט רדוד בצורת אליפסה כדי להחזיק את הצד הגחוני של דג זברה זכר למעלה במהלך ההליך) במי דגים ולסחוט את עודפי הנוזלים.
    1. מקמו את הספוג בשדה הראייה של סטריאומיקרוסקופ בהגדלה נמוכה (איור 1A).
    2. מקם תאורה עילית אלכסונית לצפייה אופטימלית.

4. הרדמת הדג הזכר ואיסוף הזרע

  1. הכינו צינור נימי נקי.
    1. נערו בעדינות את מיכל הצינור כדי לשחרר צינור נימי יחיד.
    2. מניחים את צינור הנימים לתוך הנורה שסופקה, ומניחים אותו בצד.
  2. מעבירים דג זכר לתמיסת הרדמה מוכנה (0.016% טריקאין-HCl במי דגים).
    1. ערבבו בעדינות את התמיסה עם כף מחורצת כדי לזרז את תהליך ההרדמה.
    2. לאחר שתנועת האופרקולום (זמיר) מאטה (כ-1-2 דקות), המשיכו באיסוף הזרע.
  3. השתמשו בכף המחורצת כדי להעביר את הדג לערימה נקייה של מגבות נייר.
    1. השתמשו בכף המחורצת כדי לגלגל בעדינות את הדג כדי להסיר עודפי מים.
    2. הכתימו בעדינות את הדג בנייר טישו נקי ומקופל כדי להסיר את שאריות המים.
  4. השתמשו בכף המחוררת כדי להעביר את הדג לספוג המוכן (איור 1B).
    1. מקם את הצד הגחוני של הדג כלפי מעלה כשראשו קרוב ליד הדומיננטית של האדם המבצע את ההליך.
    2. כתם בעדינות את האזור סביב סנפירי פי הטבעת עם נייר טישו נקי ומקופל.
  5. לאסוף את הזרע.
    1. בעזרת קצה צינור הנימים, הזיזו בעדינות את סנפירי האגן לרוחב מקו האמצע כדי לחשוף את הקלואקה (איור 1C).
    2. מקם את קצה צינור הנימים ליד cloaca.
    3. בעזרת המלקחיים, סחטו בעדינות את דפנות הדג שמתחיל ממש מתחת לזימים ומסתיים בקלואקה (איור 1C).
    4. לאסוף זרע לתוך צינור נימי על ידי פעולה נימית. בערך 1 μL מספיק עבור הליך זה (איור 1D).
      הערה: מעבדות מסוימות מדווחות על שימוש בקצוות פיפט p10 במקום צינורות נימים לאיסוף זרע.
    5. אם הזרע אינו משתחרר בלחץ עדין, יש להחזיר את הדג למי המערכת.
      1. יש לעקוב אחר ההתאוששות מההרדמה.
      2. אין לסחוט את הדג קשה כדי לגרש זרע, כמו זה יכול לפצוע את הדג.
      3. הניחו את הדג במשך שבועיים לפני שתנסו לאסוף זרע שוב.
    6. לאחר האיסוף, הכניסו את הדגים למיכל בידוד נקי עם מי מערכת לדיור אישי.
      1. עקוב אחר הדג להתאוששות מההרדמה.
      2. הניחו את הדג במשך שבועיים לפני שתנסו לאסוף זרע שוב.
    7. מניחים את הצינור הנימי עם הזרע שנאסף לתוך צינור PCR מוכן (עם 40 μL של 50 mM NaOH).
    8. סחטו את נורת הגומי כדי לגרש את הדגימה שנאספת.
    9. יש להשליך את צינור הנימים המשומש למיכל פסולת זכוכית מאושר.
    10. דוגרים על הדגימות על קרח עד שכל הזכרים נסחטים.
  6. חזור על שלבים 4.1-4.5 עבור כל זכר בודד.
  7. תייגו את מיכלי הבידוד ואת דגימות הזרע כך שניתן יהיה לייחס את תוצאות הגנוטיפ הסופיות של הזרע לאדם המתאים עם מוטציות משוערות.
  8. עקוב אחר כל האנשים, וודא שהם זקופים ובוחנים את הטנקים שלהם לפני שתחזיר את הטנקים למערכת.
  9. החזירו את הנקבות המשמשות להכנה חזרה למכלים שלהן במערכת.
  10. אם דג כלשהו אינו מתאושש מההרדמה לאחר 10 דקות, בצע את הליך המתת חסד שאושר על ידי המוסד המשויך למעבדה.
    1. דוגמה: קירור מהיר של האדם באמבט קרח עם מי דגים שהם 2-4 מעלות צלזיוס.
    2. יש להשליך את הדגים המורדמים במיכל פסולת מתאים של פגרי בעלי חיים בהתאם לנוהל שאושר על ידי המוסד הקשור למעבדה.

5. מיצוי DNA מדגימות הזרע

  1. סובבו בקצרה את כל דגימות הזרע במיניצנטריפוגה, והכניסו צינורות PCR למחזור תרמי.
  2. סגור את המכסה של מחזור תרמי.
  3. הפעל את ההגדרות הבאות במחזור התרמי:
    1. חממו את הדגימות במשך 40 דקות בטמפרטורה של 95°C.
    2. מצננים את הדגימות ל-25°C.
  4. הסר את הדגימות מהמחזור התרמי.
  5. עם קצה פיפטה נקי לכל דגימה, נטרלו את ה- pH על ידי הוספת 10 μL של 1 M Tris-HCl (חוצץ ל- pH 8).
  6. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  7. סובבו בקצרה את הדגימות במיניצנטריפוגה.
  8. דגימות DNA גנומיות ניתן לאחסן במשך מספר ימים ב 4 ° C או להציב ב -20 ° C עד 6 חודשים.

6. הגברה PCR (ו/או תקציר הגבלה) של הלוקוס הרצוי

  1. הגבירו את הלוקוס הרצוי באמצעות פרוטוקול PCR סטנדרטי.
    1. חממו מראש את המחזור התרמי לטמפרטורת הדנטורציה הראשונית בתגובת ה-PCR למטה.
    2. הכינו תערובת תגובה של 25 μL לכל דגימת זרע בצינורות PCR:
      12.5 μL של 2x Taq Polymerase Master Mix
      1.5 μL של פריימר קדמי 10 μM
      1.5 μL של פריימר הפוך 10 מיקרומטר
      4.5 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז
      5 μL של דגימת DNA זרע מנוטרלת
    3. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    4. סובבו בקצרה את הדגימות במיניצנטריפוגה.
    5. מקם את הדגימות במחזור תרמי שחומם מראש עם ההגדרות הבאות:
      דנטורציה ראשונית: 95 °C למשך 3 דקות
      35 מחזורים של דנטורציה (95 ° C עבור 30 שניות), חישול (55 ° C עבור 30 שניות), והרחבה (72 ° C עבור 30 שניות)
      הארכה סופית: 72°C למשך 5 דקות
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את טמפרטורת ההרחבה ו / או הזמן בהתאם לפולימראז Taq הספציפי והאורך הצפוי של מוצר הגברה PCR.
    6. הסר את דגימות ה- PCR מהמחזור התרמי.
  2. אופציונלי: בצע את תקציר ההגבלה הספציפי לתורם על נפח קטן של מוצר ה- PCR, תוך השארת לפחות 5-10 מיקרוליטר של מוצר PCR לא מעוכל לאלקטרופורזה בג'ל.
    1. הכן תגובה של 30 μL בצינורות PCR של 0.2 מ"ל:
      10 μL של מוצר PCR לא מטוהר
      15 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז
      3 μL של מאגר אנזים הגבלה פי 10
      2 μL של אנזים הגבלה (BstNI משמש בתוצאות המייצגות לניתוח אלל הנוק-אין DNAH10 )
      הערה: אנזימי הגבלה רבים עדיין פעילים במאגר תגובת PCR טיפוסי; עם זאת, הוספת מאגר Restriction Digest יכולה לעזור לשפר את התוצאות. עיין בהוראות יצרן ספציפיות לפתרון בעיות במקרה של בעיות.
    2. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
    3. סובבו בקצרה את הדגימות במיניצנטריפוגה.
    4. מקם את הדגימות במחזור תרמי עם ההגדרות הבאות:
      1. חתכו את אמפליקון ה-PCR ב-60°C למשך שעה אחת.
        הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את טמפרטורת החיתוך ואת זמן הדגירה לאנזים ההגבלה הספציפי הנמצא בשימוש.
      2. השבת את אנזים ההגבלה עם הטמפרטורה וזמן הדגירה הנדרשים, אם צוין על ידי היצרן.
        הערה: האנזים BstNI אינו דורש השבתת חום.

7. ביצוע אלקטרופורזה בג'ל להפרדת אמפליקונים PCR בגדלים שונים

  1. הכן 500 מ"ל של חיץ ריצה TBE 0.5x: הוסף 50 מ"ל של תרכיז חיץ TBE 10x ל- 450 מ"ל מים נטולי יונים.
  2. הכינו 100 מ"ל של 4% ג'ל אגרוז במאגר ריצה של 0.5x TBE: הוסיפו 4 גרם אגרוז עם 10 מיקרוליטר של כתם ג'ל 10,000x ל-100 מ"ל של מאגר ריצה TBE 0.5x. יש לחמם במיקרוגל עד להמסה מלאה של אבקת האגרוז.
    1. יוצקים את תמיסת הג'ל למסגרת יציקת ג'ל בגודל מתאים, ומכניסים את המסרק בצד אחד של הג'ל.
      הערה: גודל ג'ל גדול יותר (מומלץ: 15 ס"מ x 15 ס"מ) הוא יתרון עבור הליך זה, כפי שהוא מספק את amplicons עם יותר מקום לפתור על הג'ל.
      1. אם יש לנתח מוצר תקציר הגבלה, עדיף להפעיל אותו על אותו ג'ל כמו מוצר PCR, כך שניתן יהיה להשוות את התוצאות. התאימו את גודל המסרק לפי הצורך כך שיתאים לכל הדגימות שעל הג'ל.
    2. השאירו את הג'ל בטמפרטורת החדר עד להתייצבות. הסר בזהירות את המסרק. בזהירות להסיר את הג'ל ממסגרת הליהוק.
  3. הגדר את מתקן אלקטרופורזה ג'ל.
    1. מקמו את הג'ל במתקן האלקטרופורזה כך שהבארות יהיו הקרובות ביותר לאלקטרודה השלילית. יוצקים חיץ ריצה של 0.5x TBE לתוך אסדת האלקטרופורזה עד שהבארות שקועות במלואן.
  4. טוענים את הג'ל.
    1. טען 5 μL של סולם DNA לתוך הבאר הראשונה (בחר סולם DNA המכיל מקטעי DNA הדומים בגודלם למגבר PCR).
    2. באמצעות קצה פיפטה חדש עבור כל דגימה (כולל דגימת הבקרה מסוג Wild), לטעון 5-10 μL של מוצר PCR לתוך הבארות הנותרות.
    3. אופציונלי: אם רוצים לנתח מוצר לעיכול הגבלה, יש להעמיס את הדגימות גם על הג'ל.
      הערה: עדיף לטעון כמויות שוות של DNA בין PCR לבין מוצר העיכול הגבלה. לדוגמה, בתערובת תגובת ההגבלה של 30 μL, נוסף 10 μL של מוצר PCR. לכן, ריכוז הדנ"א של 15 μL של מוצר העיכול היה דומה ל 5 μL של מוצר PCR לא מטוהר.
  5. הפעל את הג'ל.
    1. חבר את האלקטרודות למתקן אלקטרופורזה ג'ל, והפעל 150 V למשך שעה לפחות כדי להבטיח הפרדה נאותה של האמליקונים.
    2. דמיינו את הג'ל כדי להציג את רצועות הדנ"א.
      הערה: אתרים ממוקדי קריספר בעלי מוטגן חזק יפעלו כגדלים מרובים של רצועות המייצגות שילוב של אללי החדרה/מחיקה עם האמפליקונים מסוג Wild.
      1. אם רצועות הג'ל אינן נפתרות לאחר שעה אחת, יש למרוח 150 וולט על הג'ל למשך 15 דקות עד שהרצועות מופרדות מספיק על הג'ל.
      2. אופציונלי: אם בודקים להחדרת עריכה מדויקת כגון SNP, תג אפיטופ או תג פלואורסצנטי, סנן את DNA הזרע בשיטות PCR ספציפיות לעריכה הרצויה. לדוגמה, בעת זיהוי אתר הגבלה ספציפי לתורם, רצועה נוספת תהיה נוכחת במוצר תקציר ההגבלה בהשוואה לתוצר ה- PCR של דגימת הזרע.

8. בידוד אללים יציבים של קו הנבט

  1. לאחר שבועיים של מנוחה מהליך סחיטת הזרע, חצו את הפרטים F0 שהדנ"א הגנומי של הזרע שלהם הכיל את העריכות הרצויות.
    הערה: ייצור זרע משיבוטים בודדים של זרעונים עשוי להיות מחזורי בדגי זברה; לכן, ייתכן שהאלל הרצוי לא מייצר זרע בזמן ההצלבה. מסיבה זו, ייתכן שיהיה צורך לבצע חצייה נוספת יותר מפעם אחת כדי לבודד את האלל המעורב בסינון הראשוני.
  2. לאחר שדגי F1 מוצלבים מגיעים לבגרות מינית, המשיכו בשיטות גנוטיפ סטנדרטיות (לדוגמה, DNA קליפ סנפיר) תוך שימוש באותו פרוטוקול אלקטרופורזה של PCR וג'ל המבוצע במהלך בדיקת הדנ"א הגנומי של הזרע.
    1. Sanger רצף את מוצרי PCR כדי לזהות את האנשים F1 עם אותה עריכה רצויה.
    2. אופציונלי: אם העריכה הרצויה מציגה או משבשת אתר הגבלה, סנן עם פרוטוקול תקציר הגבלות מתאים.
  3. הטרוזיגוטים F1 בהצלבה עם אותה עריכה רצויה.
  4. סנן את צאצאי F2 עבור הפנוטיפ ו/או העריכות הגנומיות הצפויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הגישות הניסיוניות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשרות זיהוי מהיר יותר של עריכות גנום או אללים מזיקים לכאורה על ידי התמקדות בניתוח אלפי גנומים הנגזרים מאוסף הזרע הגברי המוזרק F0. איור 2 מדגיש כיצד לפרש את התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול זה.

כדי ליצור מוטציות בלוקוס p2ry12, הוזרקו לעוברים של דגי זברה בשלב חד-תאי Cas9 אנדונוקלאז ו-sgRNA ספציפי ל-p2ry12 (איור 2B, אור אפור). דגים בהזרקת F0 הוכנסו למערכת עד לבגרות מינית, וזרע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאפיון מהיר של עריכות גנום משוערות או מוטציות ממוקדות באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas על ידי ניתוח ממוקד של גנומי זרע זכריים F0. פרוטוקול זה צריך להיות מקובל על מודלים אחרים של בעלי חיים שבהם הזרע זמין לדגימה ללא המתת חסד. שיטה זו תגדיל את תפוקת הסינון לעריכות רצויות והיא שימושית במיוחד לזיהוי אירועי דפיקה נדירים בתיווך HDR. גישה זו משמשת גם להפחתת מספר חיות הניסוי המשמשות למציאת עריכה יציבה של קו הנבט על ידי הקלה על סינון מהיר של אלפי גנומים פוטנציאליים בדגימת זרע אחת מנשא F0 משוער, בניגוד לגישות מסו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

ברצוננו להודות לאנה הינדס מבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון על מאמציה הראשוניים להשיג DNA גנומי זרע באיכות טובה בשיטת הזריקה החמה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס (R01AR072009 ל- R.S.G).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אבקת אגרוז פישר ביו-ריאגנטיםBP1356-100
מיכלי גידולקרולינה ביולוגית 
161937 BstNI Restriction EnzymeNEBR0168S
Cas9 EndonucleaseIDT1081060
סולם DNA, 100 bp תרמו סיינטיפיק 
dnah10 מבנה תורם   סיגמא-אולדריץDNA אוליגו בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש.
קשר פוספורותיואט על התורם בשלושת קשרי הפוספט הראשונים בשני הקצוות 5' ו-3' (5'-CCTCTCTCTTTCTCAGAAGCTTC
TGCTCATCCGCTGCTCTTGCCT
GGACCGAGTACCGTCGTGCCC
AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 פריימר קדימה Sigma-AldrichDNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT
TTGGC-3')
dnah10 פריימר הפוך Sigma-AldrichDNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA
ATACAGC-3') 
dnah10 sgRNA סינתטי סינתגו sgRNA סינתטי, רצף מטרה: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'ספק
כוח אלקטרופורזהThermo Scientific 105ECA-115
מלקחיים מסנניםMilliporeXX6200006P
Fish (מערכת) מיםגנריתn/a
מערכת אלקטרופורזה ג'ל (כולל מסגרת יציקה, מסרק ותא אלקטרופורזה) תרמו סיינטיפיק ג'ל B2
 Azure BiosystemsAZI200-01
כתם ג'ל, 10000X קערת זכוכית InvitrogenS33102
, 250 מ"ל n/aגנריים
, 0.8 ליטר AquaneeringZT080
צינור נימי Microcap עם נורה, 20 ומיקרו; L Drummond1-000-0020/CA
מיני-צנטריפוגהביו-ראד12011919EDU
מיקרופיפטות, שונות עם טיפים מתאימיםגנרי לא זמין
מיקרוגל גנרי n/a
מים ללא נוקלאזPromegaP119-C
מגבות ניירגנריותn/a
צינורות PCR, 0.2 מ"לBioexpressT-3196-1
כף פלסטיק, עם חורים/חריצים קדוחים גנריn/a
KCl, 0.2 M RNAse FreeSigma-AldrichP9333
p2ry12 קדימה פריימר Sigma-AldrichDNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT
-3')
p2ry12 פריימר הפוךSigma-AldrichDNA Oligo בשפופרת; 0.025 ננומטר, טיהור מלח סטנדרטי, יבש (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT
-3') 
p2ry12 sgRNA סינתטי סינתגו sgRNA סינתטי, רצף מטרה: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Restriction
Enzyme 10X BufferNEBB6003SVIAL
NaOH Solution, 50 mM תרמו סיינטיפיק S318; ספוג 424330010
, חיתוך בגודל 1 אינץ' x 1 אינץ' עם חריץ סגלגל קטןכללי n/a
סטריאומיקרוסקופZeissStemi 508
Taq פולימראז מאסטר מיקס, תרכיז חיץ 2XPromegaM7122
TBE, 10XVWRE442
ThermalCycler Bio-Rad1861096
נייר טישופישר סיינטיפיק06-666
תמיסת טריקאין-מתאן-סולפונאט (Syncaine, MS-222), 0.016% במי דגים (pH 7.0± 0.2) Syndel200-266
Tris Base, 1M (חוצץ עם HCl ל-pH 8.0) פרומגהH5131
FERSM0241' קופסת אור הדמיה מיכלי בידוד פתרון

מקורות

  1. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  2. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  3. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  4. Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
  5. Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
  6. Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
  7. Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
  8. Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
  9. Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
  10. Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259(2016).
  11. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619(2022).
  12. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  13. Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  14. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  15. Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
  16. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  17. Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  18. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

עריכת גנום באמצעות CRISPRעריכות בקו הנבט של דגי זברהסריקת זרעאנזימי הגבלה של PCRאלקטרופורזה בג'להפריה חוץ גופיתנשאי זכר F0זיהוי Indelתרמוסייקלרריצוף DNA
בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.